甜樱桃品种的SSR鉴定

生物技术通报

ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ・研究报告・２００７年第５期

收稿日期：２００７－０４－１０

作者简介：蔡青（１９８２－），女，山东，果树学，硕士；Ｅ－ｍａｉｌ：ｃａｉｑｉｎｇ８２０２２１＠１６３．ｃｏｍ

通讯作者：马焕普（１９５６－），女，河北，研究员，主要研究方向为果树生理与调控技术，通讯地址：ｐｕｍａ５４３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ

张开春（１９６５－），男，河南，研究员，主要研究方向为木本植物分子遗传，通讯地址：ｚｈｎａｇｋａｉｃｈｕｎ＠ｂａａｆｓ．ｎｅｔ．ｃｎ

甜樱桃（ＰｒｕｎｕｓａｖｉｕｍＬ．）属于蔷薇科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）李属，被誉为果中珍品，享有“春果第一枝”的美称，是近几年北京地区发展迅速、经济价值较高的树种。因此，甜樱桃种质鉴定是甜樱桃种质资源研究的基础和发展的前提，也是苗木市场管理的技术手段。以往对品种鉴别主要靠形态指标，但对于差异并不明显的个体，传统的形态特征很难识别，而利用分子标记（ＲＡＰＤ，ＡＦＬＰ，ＳＳＲ等）对品种进行鉴定和分类，是一种简单准确而且可靠的方法。

ＳＳＲ技术由于具有多态性丰富和共显性遗传等特点和其他分子标记一起被广泛应用于植物基因组的研究，如苹果［１］、梨［２］、桃［３］、猕猴桃［４］、葡萄［５］等。而ＳＳＲ标记应用于樱桃上的报道较少，仅在国外有报道，如ＹｉｌｄｉｚＡ等［６］对８１个土耳其酸樱桃品种进行亲缘关系分析，而在国内尚未见报道。

本研究应用Ｓ－基因和ＳＳＲ分子标记技术鉴定３０个甜樱桃品种并绘制指纹图谱，以期为甜樱桃种质资源鉴定和品种亲缘关系分析在分子水平上提供依据。

１

材料与方法１．１材料

试材甜樱桃（ＰｒｕｎｕｓａｖｉｕｍＬ．）品种取自北京市农林科学院林业果树研究所。（品种及其亲本见表１）１．２方法

１．２．１模板ＤＮＡ的制备春季取嫩叶，按顾红雅等［７］报道的ＣＴＡＢ法，从嫩叶中提取基因组ＤＮＡ。提取的ＤＮＡ质量和浓度采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定。样品稀释到２０ｎｇ／μｌ保存备用。１．２．２ＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系在１５μｌ的ＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系中，加入１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ１．５μｌ，２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２１．５μｌ，甜樱桃品种的ＳＳＲ鉴定

蔡青１

姜立杰２马焕普１张开春２张晓明２闫国华２（１北京农学院，北京１０２２０６；２北京市农林科学院林业果树研究所，北京１０００９３）

摘要：在建立甜樱桃品种ＳＳＲ分析体系基础上，从２４对引物中筛选出５对多态性高、分辨能力强的引物（即

ＰｃｅＧＡ２５、ＰＭＳ３、ＰＭＳ４９、ＰＳ０８Ｅ０８、ｐｃｈｐｇｍｓ３），并且结合Ｓ－基因共同对３０个甜樱桃品种进行区分鉴别。对生产上应用ＳＳＲ技术和Ｓ－基因检测甜樱桃品种真实性和纯度作了展望。

关键词：樱桃ＳＳＲＳ－基因品种鉴定指纹图谱

ＳＳＲＡｎａｌｙｓｉｓｆｏｒＣｈｅｒｒｙＣｕｌｔｉｖａｒｓ

ＣａｉＱｉｎｇ１ＪｉａｎｇＬｉｊｉｅ２ＭａＨｕａｎｐｕ１ＺｈａｎｇＫａｉｃｈｕｎ２ＺｈａｎｇＸｉａｏｍｉｎｇ２ＹａｎＧｕｏｈｕａ２

（１Ｂｅｉｊｉｎｇｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０２２０６；２ＢｅｉｊｉｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００９３）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｉｖｅｐａｉｒｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓ（ｉ．ｅＰｃｅＧＡ２５，ＰＭＳ３，ＰＭＳ４９，ＰＳ０８Ｅ０８，ｐｃｈｐｇｍｓ３）ｗｉｔｈｈｉｇｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓａｎｄ

ｐｏｗｅｒｆｕｌｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅｎｅｓｓｈａｖｅｂｅｅｎｓｅｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍ２４ｐａｉｒｓｏｆｐｒｉｍｅｒａｆｔｅｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｔｈｅＳＳＲａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍｉｎｃｈｅｒｒｙｖａｒｉｅｔｉｅｓ．Ｂｅｓｉｄｅｓ，ｔｈｅＳｇｅｎｅｗａｓａｌｓｏｃｏｍｂｉｎｅｄｔｏｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｔｈｅ３０ｃｕｌｔｉｖａｒｓ．ＫｅｙｐｏｉｎｔｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｔｒｕｅｎｅｓｓａｎｄｐｕｒｉｔｙｏｆｃｈｅｒｒｙｖａｒｉｅｔｉｅｓｏｆＳＳＲｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｗｅｒｅｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＣｈｅｒｒｙＳＳＲＳ－ｇｅｎｅＣｕｌｔｉｖａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＤＮＡＦｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ

２００７年第５期２ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ１．５μｌ，１０μｍｏｌ／Ｌ引物１μｌ，５Ｕ／μｌＴａｑ聚合酶０．２μｌ，２０ｎｇ模板ＤＮＡ，用双蒸水补足体系到１５μｌ。引物序列参照ＹｉｌｄｉｚＡＫａｃａｒ等［６］、Ｅ．Ｄｉｒｌｅｗａｎｇｅｒ［８］报道的序列由上海ｓａｎｇｏｎ公司合成，ＴａｑＤＮＡ酶、ｄＮＴＰｓ均购自北京华美公司。

１．２．３

ＳＳＲ－ＰＣＲ扩增程序９４℃４ｍｉｎ，９４℃４５ｓ，５７℃１ｍｉｎ，７２℃１ｍｉｎ，３５个循环，７２℃１０ｍｉｎ。ＰＣＲ仪为ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｃ生产的ＰＴＣ－１００ＴＭ型。１．２．４ＰＣＲ产物的检测在扩增反应结束后，用６．０℅的聚丙烯酰胺胶７０ｍｌ加入１０％过硫酸铵４００μｌ和ＴＥＭＥＤ４０μｌ制胶。用ＢｉｏＲａｄ３０００电泳系统７０Ｗ恒功率电泳３￣４ｈ，银染检测。

２结果与分析

２．１Ｓ－基因电泳分析

图１所示，通用引物ＢＦＰ７３／７４在３０个甜樱桃品种的基因组ＤＮＡ扩增后得到的谱带。可以分十种谱带类型，例如：红灯（４）、先锋（１７）和红艳（２７），它们都在８８６和９００处有带，和陈晓流等所鉴定的结果相似。

２．２引物筛选

从２４对ＳＳＲ引物中筛选出５对多态性较高、带型较清楚、分辨率较高的引物。其引物序号分别为ＰｃｅＧＡ２５、ＰＭＳ３、ＰＭＳ４９、ＰＳ０８Ｅ０８、ｐｃｈｐｇｍｓ３。表２为筛

选出的５对引物。２．３品种区分鉴定

通过Ｓ－基因电泳图谱（图１）将３０个供试品种分

为十类，在这个基础上通过ＳＳＲ引物扩增出的谱带

（图２），可以将全部供试甜樱桃品种区分开。例如：引

物ＰｃｅＧＡ２５可以将引物ＢＦＰ７３／７４区分不开的红艳

（２７）、红灯（４）和先锋（１７）区分出红艳（２７）；再用引物

ＰＭＳ３把红灯（４）和先锋（１７）区分开。其余材料都可以

按此方法区分开。３０个甜樱桃品种鉴别表（表３）。

３结论与讨论

ＳＳＲ标记是继ＲＡＰＤ标记后出现的基于ＰＣＲ反应的ＤＮＡ标记技术。

因其ＳＳＲ两侧的序列在种间甚至是属间具有很强的保守性，使得ＳＳＲ引物具有很好的通用性；由于ＳＳＲ因重复数目的不同，而得到ＳＳＲ标记呈现出高度多态性；ＳＳＲ－ＰＣＲ反应中采用双引物，且引物的长度均为２０ｂｐ左右，而使它的结果更为稳定，重复性也比ＲＡＰＤ大大的增强，这也使得ＳＳＲ反应体系的结果在很多实验室间交流。ＳＳＲ标记的这些特点使ＳＳＲ技术已经应用于很多领域的研究。我国作为樱桃的起源地之一，长期栽培驯化，已经培育出很多新品种。在国内，本研究是首次对国内外的甜樱桃品种进行鉴定区分［９］。

图１引物ＢＦＰ７３／７４扩增电泳图

表２试验中所使用的ＳＳＲ引物

蔡青等：甜樱桃品种的ＳＳＲ鉴定１７１