植物病毒检测技术研究进展详解

植物病毒检测技术研究进展刘茂炎摘要：随着现代技术的发展特别是分子技术的发展，鉴定和检测病毒的方法越来越多，也越来越精确快速。

以PCR为基础的基因工程技术已经广泛应用于病毒核酸分子的鉴定，其高灵敏度和高特异性是与PCR扩增反应的特异性引物相关联的；于此同时传统的鉴定检测技术依然有其发展优势。

不论怎样的方法技术，都是以病毒的理化性质以及侵染性为基础的。

在此基础上，甚至出现了某些边缘技术在病毒鉴定检测方面的应用。

本文主要综述的是对植物病毒鉴定检测技术的研究进展。

关键词：植物病毒；检测技术；PCR病毒在生物学上特征（如病毒的理化性质，包括病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）是对病毒最直观的认识。

常规的对植物病毒的鉴定检测方法有：生物学测定方法、血清学技术、电子显微镜技术、分子生物学技术等。

生物学测定依据病毒的侵染性，观察寄主植株或其它生物的症状表现；血清学技术以病毒外壳蛋白(CP)为基础；电子显微镜技术依据病毒的形状大小的不同；分子生物学鉴定则以病毒核酸为基础。

1.生物学鉴定最直接的方法是目测法，直接观察病毒对植物的病害症状。

如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV），病害症状为叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形；玉米鼠耳病的诊断主要依据田间症状表现[1]。

目测法因观察的主观性和症状的不确定性的影响而不精准。

1929年美国病毒学家霍姆斯（Holmes）用感病的植物叶片粗提液接种指示植物，2~3天后接种叶片出现圆形枯斑，枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比，能测出病毒的相对侵染力，对病毒的定性有着重要的意义，这种人工接种鉴定的方法就是枯斑和指示植物检测法。

国内报道的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus，RBSDV)可侵染28属57种禾本科植物，该病毒的主要传毒介体是灰飞虱(Laodelphax striatella)，玉米是灰飞虱的桥梁寄主而非最适寄主[2]，以玉米作为指示植物可以良好地鉴定RBSDV。

目前接种鉴定的方法主要有四种：粉風接种鉴定、嫁接接种鉴定、农杆菌接种鉴定、基因枪轰击法接种鉴定(叶青静等,2009)。

后两种鉴定方法涉及到了分子克隆技术，是传统方法与基因工程技术的结合。

用农杆菌接种法将番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus disease, TYLCD )导入叶盘和整个植株,TYLCV 在植株中进行系统侵染，诱导致病症状，同时此法还可以用来筛选抗TYLCV的植株[3]。

2. 免疫-血清检测方法2.1.血清学检测法目前血清学技术依然是植物病毒病原检测中最常用的方法之一，它是上世纪世纪六七十年代诞生的病毒检测技术，此类技术的原理主要根据病毒的侵染性以及其作为核蛋白的特性而设计的，利用血清中可以和具有某种特定结构特征的病毒结合的抗体，从而进行病毒的定性定量分析。

其中重要的一些方法有：补体结合测定法（补体能在抗体存在的情况下通过补体的酶作用溶解红细胞和革兰氏阴性菌）、沉淀法（不同病毒类型在电解质存在时抗体与同源抗原相互结合形成的沉淀也不同）等。

利用基因工程的方法从大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)中高效表达病毒的外壳蛋白，纯化表达产物制备抗血清具有特异性强的特点，可弥补常规方法的不足[4]。

2.2.酶联免疫吸附法酶联免疫吸附实验（ELISA）也是利用特异抗体吸附病毒颗粒的原理，只是在抗体上附带了酶标记，从而使反应可以有颜色强弱的变化，利于定时定量监测病毒浓度。

此法灵敏度高，且不受浓度范围或其他抑制剂的干扰。

ELISA基本类型主要有间接法(I-ELISA)和直接法(DAS-ELISA也叫双抗体夹心ELISA)[5]、三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)等(Accotto et al., 2000; Accotto&Noris, 2007;孙伟等,2002)。

其中TAS-ELISA是检测TYLCV常用和有效的手段之一。

1976 年Voller等首次将ELISA 方法用于检测植物病毒，Clark 和Adams 等[6]在1977年首次对植物病毒病原利用酶联免疫法进行了鉴定。

ELISA 方法可以检测出0.1～10 ng/mL 的病毒，特异性很强、操作简单、简便有效，国内外已研发出许多商品化的ELISA 试剂盒[7-10]。

因此，在植物病毒检测中ELISA技术也广泛地应用于病毒病的鉴定和进出口检疫上。

这种酶联免疫吸附测定(ELISA)是结合了酶的高效催化作用和抗原抗体的免疫反应，酶与抗体通过化学方法相结合而形成酶标抗体，酶标记抗体直接与包被在固体支持物上的待测抗原或抗体特异性结合或通过免疫桥特异性结合，再在酶的作用下使底物产生有颜色或高电子密度的可溶性产物，结果通过肉眼或比色法来进行定性的测定，从而得到抗体的性质和数量。

2.3.基于酶联免疫吸附法的新技术2.3.1组织印迹法此方法包括斑点免疫结合测定法(DIBA-ELISA 或dot-ELISA)、直接组织斑点免疫测定(IDDTB-ELISA)等[11]。

这些技术直接将组织印迹在膜上, 不仅保持了ELISA 的灵敏性和特异性等特点, 而且简化了操作程序, 使病毒检测更加快速、简单、方便, 且印迹在硝酸纤维膜上的样品保存时间较长, 检测结果能直观地显示出病毒感染的部位, 适用于植物病毒的大规模普查。

2.3.2免疫毛细管区带电泳技术免疫技术与电泳技术结合发展出了免疫毛细管区带电泳技术(Immuno Capillary Zone Electrophoresis,I- CZE)。

I-CZE 将血清学反应的专化性和毛细管区带电泳的灵敏、快速、可自动检测等特点结合起来, 实时检测抗原-抗体复合体，I-CZE 可快速分析多个样品, 因而在苗木带毒检测、植物检疫等方面可发挥巨大作用, 有广阔的应用前景。

2.3.3免疫PCR技术免疫技术与PCR 技术结合发展出了免疫PCR技术(I-PCR 或IC-PCR)。

免疫PCR 是一种将抗原抗体反应的高特异性与PCR 的高灵敏度有机结合的检测技术。

该技术先用抗体来捕获病毒, 提取核酸后, 再进行PCR 或RT-PCR 检测。

将PCR 技术和抗原抗体反应相结合，灵敏性非常高。

因其对一个分子的抗原都可以进行检测而具有十分广泛的应用前景，是一种用于检测微量抗原的PCR 技术。

该方法由于能去除抑制物质而改善检测环境, 比标准PCR 方法更为灵敏、可靠。

G. Harper 应用IC-PCR 检测到香蕉条纹病毒[12]。

此外还有快速免疫滤纸法、免疫胶体金技术、免疫沉淀法、免疫电镜、荧光免疫、放射免疫和Ig 指示试纸法等[13]。

3.显微成像技术病毒的很多特征如大小、形态、结构等必须借助电子显微镜进行检查。

对于目前尚难培养而形态又非常典型的病毒，可直接从感染组织或分泌液，或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作电子显微镜检查，直接观察病毒粒子。

目前通常认为运用负染和超薄切片电镜观察能够诊断和鉴别植物病毒, 一般可诊断到属的水平。

在植物病毒的诊断和形态鉴别中, 最有用的特征是病毒粒子的形态结构和寄主病变, 有些细胞病变特征还能用于区分不同的病毒种甚至株系。

3.1超薄切片法和负染法超薄切片法其优点是可观察病毒形态和形态发生过程，缺点是操作复杂，费时，但标本可长时间保存；负染法是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小，其优点是快速简易（10-20min）、分辨率高，缺点是敏感性低，要求病毒量在107以上，且所有样品应处于悬浮状态；T. Hatta 等用负染和超薄切片电镜观察区分了CMV 的6 个不同株系[14]。

3.2免疫吸附电镜技术1973 年, K.S. Derrick把电镜与免疫学技术结合, 发明了更为灵敏的免疫吸附电镜技术, 该技术现已成为植物病毒研究的一个重要手段[15]。

免疫电镜技术是将免疫学原理与电镜负染技术相结合的产物，在电镜制样过程中病毒颗粒不能集中的沉积在有效的电镜视野内，而容易造成电镜观察时的疏漏，免疫电镜法利用了抗体、抗原的亲和性与吸附性的这一特点，在电镜制样过程中，于铜网上先铺展一层细胞色素A，稍后再添加一滴抗体，多余液滴用滤纸吸掉，最后点上一滴抗原和染液，由于细胞色素A的作用，减少了样品即抗体、抗原的表面能力，能形成均匀的涂层，再加抗体、抗原的吸附作用使病毒能较集中地沉集在有效视野内，从而便于电镜下的观察，大大提高了检测几率。

D. Louro 等于1984 年在此基础上建立了悬浮样品的胶体金标记免疫修饰法[16]（也就是上述第二点免疫法中的免疫胶体金技术）。

此方法利用一抗对病毒进行免疫修饰, 再用胶体金标记二抗或蛋白 A 处理, 形成病毒" 抗体" 金颗粒免疫复合物。

由于在病毒表面的抗体“晕圈”上结合了直径5~10 nm 的金颗粒, 该复合物的电镜下的可见性好, 比单纯免疫修饰法更易判断。

3.3低温电镜技术以及一些局限性显微检测技术低温电镜技术，结合了电镜技术和低温结晶观察病毒的三维结构的技术，其不但有分辨率高的优点，而且对病毒样品的损伤和失真的概率都大大减小，常用于极微量和高保真要求的病毒观察检测[17]。

X-射线衍射技术，通过扫射病毒微晶得到的衍射图像来分析还原原始的病毒结构，但为了保证衍射图像的准确性，往往对样品的纯度和颗粒完整性要求较高，所以这种技术的使用范围相对受限。

核磁共振技术，对比前面提到的技术对操作的要求更低，运用范围也更广，但是对结构的准确性判断略低。

此技术主要用于病毒短肽的分析以及蛋白小分子构象变化的研究。

4.分子生物学检测方法寄生于宿主细胞的病毒有不同于宿主细胞的特异基因组序列，这是病毒的存在的证明。

分子生物学检测法就是通过检测病毒核酸(DNA、RNA)来鉴定病毒的存在,由于是建立在核酸水平上,所以相对于血清学检测法有更高的灵敏度(Piccotbetal, 1999),并且有更强的特异性,更广的检测范围,还可以进行大批量的样本检测,甚至可以使用粗提液检测病毒。

在植物病毒鉴定检测方面, 目前应用的分子生物学技术主要有核酸斑点杂交(Nucleic Acid Spot Hy-bridization, NASH)技术、多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)技术、dsRNA 电泳技术等[18]。

4.1.核酸分子杂交技术(Nucleic Acid Hybridization)核酸分子杂交技术是20 世纪70 年代发展起来的，它是以DNA 分子碱基互补配为理论依据，与待测样品的DNA 或RNA 用特异性的核酸探针形成杂交分子[19-20]。