第五章 目的基因的获取 ppt课件
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目的基因的制备基因文库法ppt课件
组织或细胞染色体DNA 限带的所有基 因组DNA片段的集合.
克隆载体 重组DNA分子
受体菌 含重组分子的转化菌
genomic library
每个细胞含有一个基因组 DNA片段与载体的重组DNA分 子，许多细胞组成一个含有基 因组的色概率基因 该种生物所有基因 应用范围 ◆ 基因原始结构功能的研究 ◆ 对比分析内含子、外显子及调控区域 ◆ /46
逆转录
以单链RNA为模板合成双链DNA的反应。
DNA mRNA
14/46
逆转录病毒细胞内的逆转录现象：
RNA 模板 逆转录酶
RNA酶
DNA-RNA 杂化双链
Байду номын сангаас
单链DNA
双链DNA
逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样具
有遗传物质的传代与表达功能。
15/46
逆转录酶的应用:
应用于基因工程
基因
mRNA 蛋白质多肽链
7/46
2.经验值
Transcription 从cDNA中获得的是经过剪切去除内含子的基因。
ln(1－P)
start codon Plasmid or phage
N=
非翻译区的序列特征对基因的表达具有重要的调控作用，编码序列则是合成基因产物—蛋白质模板。
ln(1－f/g) 某细胞的mRNA分子数为500 000，某个丰度为3500拷贝/细胞的mRNA基因，最小值为500 000/3500=143，丰度为14拷贝/细胞的mRNA
58330
人
3.2×109
320000
1473652
128000
589459
71111
327476
10/46
目的基因.ppt
与RNA聚合酶结合有关 -75区上游有一共有序列GGGCGC (GC框):结合某些转录因子 转录终止区:
（3）其他基因组基因的组成
质粒(无内含子) 、 病毒(重叠基因) 、 线粒体(缺少 SD序列) 、叶绿体(多顺反子) 。
一、目的基因的来源 二、获得目的基因的途径
一、目的基因的来源
目的基因主要来源于各种生物。真核生物染色体基 因组，特别是人和动植物染色体基因组中蕴藏着大 量的基因，是获得目的基因的主要来源。
结构基因的组成
转录启动区、核糖体识别区、编码区(起译码ATG、ORF、休止码TAG或 TAA或TGA)、终止转录区
（1）原核生物基因的组成
基因区：操纵子。基因之间有间隔序列 启动区：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段 SD区：起译码ATG上游约10bp处的富含嘌呤的保守区，其转录物：
5’AGGAGGU3’，核糖体16S rRNA识别、结合mRNA的位置 转录终止子和终止因子：分别指基因或操纵子3’ 端提供转录终止信号的 DNA序列；协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。
原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形成茎环发夹 。
（2）真核生物基因的组成
基因区：ATG + extrons + introns + TAA（TGA或TAG） 转录启动区：r、m、tRNA分别由RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ转录。
编码蛋白的启动子( RNA聚合酶Ⅱ识别)可寻找三个保守区： -20~-30的TATAA/TA区(Hogness框)：解链，决定起录点 -75的9bp共有序列GGT/CCAATCT区(CAAT框)：
（3）应用范围
DNA合成仪
1）合成PCR引物 2）寡核苷酸探针 3）人工接头及较小的基因
（3）其他基因组基因的组成
质粒(无内含子) 、 病毒(重叠基因) 、 线粒体(缺少 SD序列) 、叶绿体(多顺反子) 。
一、目的基因的来源 二、获得目的基因的途径
一、目的基因的来源
目的基因主要来源于各种生物。真核生物染色体基 因组，特别是人和动植物染色体基因组中蕴藏着大 量的基因，是获得目的基因的主要来源。
结构基因的组成
转录启动区、核糖体识别区、编码区(起译码ATG、ORF、休止码TAG或 TAA或TGA)、终止转录区
（1）原核生物基因的组成
基因区：操纵子。基因之间有间隔序列 启动区：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段 SD区：起译码ATG上游约10bp处的富含嘌呤的保守区，其转录物：
5’AGGAGGU3’，核糖体16S rRNA识别、结合mRNA的位置 转录终止子和终止因子：分别指基因或操纵子3’ 端提供转录终止信号的 DNA序列；协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。
原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形成茎环发夹 。
（2）真核生物基因的组成
基因区：ATG + extrons + introns + TAA（TGA或TAG） 转录启动区：r、m、tRNA分别由RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ转录。
编码蛋白的启动子( RNA聚合酶Ⅱ识别)可寻找三个保守区： -20~-30的TATAA/TA区(Hogness框)：解链，决定起录点 -75的9bp共有序列GGT/CCAATCT区(CAAT框)：
（3）应用范围
DNA合成仪
1）合成PCR引物 2）寡核苷酸探针 3）人工接头及较小的基因
《目的基因获取》课件
目的基因获取
目学合成法 • 基因组测序法
01 目的基因获取概述
目的基因获取的定义
目的基因获取是指从生物体内分离出 特定的基因片段，通常是为了进行基 因克隆、表达或功能研究。
目的基因可以是已知序列的基因，也 可以是未知序列的基因，需要通过基 因筛选、PCR扩增等技术手段进 行分离。
编辑技术。02 基因法基因的构建1
基因的构建是目的基因获取的第一步，通常 采用基因克隆技术将所有择适当的载体、酶和引物 等工具，以确保基因片段能够正确质量和完整性。
02
在遗传学研究中，基因组测序可用于鉴定基因突变、遗传疾病关联和 进化机制等。
03
在疾病诊断与治疗中，基因组测序可用于检测致病基因突变、预测疾 病风险和指导个性化治疗。
04
在生物进化研究中，基因组测序可用于比较不同物种间的基因组差异 ，揭示物种进化历程和机制。
THANKS FOR WATCHING
PCR的反应条件
温度
PCR循环包括高温变性（95℃）、低温复性（50-65℃） 和适温延伸（72℃），每个步骤的温度和时间都有严格 要求。
dNTP
PCR需要四种脱氧核糖核苷酸作为原料，它们的浓度和纯 度会影响PCR产物的质量和产量。
引物
设计特异性良好的引物是PCR成功的关键，引物长度、特 异性、浓度等都会影响PCR结果。
01
基因组测序法是一种基于高通量测序技术的基因组 分析方法。
02
它通过将基因组DNA进行片段化、建库、测序和数 据分析，获取基因组的序列信息。
03
基因组测序法的原理基于碱基互补配对原则和测序 技术平台的多重独立测序反应。
基因组测序法的步骤
样本准备
包括基因组DNA提取、片段化、末端修复和质量评估、序列比对和变异 检测等分析，提取目的基因序列。
目学合成法 • 基因组测序法
01 目的基因获取概述
目的基因获取的定义
目的基因获取是指从生物体内分离出 特定的基因片段，通常是为了进行基 因克隆、表达或功能研究。
目的基因可以是已知序列的基因，也 可以是未知序列的基因，需要通过基 因筛选、PCR扩增等技术手段进 行分离。
编辑技术。02 基因法基因的构建1
基因的构建是目的基因获取的第一步，通常 采用基因克隆技术将所有择适当的载体、酶和引物 等工具，以确保基因片段能够正确质量和完整性。
02
在遗传学研究中，基因组测序可用于鉴定基因突变、遗传疾病关联和 进化机制等。
03
在疾病诊断与治疗中，基因组测序可用于检测致病基因突变、预测疾 病风险和指导个性化治疗。
04
在生物进化研究中，基因组测序可用于比较不同物种间的基因组差异 ，揭示物种进化历程和机制。
THANKS FOR WATCHING
PCR的反应条件
温度
PCR循环包括高温变性（95℃）、低温复性（50-65℃） 和适温延伸（72℃），每个步骤的温度和时间都有严格 要求。
dNTP
PCR需要四种脱氧核糖核苷酸作为原料，它们的浓度和纯 度会影响PCR产物的质量和产量。
引物
设计特异性良好的引物是PCR成功的关键，引物长度、特 异性、浓度等都会影响PCR结果。
01
基因组测序法是一种基于高通量测序技术的基因组 分析方法。
02
它通过将基因组DNA进行片段化、建库、测序和数 据分析，获取基因组的序列信息。
03
基因组测序法的原理基于碱基互补配对原则和测序 技术平台的多重独立测序反应。
基因组测序法的步骤
样本准备
包括基因组DNA提取、片段化、末端修复和质量评估、序列比对和变异 检测等分析，提取目的基因序列。
高中生物课件《目的基因获取和基因表达载体的构建 》
d．要求
□ 模板： 23 _目_的__基__因__两__条_链___
原料：dNTP
酶：热稳定□24 __D_N_A__聚__合_酶_____(□25 ____T_aq__酶_______) 引物：人工合成的两条□26 __D__N_A__片_段______(引物 1，引物 2)
知识点一
知识点二
课时精练
②利用 PCR 技术扩增目的基因
a．PCR 含义：是多聚酶链式反应的缩写，是一项在生物体外 □19
__复__制__特__定__D_N_A__片__段______的核酸合成技术。
□ b．PCR 原理： 20 __D_N__A_双__链__复__制__。
知识点一
知识点二
课时精练
c．前提条件：有一段已知目的基因的□21 _____核_苷__酸______序列，以便根 据这一序列合成□22 ____引__物________。
知识点一
知识点二
Hale Waihona Puke 课时精练d．构建过程
知识点一
知识点二
课时精练
e ． 提 取 依 据 ： 根 据 基 因 的 有 关 信 息 ， 如 □17 _基_因__的__核__苷__酸_序__列_ 、 □18
__基__因__的__功_能_____、基因在染色体上的位置、基因的转录产物 mRNA 以及基因 的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
提示：PCR 过程中，DNA 双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶； 由于 PCR 过程温度较高，所以需要能耐高温的 DNA 聚合酶。
知识点一
知识点二
课时精练
提示
典题分析 题型一 目的基因获取方法的辨析 [例 1] 下列有关获取目的基是工作量 大，具有一定的盲目性 B．由于真核细胞的基因中含有不表达的 DNA 片段，所以一般使用人工 合成的方法获取真核细胞中的目的基因 C．如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以利用化学方法直接人工 合成 D．PCR 技术的原理是 DNA 复制，需 DNA 连接酶催化 DNA 合成
□ 模板： 23 _目_的__基__因__两__条_链___
原料：dNTP
酶：热稳定□24 __D_N_A__聚__合_酶_____(□25 ____T_aq__酶_______) 引物：人工合成的两条□26 __D__N_A__片_段______(引物 1，引物 2)
知识点一
知识点二
课时精练
②利用 PCR 技术扩增目的基因
a．PCR 含义：是多聚酶链式反应的缩写，是一项在生物体外 □19
__复__制__特__定__D_N_A__片__段______的核酸合成技术。
□ b．PCR 原理： 20 __D_N__A_双__链__复__制__。
知识点一
知识点二
课时精练
c．前提条件：有一段已知目的基因的□21 _____核_苷__酸______序列，以便根 据这一序列合成□22 ____引__物________。
知识点一
知识点二
Hale Waihona Puke 课时精练d．构建过程
知识点一
知识点二
课时精练
e ． 提 取 依 据 ： 根 据 基 因 的 有 关 信 息 ， 如 □17 _基_因__的__核__苷__酸_序__列_ 、 □18
__基__因__的__功_能_____、基因在染色体上的位置、基因的转录产物 mRNA 以及基因 的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
提示：PCR 过程中，DNA 双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶； 由于 PCR 过程温度较高，所以需要能耐高温的 DNA 聚合酶。
知识点一
知识点二
课时精练
提示
典题分析 题型一 目的基因获取方法的辨析 [例 1] 下列有关获取目的基是工作量 大，具有一定的盲目性 B．由于真核细胞的基因中含有不表达的 DNA 片段，所以一般使用人工 合成的方法获取真核细胞中的目的基因 C．如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以利用化学方法直接人工 合成 D．PCR 技术的原理是 DNA 复制，需 DNA 连接酶催化 DNA 合成
基因工程 第五章目的基因的获取
oligo(dT)引导的DNA合成法：
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入1220个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶 合成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA mRNA 5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶 Oligo dT引物
5’
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ：
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。
随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法 （1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I
BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。 （1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入1220个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶 合成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA mRNA 5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶 Oligo dT引物
5’
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ：
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。
随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法 （1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I
BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。 （1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。
第五章目的基因的获取
的基因流程
目的标签法、非目的标签法
五、图位克隆（mapbased cloning）获 得目的基因
图位克隆：又叫定位克隆，1986年首先由剑
桥大学的Alancoulson提出。
根据目的基因在染色体上的位置进行分离基因，
无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先
六、mRNA差别显示技术（mRNA differential display）获得差异表达的基因
mRNA差别显示技术：对组织特异性 或诱导专一性表达基因进行分离的有效方 法之一。将mRNA逆转录和PCR技术相 互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技 术，也称为DDRT-PCR，
DDRT-PCR理论基础
3’ 5’
template templat因库（gene pool）：特定生物体全基因组的
集合（天然存在）e bank） 通过克隆的方法将某一基因组DNA或mRNA 保存于适当宿主菌中形成的转化子群。所有重 组DNA组合代表该基因组的全序列。
探针：目的基因局部片段、由氨基酸序列
获得的简并序列、近缘物种的同源序列
四、转座子标签法获得目的基因
（一）转座子的相关知识
转座子（transposon,Tn）:指位于染色体上
可以从基因组的一个位置转移到另一个位置的 DNA片段或基因。（jumping gene）
简单转座子：除转座所需基因外不携带任何
实验结果： 240组在能分出20000多条带！ 如果每条带相当于一种特定mRNA， 20000 mRNA基本上反映了一种特定细 胞中全部的mRNA。
DDRT-PCR操作步骤
*差异分离目的基因程序
利用两组细胞mRNA经过DDRT-PCR
后，分析比较cDNA种类的差异，分别回收 cDNA测序隆新基因。
目的标签法、非目的标签法
五、图位克隆（mapbased cloning）获 得目的基因
图位克隆：又叫定位克隆，1986年首先由剑
桥大学的Alancoulson提出。
根据目的基因在染色体上的位置进行分离基因，
无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先
六、mRNA差别显示技术（mRNA differential display）获得差异表达的基因
mRNA差别显示技术：对组织特异性 或诱导专一性表达基因进行分离的有效方 法之一。将mRNA逆转录和PCR技术相 互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技 术，也称为DDRT-PCR，
DDRT-PCR理论基础
3’ 5’
template templat因库（gene pool）：特定生物体全基因组的
集合（天然存在）e bank） 通过克隆的方法将某一基因组DNA或mRNA 保存于适当宿主菌中形成的转化子群。所有重 组DNA组合代表该基因组的全序列。
探针：目的基因局部片段、由氨基酸序列
获得的简并序列、近缘物种的同源序列
四、转座子标签法获得目的基因
（一）转座子的相关知识
转座子（transposon,Tn）:指位于染色体上
可以从基因组的一个位置转移到另一个位置的 DNA片段或基因。（jumping gene）
简单转座子：除转座所需基因外不携带任何
实验结果： 240组在能分出20000多条带！ 如果每条带相当于一种特定mRNA， 20000 mRNA基本上反映了一种特定细 胞中全部的mRNA。
DDRT-PCR操作步骤
*差异分离目的基因程序
利用两组细胞mRNA经过DDRT-PCR
后，分析比较cDNA种类的差异，分别回收 cDNA测序隆新基因。
目的基因的获得PPT课件
4
1.1 已知序列基因的PCR扩增 ⑴引物设计； ⑵引物效果检验和PCR参数确定。
5
1.2 RT-PCR
原理： 利用逆转录酶能将mRNA逆转录成
cDNA的特性，通过合适的引物，将细胞 内的mRNA逆转录成cDNA。
然后，通过PCR技术，将痕量的cDNA 扩增成大量的双链DNA。
6
逆转录步骤
cDNA 链合成： 一般利用polyT作为引物，也可用特异 性的序列作为引物
1
目的基因
需要克隆的DNA片段。
编码某种蛋白质
研究某基因结构 和功能的关系
研究某基因与 疾病的关系
2
目的基因
1.1 已知序列基因的PCR扩增 1.2 RT-PCR 1.3 RACE (cDNA末端的快速扩增)
然后根据核心序列设计引物。 来源：蛋白质、cDNA
10
RACE的技术流程
⑵ 设计简并引物和扩增核心区域
11
RACE的技术流程
⑶ 设计RACE引物并进行3‘RACE和5’RACE
扩增的核心区域克隆和测序后，既获得目的基因 中间部分的序列，根据这一序列分别设计RACE引物。
3‘RACE：
上游引物：根据中间核心序列设计 下游引物：oligo（dT） 利用cDNA第一链为模板将cDNA3’端扩增出来
17
思考题：
目的基因的获得方式有哪些？
18
个人观点供参考，欢迎讨论！
M=A、C、G N=A、G、C 、T 2.2 以5‘端随机引物和3’锚定引物进行PCR 2.3 PAGE 2.4 回收差异条带，利用差异条带法获取目的基因
1979年，Khornan等首次用化学的方法 合成了一种具有生物活性的大肠杆菌酪氨 酸转移酶核糖核酸基因，开创了基因化学 合成的先例。
1.1 已知序列基因的PCR扩增 ⑴引物设计； ⑵引物效果检验和PCR参数确定。
5
1.2 RT-PCR
原理： 利用逆转录酶能将mRNA逆转录成
cDNA的特性，通过合适的引物，将细胞 内的mRNA逆转录成cDNA。
然后，通过PCR技术，将痕量的cDNA 扩增成大量的双链DNA。
6
逆转录步骤
cDNA 链合成： 一般利用polyT作为引物，也可用特异 性的序列作为引物
1
目的基因
需要克隆的DNA片段。
编码某种蛋白质
研究某基因结构 和功能的关系
研究某基因与 疾病的关系
2
目的基因
1.1 已知序列基因的PCR扩增 1.2 RT-PCR 1.3 RACE (cDNA末端的快速扩增)
然后根据核心序列设计引物。 来源：蛋白质、cDNA
10
RACE的技术流程
⑵ 设计简并引物和扩增核心区域
11
RACE的技术流程
⑶ 设计RACE引物并进行3‘RACE和5’RACE
扩增的核心区域克隆和测序后，既获得目的基因 中间部分的序列，根据这一序列分别设计RACE引物。
3‘RACE：
上游引物：根据中间核心序列设计 下游引物：oligo（dT） 利用cDNA第一链为模板将cDNA3’端扩增出来
17
思考题：
目的基因的获得方式有哪些？
18
个人观点供参考，欢迎讨论！
M=A、C、G N=A、G、C 、T 2.2 以5‘端随机引物和3’锚定引物进行PCR 2.3 PAGE 2.4 回收差异条带，利用差异条带法获取目的基因
1979年，Khornan等首次用化学的方法 合成了一种具有生物活性的大肠杆菌酪氨 酸转移酶核糖核酸基因，开创了基因化学 合成的先例。
目的基因的制备
2019/11/7
第一节 目的基因的制备
27
（3）避免外源D禁外源DNA片段之间的连接！！！
为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合： 将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端
2019/11/7
2
二 什么是目的基因
基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同 一生物体中，创造出具有高度应用价值的新物种。为此 必须从现有生物群体中，根据需要分离出此类基因，即 准备要分离、改造、扩增或表达的基因通常称之为目的 基因。
如抗逆性相关基因（抗病、抗寒等）、生物药和保健品 相关基因、毒物降解相关基因 、工业用酶等相关基因 等体的最大装载量如下： 质粒 l-DNA 考斯质粒 BAC
10 kb 23 kb 4
2019/11/7
第一节 目的基因的制备
24
2.1.5.3 载体与基因组DNA的切割
基因
大小（bp） 合成年代 基因
大小（bp） 合成年代
人胰岛素 126 转运RNA 542 -干扰素 81 肠促胰液肽 162 尿抑胃激素 453 2019-/干11/扰7 素
1978 1979 1981 1982 1982 1984
视紫红质 前脑菲肽 ATP酶 溶菌酶 RNA酶T1 RNA酶Ａ
和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后
者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固
相亚磷酸三酯法原理设计的
2019/11/7
12
化学合成的单元操作
DMT： 二甲氧基三苯甲基
DMT O
CH2 O G
HH
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2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。
② 内切酶粘性末端
能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I） (同尾酶)
BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
Sau 3A
5’-GATC----3’ 3’----CTAG-5’
2. 机械切割法
（1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断 裂成约300bp的随机片段。 （2）高速搅拌 1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb 的随机片段。
目前化学合成寡核苷酸大多数是在合成 仪上自动进行的，DNA自动合成已采用 的是固相磷酸二酯法和亚磷酸三酯法，
由于亚磷酸三酯法具有反应速度快，合
成效率高和副反应极少等优点，已经在 自动合成仪被广泛采用。
3、亚磷酸三酯法
(1)脱二苯甲基保护基 加入ZnBr2或二氯乙酸，脱去4，4— 二对甲氧基三苯甲基，释放出与载体相连的寡聚核苷酸单 体1上的5’—OH。
AATTC G
EcoRI Adaptor
GAATTC CTTAAG
EcoRI Linker DNA合成仪
第三library）
将某种生物细胞的整个基因组DNA切割 成大小合适的片段，并将所有这些片段 都与适当的载体连接，引入相应的宿主 细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生 物体的全部基因，称为基因。第二节 化学合成目的基因
1976年H.G. Khorana提出了用化学方法 合成基因的设想，并于1979年在science 上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨 酸tRNA基因的论文。
一、目前常用的方法
磷酸二酯法、 亚磷酸三酯法、 自动化合成法。
磷酸三酯法、 固相合成法
1. 磷酸二酯法 （1）原理 ① 保护dNTP的3’端P和5’端–OH
BamH I BamH I
BamH I
gene
二、随机片段化
1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。
（1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数
影响所切出的产物的长度和随机程度。
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。 随机程度高。如HaeⅢ、Al体的要求
5. 合成人工接头或衔接物
含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔 接物（Linker）序列。
衔接物用化学合成法合成的一段10-12bp的特定 限制性内切酶识别位点序列的平端双链。
人工接头用化学合成法合成的一段不等长双链 DNA序列，一头平末端、另一头粘性末端，粘性 末端某种酶切所产生的粘性末端）。
合成的二核苷酸连接处有三个酯键！
固相磷酸三酯合成法 将第一个核苷酸的3’OH端固定在固相支持物 上。 是目前通用的合成方法。
固相磷酸三酯合成过程
C
固相支持物
固相 支持物
固相 支持物
Hale Waihona Puke 结果是全保护的DNA：5’ DMT(4，4-二对甲氧基三苯甲 基 ), 3’固相支持物, 核苷酸之间对氯苯。最后脱保护
起始脱氧单核苷酸
加入的脱氧单核苷酸
② 带保护的单核苷酸连接
带5’保护的单 核苷酸与带3’ 保护的另一个 单核苷酸以磷 酸二酯键连接 起来
③ 用酸或碱的脱保护
80%乙酸
（2）合成过程
下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的二核苷酸聚合。
2. 磷酸三酯法
原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的 单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先 连接了一个保护基团。
第五章 目的基因的获取
目的基因： 准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
第一节 基因组DNA片段化
一、限制性内切酶法 用限制性内切酶把基因组DNA切成不同 大小的片段。
酶切
1. 优点
由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。
2. 缺点
目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
(5)氧化反应 形成的3’一5’磷酸二酯键由于磷为3价，即亚磷 酸酯，不稳定，能被酸或碱解离。加入I2将其氧化，使之转 化为磷酸三酯，其中磷为5价。
五价 三价
如此经过多次循环，直到合成所需长度 为止，再用浓NH4OH将DNA从固相上 洗脱下来，最后除去NH4OH ，在真空 中抽干，样品即可溶于适量的水中进行 纯化分析。
(2)活化新的碱基 核苷酸单体2 的3’端的二异丙基亚磷酸酰 上的磷酸的OH用β-氰乙基或甲基保护，准备和前一个碱基 进行反应。
(3)缩合反应 在弱强——四唑的存在下，新加入带保护基的 核苷酸单体2与单体1发生缩合反应，形成3’，5’—磷酸二酯 键，其中，磷为3价，即形成了亚磷酸三酯中间产物。
(4)盖帽反应 加入乙酸酐，使极少数尚未参加缩合反应的核 苷酸单体1 中的5’—OH乙酰化，从而达到封闭的作用，终 止其以后参加缩台反应的可能性，以减少发生合成错误的机 会。
（3）连接酶连成完整双链 T4多核苷酸激酶 使5’-OH磷酸化 T4 DNA连接酶 完整的DNA双链
2. 互补延伸连接法
预先设计的片段之间有局部互补区，可以 相互作为另一个片段延长的引物，用DNA 聚合酶延伸成完整的双链。
5’
3’
Klenow片段 引物
5’
3’
T4DNA连接酶
5’
3’
三、 寡聚核苷酸化学合成的优点 1. 直接合成基因 （1）mRNA的含量很低，很难作cDNA （2）有些基因比较短，化学合成费用较低 2. 合成引物（20mer左右） 3. 合成探针序列 4. 定点突变合成 合成带有定点突变的基因片段。
要注意的问题:合成方向3’ → 5’ 核苷酸单体的磷酸基团在3’端 亚磷酸三酯法的磷为3价磷，需要氧化。
二、 化学合成DNA片段的组装
化学合成的DNA片段一般在200bp以内。 1. 互补连接法
（1）互补配对
预先设计合成的片段之间都有互补 区域，不同片段之间的互补区域能 形成有断点的完整双链。 （2）5’端磷酸化 用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端 带上磷酸。（合成的DNA单链的5’端是-OH）
② 内切酶粘性末端
能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I） (同尾酶)
BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
Sau 3A
5’-GATC----3’ 3’----CTAG-5’
2. 机械切割法
（1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断 裂成约300bp的随机片段。 （2）高速搅拌 1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb 的随机片段。
目前化学合成寡核苷酸大多数是在合成 仪上自动进行的，DNA自动合成已采用 的是固相磷酸二酯法和亚磷酸三酯法，
由于亚磷酸三酯法具有反应速度快，合
成效率高和副反应极少等优点，已经在 自动合成仪被广泛采用。
3、亚磷酸三酯法
(1)脱二苯甲基保护基 加入ZnBr2或二氯乙酸，脱去4，4— 二对甲氧基三苯甲基，释放出与载体相连的寡聚核苷酸单 体1上的5’—OH。
AATTC G
EcoRI Adaptor
GAATTC CTTAAG
EcoRI Linker DNA合成仪
第三library）
将某种生物细胞的整个基因组DNA切割 成大小合适的片段，并将所有这些片段 都与适当的载体连接，引入相应的宿主 细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生 物体的全部基因，称为基因。第二节 化学合成目的基因
1976年H.G. Khorana提出了用化学方法 合成基因的设想，并于1979年在science 上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨 酸tRNA基因的论文。
一、目前常用的方法
磷酸二酯法、 亚磷酸三酯法、 自动化合成法。
磷酸三酯法、 固相合成法
1. 磷酸二酯法 （1）原理 ① 保护dNTP的3’端P和5’端–OH
BamH I BamH I
BamH I
gene
二、随机片段化
1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。
（1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数
影响所切出的产物的长度和随机程度。
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。 随机程度高。如HaeⅢ、Al体的要求
5. 合成人工接头或衔接物
含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔 接物（Linker）序列。
衔接物用化学合成法合成的一段10-12bp的特定 限制性内切酶识别位点序列的平端双链。
人工接头用化学合成法合成的一段不等长双链 DNA序列，一头平末端、另一头粘性末端，粘性 末端某种酶切所产生的粘性末端）。
合成的二核苷酸连接处有三个酯键！
固相磷酸三酯合成法 将第一个核苷酸的3’OH端固定在固相支持物 上。 是目前通用的合成方法。
固相磷酸三酯合成过程
C
固相支持物
固相 支持物
固相 支持物
Hale Waihona Puke 结果是全保护的DNA：5’ DMT(4，4-二对甲氧基三苯甲 基 ), 3’固相支持物, 核苷酸之间对氯苯。最后脱保护
起始脱氧单核苷酸
加入的脱氧单核苷酸
② 带保护的单核苷酸连接
带5’保护的单 核苷酸与带3’ 保护的另一个 单核苷酸以磷 酸二酯键连接 起来
③ 用酸或碱的脱保护
80%乙酸
（2）合成过程
下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的二核苷酸聚合。
2. 磷酸三酯法
原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的 单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先 连接了一个保护基团。
第五章 目的基因的获取
目的基因： 准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
第一节 基因组DNA片段化
一、限制性内切酶法 用限制性内切酶把基因组DNA切成不同 大小的片段。
酶切
1. 优点
由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。
2. 缺点
目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
(5)氧化反应 形成的3’一5’磷酸二酯键由于磷为3价，即亚磷 酸酯，不稳定，能被酸或碱解离。加入I2将其氧化，使之转 化为磷酸三酯，其中磷为5价。
五价 三价
如此经过多次循环，直到合成所需长度 为止，再用浓NH4OH将DNA从固相上 洗脱下来，最后除去NH4OH ，在真空 中抽干，样品即可溶于适量的水中进行 纯化分析。
(2)活化新的碱基 核苷酸单体2 的3’端的二异丙基亚磷酸酰 上的磷酸的OH用β-氰乙基或甲基保护，准备和前一个碱基 进行反应。
(3)缩合反应 在弱强——四唑的存在下，新加入带保护基的 核苷酸单体2与单体1发生缩合反应，形成3’，5’—磷酸二酯 键，其中，磷为3价，即形成了亚磷酸三酯中间产物。
(4)盖帽反应 加入乙酸酐，使极少数尚未参加缩合反应的核 苷酸单体1 中的5’—OH乙酰化，从而达到封闭的作用，终 止其以后参加缩台反应的可能性，以减少发生合成错误的机 会。
（3）连接酶连成完整双链 T4多核苷酸激酶 使5’-OH磷酸化 T4 DNA连接酶 完整的DNA双链
2. 互补延伸连接法
预先设计的片段之间有局部互补区，可以 相互作为另一个片段延长的引物，用DNA 聚合酶延伸成完整的双链。
5’
3’
Klenow片段 引物
5’
3’
T4DNA连接酶
5’
3’
三、 寡聚核苷酸化学合成的优点 1. 直接合成基因 （1）mRNA的含量很低，很难作cDNA （2）有些基因比较短，化学合成费用较低 2. 合成引物（20mer左右） 3. 合成探针序列 4. 定点突变合成 合成带有定点突变的基因片段。
要注意的问题:合成方向3’ → 5’ 核苷酸单体的磷酸基团在3’端 亚磷酸三酯法的磷为3价磷，需要氧化。
二、 化学合成DNA片段的组装
化学合成的DNA片段一般在200bp以内。 1. 互补连接法
（1）互补配对
预先设计合成的片段之间都有互补 区域，不同片段之间的互补区域能 形成有断点的完整双链。 （2）5’端磷酸化 用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端 带上磷酸。（合成的DNA单链的5’端是-OH）