试验1细胞大小测定

《细胞生物学》实验（养殖：1——3；生技、海科：1——6）实验一细胞器的分离、提取与测量【目的】掌握叶绿体分离的一般原理和方法，学习用测微尺测量细胞与细胞器大小的测定方法，并了解应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。

【原理】叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换。

利用低速离心机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液(0.35 mol／L氯化钠或0.4mol／L蔗糖溶液)中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。

将匀浆液在1000r／min离心，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，3000 r／min离心，可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。

在室温下进行分离要迅速。

用显微测微尺可以直接测量细胞大小，精确度较高。

显微测微尺分为物镜测微尺和目镜测微尺2种。

目镜测微尺是1块小玻璃圆片(可放人目镜内，其大小正好卡人目镜筒内)，在圆片正中央刻有1cm长的直线，直线上均匀分为100小格或50小格，每小格的长度，随目镜和物镜的放大倍数而变动。

物镜测微尺是一块特制的玻璃载片，载片中央刻有一条1mm长的直线，均匀地刻分为100个小格，每小格为1／100mm (为10μm)，用一小圆形玻璃盖片封盖着，物镜测微尺较目镜测微尺小格的间距精确，通过目镜测微尺测量细胞与细胞器的大小(小格数)，然后换以物镜测微尺校测小格数的精确数值，即为测量的细胞与细胞器大小结果。

某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。

若停止供能荧光现象立即停止。

有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光(称为自发荧光)，如叶绿素的火红色荧光。

有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光(称为间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。

【材料】菠菜叶片。

【实验用品】1．试剂：蒸馏水，0.35 mol／L氯化钠溶液，0.01% 吖啶橙。

2．器材：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，接种针，滤纸，试管，试管架，移液管，滴管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管，目镜测微尺，物镜测微尺，培养皿。

【实验步骤】1．选取新鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及粗脉，称3g于0.35 mol／L氯化钠溶液45mL中，置人组织捣碎机或研钵中。

2．利用组织捣碎机低速(5000r／min)匀浆3-5min，或研磨成匀浆。

3．用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中。

4．取滤液4 mL在1000 r／min下离心2min，弃去沉淀。

5．将上清液在3000 r／min下离心5 min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核)。

6．沉淀用0.35mol／L氯化钠溶液悬浮。

7．取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光学显微镜观察、绘图。

8．将物镜测微尺放在载物台上，校准目镜测微长度：在低倍显微镜下，移动镜台测微尺和转动目镜测微尺，使两者刻度平行，并使两者间某段的起、止线完全重复。

数出两条重合线之间的格数，即可求出目镜测微尺每格的相应长度。

目镜测微尺与物镜测微尺两者重合点的距离越长，所测得的数字越准确。

用同样方法分别测出高倍物镜下，目镜测微尺每格的相对长度。

计算目镜测微尺每格的长度：例如，测得某显微镜的目镜测微尺50格相当于物镜测微尺7格，则目镜测微尺每格长度为：（7X10μm）/50=1.4μm／格。

9.测量5～10个叶绿体的长轴和短轴，制表格表示测量结果。

10.取菠菜叶片于研钵中，加少量丙酮，研磨匀浆、过滤，滤液置于试管中，顺着太阳光观察，再将试管避开直射光，比较颜色的变化。

【实验报告】1.绘制普通光学显微镜下观察的叶绿体形态示意图。

2.用测微尺测量叶绿体的大小后，制表格表示测量结果。

3.记录观察的荧光现象，分析结果。

【思考题】1．分离叶绿体的实验原理是什么?2．操作过程中应注意什么?实验二细胞原生质流动的观察【目的】观察植物细胞质中原生质流动现象，了解影响细胞质中原生质流动的因素。

【原理】在多种植物的细胞中都能观察到原生质的流动现象，它是细胞活动强弱的重要指标。

细胞原生质流动现象的产生，是细胞骨架中微丝肌动蛋白与肌球蛋白相互滑动的结果，此过程要消耗能量，受各种因素诸如温度、渗透压及各种离子的影响。

【材料】黑藻(也称水王荪、轮叶黑藻)叶，轮藻，洋葱鳞茎(最好使用萌发的鳞茎)或鸭跖草雄蕊花丝或小麦幼苗的根毛(种子在培养皿中湿滤纸上萌发，当根长到1～2cm，有许多根毛时最合适)。

【实验用品】1．试剂：1mol/L氟化钠，1 mol/L丙二酸钠，0.17mol/L2,4—二硝基酚(DPN)。

2．器具：显微镜，载玻片，盖玻片，尖头镊子，刀片。

【实验步骤】1．取1块干净的载玻片，在中央滴1～2滴蒸馏水；取紫鸭跖草(或其它材料)花1朵，用镊子取1枚雄蕊，迅速置载玻片水滴中，切去花蕊，加盖玻片，用显微镜低倍物镜(10X)进行观察，注意花丝周围附着许多“含珠链”状的花丝毛，每1粒“念珠”是1个单毛细胞。

2．转换高倍物镜(40X)观察，可以看到细胞质中的颗粒和显著的细胞质，细胞质之间是液泡，内含水溶性花青素。

注意观察花丝毛细胞核的部位，哪一个部位见到细胞质流动，其流动的速度如何。

3．用吸水纸吸干水，加1滴1 mol/L氟化钠，注意观察细胞质停止流动的时间。

细胞质停止流动后，用吸水纸吸去氟化钠，滴人清水，注意流动是否能恢复。

4．依上述操作，加1滴1 mol/L丙二酸钠或0.17 mol/L 2,4—二硝基酚，注意观察细胞质流动速度是否发生改变；用吸水纸吸去药液后，加入蒸馏水，再观察细胞质流动的变化。

【注意事项】取材时用洋葱鳞片内表皮、鸭跖草雄蕊花丝上的表皮毛、轮藻幼嫩的节间细胞进行的显微观察，如一时找不到原生质流动的细胞，可将载玻片置于温箱里或白炽灯泡上很短时间提高温度后再观察。

【实验报告】1．绘制紫鸭跖草花丝细胞（或其它材料）原生质流动图。

2．记录加入各种化学试剂后细胞原生质流动停止的时间，并分析原因。

【思考题】1、你如何理解细胞原生质流动原理?2、影响细胞原生质流动的因素有哪些？实验三细胞骨架的观察【目的】掌握用光学显微镜观察植物细胞骨架的原理及方法，观察光学显微镜下细胞骨架的网状结构。

【原理】植物细胞用适当浓度的TritonX-100处理后，可破坏细胞内蛋白质，但细胞骨架系统的蛋白质却保护完好。

考马斯亮蓝R250(Coomassie brilliant blue R250)是一种蛋白质染料，处理后的材料用考马斯亮蓝R250染色后，用光学显微镜观察，可以见到一种网状结构，即是细胞骨架结构。

【材料】洋葱鳞叶。

【实验用品】1．试剂：(1) 2%考马斯亮蓝R250染色液：称考马斯亮蓝R250 1g，溶于250mL无水乙醇中，加冰醋酸35mL，再加蒸馏水至500mL。

(2) 磷酸缓冲液(pH 6.8)：6.8mmol/L磷酸缓冲液，调至pH6.8。

(3) M缓冲液(pH7.2)：50 mmol/L咪唑、50 mmol/L氯化钾、0.5mmol/L氯化镁、1mmol/L乙二醇双乙胺醚、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L琉基乙醇，调至pH7.2。

(4) 1%TritonX-100：用M缓冲液配制。

(5) 3%戊二醛：用M缓冲液配制。

(6) 中性树胶。

2．器具：显微镜，烧杯，玻璃滴管，载玻片，盖玻片，镊子。

【实验步骤】1．用镊子撕取洋葱鳞叶内侧的表皮若干片(约1cm2大小若干片)，置于50mL烧杯中，加入pH6.8磷酸缓冲液，使其下沉。

2．吸去磷酸缓冲液，用1%TritonX-100处理20min。

3．吸去TritonX-100，用M缓冲液洗3次，每次5min。

4．用3%戊二醛固定30min。

5．磷酸缓冲液(pH 6.8)洗3次，每次5 min。

6．0.2％考马斯亮蓝R250染色10min。

7．蒸馏水洗2次，然后将样品置于载玻片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。

8．如果染色效果好，则可依次用50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、正丁醇、二甲苯处理样品，各5min。

然后将样品平展于载玻片上，加l滴中性树胶，盖上盖玻片封片，制成永久切片。

【实验报告】描绘所观察到的洋葱鳞叶细胞骨架图。

【思考题】1、组成细胞骨架的成分有哪些?2、本实验制片中，TritonX-100有何作用？实验四细胞中多糖和过氧化物酶的定位【目的】掌握细胞中多糖和过氧化物酶的组织化学定位检测方法。

【原理】高碘酸-席夫试剂反应，简称PAS反应。

主要是利用高碘酸作为强氧化剂，能作用于含乙二醇基的糖，使其碳链断裂而形成乙二醛，氧化得到的醛基与Schiff试剂中的无色亚硫酸品红结合而生成红色化合物的取代染料而达到定位的目的，见下图：过氧化物酶体系能把联苯胺氧化成蓝色或棕色产物，反应式如下：中间产物联苯胺蓝是不稳定的，无需酶作用即可氧化为棕色。

【材料】马铃薯块茎、洋葱根尖或洋葱鳞茎。

【实验用品】1、试剂：（1）高碘酸溶液：高碘酸（HIO4.2H2O）0.4g95%乙醇35ml1/3mol/L 乙酸钠溶液5ml蒸馏水10ml（2）Schiff试剂：取0.5克研细的碱性品红于100毫升沸腾的蒸馏水中，搅拌使其充分溶解，当染液冷却至50℃时过滤，在滤液内加入1NHCl 10毫升。

然后放置，使其继续冷却至25℃时，再加无水偏重亚硫酸钠或无水偏重亚硫酸钾1克，置阴暗处约24小时后，染液褪至无色或略带淡黄色，然后加入0.5克活性炭，用力振荡1min，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，密封保存于4℃冰箱中。

可保存数日，用时升至室温，如溶液带红色或紫色，可加入少许无水偏重亚硫酸钠或无水偏重亚硫酸钾，使之再转变为无色时，仍可再用。

0.8克+蒸馏水20毫升+0.2M醋酸钠10毫升+纯酒精70毫升（3）亚硫酸水：取200ml自来水，加10ml 10％偏重亚硫酸钠或无水偏重亚硫酸钾水溶液和10ml 1mol/LHCl，三者于使用前混匀。

（4）70％乙醇。

（5）联苯胺水溶液：在0.85％盐水内加入联苯胺至饱和为止，使用前加入20％体积的H2O2，每2ml加1滴。

（6）0.1％钼酸铵溶液：0.1g 钼酸铵于100毫升0.85％盐水。

2、仪器设备：显微镜，镊子，染色钵，载玻片，盖玻片，吸水纸。

【实验步骤】1、PAS反应：（1）把马铃薯块茎用刀片切成薄片；（2）浸于高碘酸溶液5－15min；（3）移入70％乙醇中浸5min；（4）Schiff试剂染色15min；（5）亚硫酸溶液洗3次，每次1 min；（6）蒸馏水洗片刻，装片镜检。

2、过氧化物酶的测定：（1）把洋葱根尖徒手切称20－40微米厚的薄片或用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块；（2）浸在钼酸铵溶液5 min；（3）浸在联苯胺溶液内2 min至切片出现蓝色；（4）0.85％盐水洗1 min；（5）将薄片置于载玻片上展开，盖上盖玻片，镜检。