试验1细胞大小测定

《细胞生物学》实验

（养殖：1——3；生技、海科：1——6）

实验一细胞器的分离、提取与测量

【目的】

掌握叶绿体分离的一般原理和方法，学习用测微尺测量细胞与细胞器大小的测定方法，并了解应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。

【原理】

叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换。利用低速离心机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液(0.35 mol／L氯化钠或0.4mol／L蔗糖溶液)中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。将匀浆液在1000r／min离心，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，3000 r／min离心，可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。在室温下进行分离要迅速。

用显微测微尺可以直接测量细胞大小，精确度较高。显微测微尺分为物镜测微尺和目镜测微尺2种。目镜测微尺是1块小玻璃圆片(可放人目镜内，其大小正好卡人目镜筒内)，在圆片正中央刻有1cm长的直线，直线上均匀分为100小格或50小格，每小格的长度，随目镜和物镜的放大倍数而变动。物镜测微尺是一块特制的玻璃载片，载片中央刻有一条1mm长的直线，均匀地刻分为100个小格，每小格为1／100mm (为10μm)，用一小圆形玻璃盖片封盖着，物镜测微尺较目镜测微尺小格的间距精确，通过目镜测微尺测量细胞与细胞器的大小(小格数)，然后换以物镜测微尺校测小格数的精确数值，即为测量的细胞与细胞器大小结果。

某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光(称为自发荧光)，如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光(称为间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。

【材料】

菠菜叶片。

【实验用品】

1．试剂：蒸馏水，0.35 mol／L氯化钠溶液，0.01% 吖啶橙。

2．器材：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，接种针，滤纸，试管，试管架，移液管，滴管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管，目镜测微尺，物镜测微尺，培养皿。

【实验步骤】

1．选取新鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及粗脉，称3g于0.35 mol／L氯化钠溶液45mL中，置人组织捣碎机或研钵中。

2．利用组织捣碎机低速(5000r／min)匀浆3-5min，或研磨成匀浆。

3．用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中。

4．取滤液4 mL在1000 r／min下离心2min，弃去沉淀。

5．将上清液在3000 r／min下离心5 min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核)。

6．沉淀用0.35mol／L氯化钠溶液悬浮。

7．取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光学显微镜观察、绘图。

8．将物镜测微尺放在载物台上，校准目镜测微长度：在低倍显微镜下，移动镜台测微尺和转动目镜测微尺，使两者刻度平行，并使两者间某段的起、止线完全重复。数出两条重合线之间的格数，即可求出目镜测微尺每格的相应长度。目镜测微尺与物镜测微尺两者重合点的距离越长，所测得的数字越准确。用

同样方法分别测出高倍物镜下，目镜测微尺每格的相对长度。计算目镜测微尺每格的长度：例如，测得某显微镜的目镜测微尺50格相当于物镜测微尺7格，则目镜测微尺每格长度为：（7X10μm）/50=1.4μm／格。

9.测量5～10个叶绿体的长轴和短轴，制表格表示测量结果。

10.取菠菜叶片于研钵中，加少量丙酮，研磨匀浆、过滤，滤液置于试管中，顺着太阳光观察，再将试管避开直射光，比较颜色的变化。

【实验报告】

1.绘制普通光学显微镜下观察的叶绿体形态示意图。

2.用测微尺测量叶绿体的大小后，制表格表示测量结果。

3.记录观察的荧光现象，分析结果。

【思考题】

1．分离叶绿体的实验原理是什么?

2．操作过程中应注意什么?

实验二细胞原生质流动的观察

【目的】

观察植物细胞质中原生质流动现象，了解影响细胞质中原生质流动的因素。

【原理】

在多种植物的细胞中都能观察到原生质的流动现象，它是细胞活动强弱的重要指标。细胞原生质流动现象的产生，是细胞骨架中微丝肌动蛋白与肌球蛋白相互滑动的结果，此过程要消耗能量，受各种因素诸如温度、渗透压及各种离子的影响。

【材料】

黑藻(也称水王荪、轮叶黑藻)叶，轮藻，洋葱鳞茎(最好使用萌发的鳞茎)或鸭跖草雄蕊花丝或小麦幼苗的根毛(种子在培养皿中湿滤纸上萌发，当根长到1～2cm，有许多根毛时最合适)。

【实验用品】

1．试剂：1mol/L氟化钠，1 mol/L丙二酸钠，0.17mol/L2,4—二硝基酚(DPN)。

2．器具：显微镜，载玻片，盖玻片，尖头镊子，刀片。

【实验步骤】

1．取1块干净的载玻片，在中央滴1～2滴蒸馏水；取紫鸭跖草(或其它材料)花1朵，用镊子取1枚雄蕊，迅速置载玻片水滴中，切去花蕊，加盖玻片，用显微镜低倍物镜(10X)进行观察，注意花丝周围附着许多“含珠链”状的花丝毛，每1粒“念珠”是1个单毛细胞。

2．转换高倍物镜(40X)观察，可以看到细胞质中的颗粒和显著的细胞质，细胞质之间是液泡，内含水溶性花青素。注意观察花丝毛细胞核的部位，哪一个部位见到细胞质流动，其流动的速度如何。

3．用吸水纸吸干水，加1滴1 mol/L氟化钠，注意观察细胞质停止流动的时间。细胞质停止流动后，用吸水纸吸去氟化钠，滴人清水，注意流动是否能恢复。

4．依上述操作，加1滴1 mol/L丙二酸钠或0.17 mol/L 2,4—二硝基酚，注意观察细胞质流动速度是否发生改变；用吸水纸吸去药液后，加入蒸馏水，再观察细胞质流动的变化。

【注意事项】

取材时用洋葱鳞片内表皮、鸭跖草雄蕊花丝上的表皮毛、轮藻幼嫩的节间细胞进行的显微观察，如一时找不到原生质流动的细胞，可将载玻片置于温箱里或白炽灯泡上很短时间提高温度后再观察。

【实验报告】

1．绘制紫鸭跖草花丝细胞（或其它材料）原生质流动图。

2．记录加入各种化学试剂后细胞原生质流动停止的时间，并分析原因。

【思考题】

1、你如何理解细胞原生质流动原理?

2、影响细胞原生质流动的因素有哪些？