分子生物学常用技术

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荧光共振能量ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ换技术
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一、酵母双杂交技术的基本原理
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二、酵母双杂交系统的应用
（一）分析已知蛋白之间的相互作用 （二）对蛋白质功能域的分析 （三）分析未知蛋白相互作用 （四）绘制蛋白质相互作用系统图谱 （五）在药物设计中的应用
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SuperSignal® 底物与二抗HRP反应发光
5
SuperSignal®
3
一抗与蛋白结合 (小鼠单抗 或兔多抗)
4
HRP标记二抗与一抗－蛋白复 合物结合
1
电泳分离，转膜，固定蛋白于膜上
2
漂洗和封闭
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其他
斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array)
面积的支持物上 。
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二、蛋白质芯片
蛋白质芯片(protein chip)
是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点 阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反
应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统
对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。
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第 八 节
蛋白质相互作用研究技术
Research Technology of Interaction of Protein
——目的基因的受体动物
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二、核转移技术
核转移技术
即动物整体克隆技术，将动物体细胞
核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，
使之发育成个体，即克隆(clone)。
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三、基因剔除技术
基因剔除技术
也称基因靶向(gene targeting)灭活， 有目的去除动物体内某种基因的技术。
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四、基因转移和基因剔除技术在 医学中的应用
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Western Blotting方法二

间接法：
优点： 1.信号放大， 2.灵敏度高（多个二抗结合 位点） 3.多种标记的二抗可供选择 4.免疫特异性不受标记影响 5.可选择不同的Marker 缺点： 1.有交叉反应引起的非特异 性条带 2.额外的二抗孵育以及条件 优化
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间接Western Blotting操作流程:
第二十二章
常用分子生物学技术 的原理及应用
The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application
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第
一
节
分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization & Blotting Technology
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DNA自动测序结果举例
目 目录 录
第
四
节
基
因
文
库
Gene Library
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基因文库 (gene library)
是指一个包含了某一生物体全部DNA序列 的克隆群体。
•基因组DNA文库 (genomic DNA library) • cDNA文库 (cDNA library)
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基因组 DNA文库
变性
95˚C
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
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四、PCR的主要用途
（一）目的基因的克隆
（二）基因的体外突变
（三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析
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三、几种重要的PCR衍生技术
（一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术
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实时PCR技术原理
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Cycle 3
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25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
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二、PCR体系基本组成成分
模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
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三、PCR的基本反应步骤
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蛋白质之间相互作用研究的重要性
蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形 成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成 者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制
与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢
等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。
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常用蛋白质相互作用的研究技术
酵母双杂交 各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选等等
建立动物模型
① 单基因决定疾病模型 基因剔除 获得性突变(gain-of-function mutation)
② 多基因决定疾病模型
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第 七 节 生 物 芯 片 技 术
Biological Chip Technology
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一、基因芯片
基因芯片(gene chip)
•DNA芯片(DNA chip) •cDNA芯片(cDNA chip) 是指将许多特定的DNA片段或cDNA片 段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位
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第六节
遗传修饰动物模型的建立 及应用
The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model
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一、转基因技术
转基因技术
采用基因转移技术使目的基因整合入受精 卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子 宫，使之发育成个体。 转基因——被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal)
用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体 的分析。
（二）RNA印迹技术 (Northern blotting)
用于RNA的定性定量分析。
（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting)
用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
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Western Blotting方法一

直接法：
优点： 1.快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的非 特异性条带 缺点： 1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵
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一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链
分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一
起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定
的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形
成杂化双链(heteroduplex) 。
DNA芯片技术 (DNA chip)
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第 二 节
聚 合 酶 链 反 应
Polymerase Chain Reaction
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一、基本工作原理
Template DNA
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5
Primer 1 5 Primer 2
Cycle 1
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Cycle 2
5
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5 5
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三、DNA自动测序
采用荧光替代放射性核素标记是实现 DNA 序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四 种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反
应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，
通过四种激光激发不同大小 DNA 片段上的荧光 分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集 荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。
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复性
RNA
DNA
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（一）印迹技术 （二）探针技术
探针 (probe)
一小段用同位素、生物素或荧光染料标
标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，
与固定在 NC 膜上的核苷酸结合，判断是否
有同源的核酸分子存在。
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二、印迹技术的类别及应用
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting)