NEB公司提供的保护碱基序列表
NEB保护碱基-各种酶切位点保护碱基
0
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>90
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Nhe I
GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG
0
0
10
25
10
50
Not I
TTGCGGCCGCAA
0
0
ATTTGCGGCCGCTTTA
10
10
AAATATGCGGCCGCTATAAA
10
10
ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT
酶 Acc I Afl III Asc I Ava I BamH I Bgl II BssH II BstE II BstX I Cla I
EcoR I
PCR 设计引物时酶切位点的保护
寡核苷酸序列
GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG
CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG
0
0
0
25
0
50
75
>90
Pst I
GCTGCAGC
0
0
TGCACTGCAGTGCA
10
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AACTGCAGAACCAATGCATTGG
>90
>90
AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA
>90
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CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
0
0
Pvu I
CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA
25
90
AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA
各种酶切位点的保护碱基引物设计必看
各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。
一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments(oligonucleotides)为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。
取1 μg 已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH , 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
2.双酶切的问题参看目录，选择共同的buffer。
其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer 完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37℃进行同步酶切。
但BamH I在37℃下有时表现出star活性，常用30℃单切。
两个酶切位点相邻或没有共同buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。
NEB公司提供的保护碱基序列表
Eco130I (StyI)
0
Eco147I (StuI)
0
Eco24I (BanII)
50-100
Eco31I (BsaI)
20-50
Eco32I (EcoRV)
20-50
Eco47I (AvaII)
50-100
Eco47III (AfeI) 0
Eco52I (EagI)
0-20
Eco57I (AcuI)
8 10 12
8 10 12 14
8
% Cleavage
2 hr 20 hr
10
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10
>90
0
50
0
50
0
0
0
25
10
50
>90 >90 >90
>90 >90 >90
0
0
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>90
75
>90
0
0
CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG
10
10
25
12
10
75
XmaI
CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA
20-50
Esp3I (BsmBI)
50-100
FaqI (BsmFI)
0-20
20-50 0-20 50-100
50-100 50-100
0-20 50-100 50-100 50-100 50-100
50-100 0-20 50-100
50-100
50-100
限制性内切酶酶切位点保护碱基
寡核苷酸近末端位点的酶切
(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
单位的寡实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A
260
核苷酸。
取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别
, 反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl
2
5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
酶切位点保护碱基
酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶酶切反应来源：easylabs 发布时间：2009-11-08 查看次数：12704本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，A flIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，E coRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，N siI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，S peI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A2 60单位的寡核苷酸。
NEB公司提供的保护碱基序列表
PauI (BssHII)0 50-100 PdiI (NaeI)0-20 50-100 PdmI (XmnI)50-100 PfeI (TfiI)50-100 Pfl23II (BsiWI)0-20 20-50 50-100 PfoI0 20-50 50-100 Ppu21I (BsaAI)50-100 PscI (PciI)0 50-100 Psp1406I (AclI)0-20 50-100 Psp5II (PpuMI)0 50-100 PstI0-20 50-100 PsuI (BstYI)0-20 50-100 PsyI (Tth111I)0 50-100 PvuI20-50 50-100 PvuII50-100 RsaI50-100 RseI (MslI)0 0-20 20-50 50-100 SacI50-100 SalI20-50 50-100 SatI (Fnu4HI)0 50-100 ScaI0-20 50-100 SchI (MlyI)50-100 SdaI (SbfI)0-20 50-100 SduI (Bsp1286I)50-100 SfaAI (AsiSI)0 0-20 20-50 SfiI50-100 SgrDI0-20 20-50 50-100 SgsI (AscI)50-100 SmaI50-100 SmiI (SwaI)0-20 50-100 SmoI (SmlI)0 50-100 SmuI (FauI)50-100 SsiI (AciI)50-100 SspDI (KasI)20-50 50-100 SspI0-20 50-100
Table. Cleavage Efficiency Close to the Termini of PCR Fragments Enzyme Bp from the recognition site to fragment end 1234 5 AanI (PsiI)0 0-20 20-50 AarI 20-50 50-100 AasI (DrdI)50-100 AatII 0-20 20-50 50-100 Acc65I (Asp718I)0-20 50-100 AdeI (DraIII)50-100 AjiI (BmgBI)50-100 AluI 0-20 20-50 50-100 Alw21I (BsiHKAI)50-100 Alw26I 50-100 Alw44I 0 20-50 50-100 ApaI 50-100 BamHI 50-100 BauI (BssSI) 0-20 20-50 50-100 BclI 50-100 BcnI (NciI)20-50 50-100 BcuI (SpeI)50-100 BfiI (BmrI)50-100 BfmI (SfcI)50-100 BfuI (BciVI)50-100 BglI20-50 50-100
NEB酶切位点保护碱基
PCR设计引物时酶切位点的保护切割率%酶 寡核苷酸序列2 hr20 hrAcc I G GTCGAC CCG GTCGAC CGCCG GTCGAC CGG 0Afl III C ACATGT GCC ACATGT GGCCC ACATGT GGG>90>90>90>90Asc I GGCGCGCCA GGCGCGCC TTT GGCGCGCC AA >90>90>90>90>90>90Ava I C CCCGGG GCC CCCGGG GGTCC CCCGGG GGA50>90>90>90>90>90BamH I C GGATCC GCG GGATCC CGCGC GGATCC GCG10>90>9025>90>90Bgl II C AGATCT GGA AGATCT TCGGA AGATCT TCC7525>90>90BssH II G GCGCGC CAG GCGCGC CTTTG GCGCGC CAA50>90BstE II G GGT(A/T)ACC C010BstX I AACTGCAGAA CCAATGCATTGGAAAACTGCAG CCAATGCATTGG AACTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT252550>90Cla I C ATCGAT GG ATCGAT CCC ATCGAT GGCCC ATCGAT GGG>9050>9050EcoR ICG GAATTC CG CCG GAATTC CGG >90>90>90>90Hae III GG GGCC CCAGC GGCC GCTTTGC GGCC GCAA >90>90>90>90>90>90Hind III C AAGCTT GCC AAGCTT GGCCC AAGCTT GGG1075Kpn I G GGTACC CGG GGTACC CCCGG GGTACC CCG>90>90>90>90Mlu I G ACGCGT CCG ACGCGT CG2550Nco I C CCATGG GCATG CCATGG CATG5075Nde I C CATATG GCC CATATG GGCGC CATATG GCGGGGTTT CATATG AAACCCGGAATTC CATATG GAATTCCGGGAATTC CATATG GAATTCCC7575>90>90Nhe I G GCTAGC CCG GCTAGC CGCTA GCTAGC TAG10102550Not I TT GCGGCCGC AAATTT GCGGCCGC TTTAAAATAT GCGGCCGC TATAAAATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTATAAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA10102525101090>90Nsi I TGC ATGCAT GCACCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT10>90>90>90Pac I TTAATTAAG TTAATTAA CCC TTAATTAA GG 025>90Pme IG GTTTAAAC CGG GTTTAAAC CC AGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG752550>90Pst I G CTGCAG CTGCA CTGCAG TGCAAA CTGCAG AACCAATGCATTGGAAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAACTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT10>90>9010>90>90Pvu I C CGATCG GAT CGATCG ATTCG CGATCG CGA102510Sac I C GAGCTC G1010Sac II G CCGCGG CTCC CCGCGG GGA50>90Sal I GTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGGACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA10105075Sca I G AGTACT CAAA AGTACT TTT 10752575Sma I CCCGGGC CCCGGG GCC CCCGGG GGTCC CCCGGG GGA10>90101050>90Spe I G ACTAGT CGG ACTAGT CCCGG ACTAGT CCGCTAG ACTAGT CTAG 1010>90>905050Sph I G GCATGC CCAT GCATGC ATGACAT GCATGC ATGT102550Stu I A AGGCCT TGA AGGCCT TCAAA AGGCCT TTT >90>90>90>90>90>90Xba IGC TCTAGA GC TGC TCTAGA GCA CTAG TCTAGA CTAG >907575>90>90>90Xho I C CTCGAG GCC CTCGAG GGCCG CTCGAG CGG10102575Xma I C CCCGGG GCC CCCGGG GGCCC CCCGGG GGGTCCC CCCGGG GGGA2550>9075>90>90注释：1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。
各种酶切位点的保护碱基
各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。
一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
在资料上查不到的，我们一般都随便加 3个碱基做保护。
寡核苷酸近末端位点的酶切（Cleavage Close to the End of DNA Fragments（oligonucleotides）为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用Y[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A 260单位的寡核苷酸。
取1 Q已标记了的寡核苷酸与 20单位的内切酶，在20° C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含 70 mM Tris-HCI （pH 7.6）, 10 mM MgCI 2 , 5 mM DTT 及适量的 NaCl 或 KCI （视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE （ 7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
2.双酶切的问题参看目录，选择共同的 buffer。
其实，双酶切选哪种 buffer是实验的结果，takara 公司从1979 年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer 完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37 C进行同步酶切。
但BamH I在37 C下有时表现出star活性，常用30 C单切。
两个酶切位点相邻或没有共同buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。
酶切位点保护碱基
本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A26单位的寡核苷酸。
取1µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在2 00°C条件下分别反应2小时和20小时。
各种酶切位点的保护碱基引物设计必看
酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。
一般情况下，在 酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
在资料上 查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核昔酸近末端位点的酶切（Cleavage Close to the End of DNA Fragments（oligonucleotides ）为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB 采用了一系列含识别序列的 短双链寡核甘酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上 切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA 末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常 需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用Y -[32P]ATP 在T4多聚核甘酸激酶的作用下标记0.1A 260单位的寡核甘酸。
取1 pg 已标记了的寡核甘酸与20单位的内切酶，在20°C 条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl （pH 7.6）, 10 mM MgCJ , 5 mM DTT 及适量的 NaCI 或 KCl （视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE （7 M 尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核甘酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发 夹结构而降低。
切位点 的保护碱基2.双酶切的问题参看目录，选择共同的buffer。
其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37℃进行同步酶切。
但BamH I在37℃下有时表现出star活性，常用30℃单切。
两个酶切位点相邻或没有共同buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。
各种酶切位点的保护碱基
各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。
一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核昔酸近末端位点的酶切（Cleavage Close to the End of DNA Fragments（oligonucleotides）为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核昔酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用Y[32P]ATP在T4多聚核甘酸激酶的作用下标记0.1 A 260单位的寡核昔酸。
取1 Q已标记了的寡核昔酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCI （pH 7.6） , 10 mM MgCI 2,5 mM DTT S适量的NaCI 或KCI （视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核昔酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
TCC CCCGGG GGA 12 >90 >90参看目录，选择共同的buffero其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37 C进行同步酶切。
但BamH I在37 C下有时表现出star活性，常用30 C单切。
切。
3. 酶切底物DNA ,切不开1 ）底物DNA±没有相应的限制酶识别位点，或酶切位点被甲基化。
NEB保护碱基-各种酶切位点保护碱基
NEB保护碱基-各种酶切位点保护碱基PCR设计引物时酶切位点的保护酶寡核苷酸序列切割率%2 hr20 hrAcc I G GTCGAC CCG GTCGAC CGCCG GTCGAC CGG 0Afl III C ACATGT GCC ACATGT GGCCC ACATGT GGG>90>90>90>90Asc I GGCGCGCCA GGCGCGCC TTT GGCGCGCC AA >90>90>90>90>90>90Ava I C CCCGGG GCC CCCGGG GGTCC CCCGGG GGA50>90>90>90>90>90BamH I C GGATCC G10>90>9025>90>90Bgl II C AGATCT GGA AGATCT TCGGA AGATCT TCC7525>90>90BssH II G GCGCGC CAG GCGCGC CTTTG GCGCGC CAA50>90BstE II G GGT(A/T)ACC C010BstX I AACTGCAGAA CCAATGCATTGG AAAACTGCAG CCAATGCATTGG AA CTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT 252550>90Cla I C ATCGAT GG ATCGAT CCC ATCGAT GGCCC ATCGAT GGG>9050>9050CG GAATTC CGCCG GAATTC CGG >90 >90>90>90>90>90Hae III GG GGCC CC AGC GGCC GCT TTGC GGCC GCAA >90 >90>90>90>90>90Hind III C AAGCTT G CC AAGCTT GGCCC AAGCTT GGG1075Kpn I G GGTACC C GG GGTACC CCCGG GGTACC CCG>90>90>90>90Mlu I G ACGCGT CCG ACGCGT CG2550Nco I C CCATGG G CATG CCATGG CATG 50Nde I C CATATG GCC CATATG GGCGC CATATG GCGGGGTTT CATATG AAACCCGGAATTC CATATG GAATTCC GGGAATTC CATATG GAATTCCC7575>90>90Nhe I G GCTAGC CCG GCTAGC CGCTA GCTAGC TAG10102550Not I TT GCGGCCGC AAATTT GCGGCCGC TTTAAAATAT GCGGCCGC TATAAA ATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTAT AAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA 10102525101090>90Nsi I TGC ATGCAT GCACCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT10>90Pac I TTAATTAAG TTAATTAA CCC TTAATTAA GG 025>90Pme I GTTTAAACG GTTTAAAC CGG GTTTAAAC CCAGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG 752550>90Pst I G CTGCAG CTGCA CTGCAG TGCAAA CTGCAG AACCAATGCATTGG AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA CTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT 10>90>9010>90>90Pvu I C CGATCG GAT CGATCG ATTCG CGATCG CGA102510Sac I C GAGCTC G1010Sac II G CCGCGG CTCC CCGCGG GGASal I GTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA10105075Sca I G AGTACT CAAA AGTACT TTT 10752575Sma I CCCGGGC CCCGGG GCC CCCGGG GGTCC CCCGGG GGA10>90101050>90Spe I G ACTAGT CGG ACTAGT CCCGG ACTAGT CCGCTAG ACTAGT CTAG 1010>90>905050Sph I G GCATGC CCAT GCATGC ATGStu I A AGGCCT TGA AGGCCT TCAAA AGGCCT TTT >90 >90>90>90>90>90Xba IC TCTAGA GGC TCTAGA GCTGC TCTAGA GCA CTAG TCTAGA CTAG >907575>90>90>90Xho I C CTCGAG G CC CTCGAG GG CCG CTCGAG CGG 10102575Xma I C CCCGGG G CC CCCGGG GG CCC CCCGGG GGG TCCC CCCGGG GGGA>90注释：1．如果要加在序列的5’端，就在酶切位点识别碱基序列（红⾊）的5’端加上相应的碱基（⿊⾊），相同如果要在3’端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红⾊）的3’端加上相应的碱基（⿊⾊）。
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PCR设计引物时酶切位点的保护切割率%酶寡核苷酸序列2 hr20 hrAcc I G GTCGAC CCG GTCGAC CGCCG GTCGAC CGG 0Afl III C ACATGT GCC ACATGT GGCCC ACATGT GGG>90>90>90>90Asc I GGCGCGCCA GGCGCGCC TTT GGCGCGCC AA >90>90>90>90>90>90Ava I C CCCGGG GCC CCCGGG GGTCC CCCGGG GGA50>90>90>90>90>90BamH I C GGATCC GCG GGATCC CGCGC GGATCC GCG10>90>9025>90>90Bgl II C AGATCT GGA AGATCT TCGGA AGATCT TCC7525>90>90BssH II G GCGCGC CAG GCGCGC CTTTG GCGCGC CAA50>90BstE II G GGT(A/T)ACC C010BstX I AACTGCAGAA CCAATGCATTGGAAAACTGCAG CCAATGCATTGG AACTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT252550>90Cla I C ATCGAT GG ATCGAT CCC ATCGAT GGCCC ATCGAT GGG>9050>9050EcoR I G GAATTC CCG GAATTC CG >90>90>90>90CCG GAATTC CGG>90>90Hae III GG GGCC CCAGC GGCC GCTTTGC GGCC GCAA >90>90>90>90>90>90Hind III C AAGCTT GCC AAGCTT GGCCC AAGCTT GGG1075Kpn I G GGTACC CGG GGTACC CCCGG GGTACC CCG>90>90>90>90Mlu I G ACGCGT CCG ACGCGT CG2550Nco I C CCATGG GCATG CCATGG CATG5075Nde I C CATATG GCC CATATG GGCGC CATATG GCGGGGTTT CATATG AAACCCGGAATTC CATATG GAATTCCGGGAATTC CATATG GAATTCCC7575>90>90Nhe I G GCTAGC CCG GCTAGC CGCTA GCTAGC TAG10102550Not I TT GCGGCCGC AAATTT GCGGCCGC TTTAAAATAT GCGGCCGC TATAAAATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTATAAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA10102525101090>90Nsi I TGC ATGCAT GCACCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT10>90>90>90Pac I TTAATTAAG TTAATTAA CCC TTAATTAA GG 025>90Pme I GTTTAAACG GTTTAAAC CGG GTTTAAAC CC 02550AGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG75>90Pst I G CTGCAG CTGCA CTGCAG TGCAAA CTGCAG AACCAATGCATTGGAAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAACTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT10>90>9010>90>90Pvu I C CGATCG GAT CGATCG ATTCG CGATCG CGA102510Sac I C GAGCTC G1010Sac II G CCGCGG CTCC CCGCGG GGA50>90Sal I GTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGGACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA10105075Sca I G AGTACT CAAA AGTACT TTT 10752575Sma I CCCGGGC CCCGGG GCC CCCGGG GGTCC CCCGGG GGA10>90101050>90Spe I G ACTAGT CGG ACTAGT CCCGG ACTAGT CCGCTAG ACTAGT CTAG 1010>90>905050Sph I G GCATGC CCAT GCATGC ATGACAT GCATGC ATGT102550Stu I A AGGCCT TGA AGGCCT TCAAA AGGCCT TTT >90>90>90>90>90>90Xba I C TCTAGA GGC TCTAGA GCTGC TCTAGA GCACTAG TCTAGA CTAG>907575>90>90>90Xho I C CTCGAG GCC CTCGAG GGCCG CTCGAG CGG10102575Xma I C CCCGGG GCC CCCGGG GGCCC CCCGGG GGGTCCC CCCGGG GGGA2550>9075>90>90注释：1．如果要加在序列的5’端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3’端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。
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EcoRI
CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG GGGGCCCC
HaeIII
AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA
HindII I
CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG GGGTACCC
KpnI
GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG
MluI
GACGCGTC CGACGCGTCG CCCATGGG CATGCCATGGCATG CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC GGCTAGCC
0 50 0 75 0 0 0 0 >90 >90 0 25 50 0 10 10 90 >90
NcoI
NdeI
NheI
CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA
NotI
AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA
8 10 12 9 22 24 27
0 0 50 0 0 25 25
0 0 >9 0 10 0 50 >9 0 0 0 >9 0 50
CATCGATG ClaI GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG Chain Length 8 10 12 8 10 12 8 10 12 8 10 12
14 22 24 26 8 10 12 8 8 12 28 30 32 8 12 6 8 10 12 Chain
10 >90 >90 0 0 10 0 10 0 50 0 10 10 10 75 0 0 10 >90
10 >90 >90 0 0 25 10 10 0 >90
% Cleavage 2 hr 10 10 0 0 0 0 10 >90 20 hr >90 >90 50 50 0 25 50 >90
Enzyme
Oligo Sequence
Lengt h
GACTAGTC SpeI GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG GGCATGCC SphI CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT StuI AAGGCCTT
NEB 公司提供的保护碱基序列表：
% Enzyme Oligo Sequence Chain Length 2 hr GGTCGACC AccI CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 12 0 0 0 Cleavage 20 hr 0 0 0 0 CACATGTG AflIII CCACATGTGG CCCACATGTGGG 8 10 12 0 >90 >90 >9 0 >9 0 >9 GGCGCGCC AscI AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 8 10 12 >90 >90 >90 0 >9 0 >9 0 >9 CCCCGGGG AvaI CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 8 10 12 50 >90 >90 0 >9 0 >9 0 25 CGGATCCG BamHI CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG 8 10 12 10 >90 >90 >9 0 >9 0 BglII CAGATCTG GAAGATCTTC 8 10 0 75 0 >9
GGAAGATCTTCC
12
25
0 >9 0
GGCGCGCC BssHII AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA BstEII GGGT(A/T)ACCC AACTGCAGAACCAATGCATTGG BstXI AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
PstI
GCTGCAGC
TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT CCGATCGG PvuI ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA SacI SacII CGAGCTCG GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC SalI GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGG AA ScaI GAGTACTC AAAAGTACTTTT CCCGGG SmaI CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA
8 8 10 12
0 0 >90 50 % Cleavage 2 hr >90 >90 >90 >90 >90 >90 0 0 10 0 >90 >90 20 hr >90 >90 >90 >90 >90 >90 0 0 75 0 >90 >90
Enzyme
Oligo Sequence GGAATTCC
8 10 12 14 8 12 14 8
GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT CTCTAGAG XbaI GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG CCTCGAGG XhoI CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG CCCCGGGG XmaI CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA
8 10 8 14 8 10 12 18 20 22 8 10 12 12 16 20 24 28 Chain Length 12 22 8 10 12 8 10 12 24 8 2 hr 10 >90 0 0 0 0 0 0 75 0
0 25 0 50 0 0 0 0 75 75 0 10 10 0 10 10 25 25 % Cleavage
10 12 8 10 12 14 8 10 12 8 10 12 14
>90 >90 0 >90 75 75 0 10 10 0 25 50 >90
>90 >90 0 >90 >90 >90 0 25 75 0 75 >90 >90
Enzyme
Oligo Sequence
20 hr >90 >90 0 25 >90 0 25 50 >90 0
NsiI
TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT TTAATTAA
PacI
GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG GTTTAAAC
PmeI
GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG