表面等离子共振SPR技术与Biacore原理
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SPR 生物传感技术的应用领域
❖生物大分子的相互作用： ❖肿瘤研究 ❖免疫学和传染病 ❖神经科学 ❖生物制药 ❖蛋白质组学
Biacore可研究的生物分子范围
❖蛋白质 ❖DNA/RNA ❖脂类 /脂质体/ 生物膜 ❖多糖 ❖多肽 ❖小分子 ❖全细胞/病毒/微生物
可分析的对象
Biacore核心组件
❖ 可以从反射光强响应曲线看到一个最小的尖峰，此时对应 的入射光波长为共振波长，使反射光完全消失的入射角就 是SPR角。SPR角随金膜表面折射率变化而变化，而折射 率的变化又与金膜表面结合的分子质量成正比。因此可以 通过对生物反应过程中SPR角的动态变化获取分子之间相 互作用的特异信号。
SPR生物传感器
表面等离子共振 (SPR) 技术与 Biacore原理
戴璐
表面等离子共振 (SPR)原理
❖ 表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance, SPR) ❖ 消逝波：当光从光密介质射入光疏介质，入射角增大
到某一角度，使折射角达到90°时，折射光将完全消 失，而只剩下反射光，这种现象叫做全反射。 ❖ 当以波动光学的角度 来研究全反射时，人们发现当入 射光到达界面时并不是直接产生反射光，而是先透过 光疏介质约一个波长的深度，再沿界面流动约半个波 长再返回光密介质。则透过光疏介质的波被称为消逝 波。
表面等离子共振 (SPR)原理
❖ 等离子波：把金属表面的价电子看成是均匀正电荷背景下 运动的电子气体，其中正、负带电粒子数目几乎相等，这 实际上也是一种等离子体。当金属受电磁干扰时，金属内 部的电子密度分布会变得不均匀。因为库仑力的存在，会 将部分电子吸引到正电荷过剩的区域，被吸引的电子由于 获得动量，故不会在引力与斥力的平衡位置停下而向前运 动一段距离，之后电子间存在的斥力会迫使已经聚集起来 的电子再次离开该区域。由此会形成一种整个电子系统的 集体震荡，而库仑力的存在使得这种集体震荡反复进行， 进而形成的震荡称等离子震荡，并以波的形式表现，称为 等离子波。
❖ SPR生物传感器的光源为偏振光(polarized light),传感芯片 (sensor chip)表面镀有一层金膜,实验时,先将一种生物分 子 (ligand) 固 定 在 金 膜 表 面 , 然 后 将 与 之 相 互 作 用 的 分 子 (analyte)溶于溶液(或混合液)流过芯片表面。SPR检测器 能跟踪溶液中的分子与芯片表面的分子结合、解离整个过 程的变化,不同角度的反射光的光强被记录后得到角度-光 强曲线图,每条曲线的波谷即为该曲线的共振角,共振角对 应的角度为共振信号(resonance signal),时间与对应共振 信号的曲线即为SPR传感图(sensorgram)。
SPR生物传感器
❖ 以免疫学分析为例,在金膜表面固定某种受体(如抗 体),然后流过含相应配体(如抗原)的样品,配体与受 体的结合将使金膜与溶液界面的折射率上升,从而 导致共振角发生变化。为了表述的方便,共振角(或 共振信号)可以用共振单位(resonance units,RU) 来表示。对大多数生物分子而言,1000RU大约等 于1mm2的面积上有1ng的质量变化，相当于溶液 中蛋白浓度为6mg/ml。SPR生物传感器通过检测 获得共振角的改变程度,便可以对配体浓度进行定 量。
❖分析物 (Analyte)进样后，以恒定的流速和 浓度流过芯片表面
❖样品中的待分析物与固定在芯片表面上的 配体发生结合，芯片表面物质的质量发生 改变，仪器记录下对应的响应值 (response) 的改变
❖进样结束后，切换缓冲液流过芯片表面， 分析物由配体上自发解离，解离的进程由 响应值实时监控。
❖ 30余种不同的试剂盒及缓冲液产品 ： ❖ 氨基偶联试剂盒、巯基偶联试剂盒； GST捕获试剂盒 GST重组蛋白
分析； NTA捕获试剂盒 His 重组蛋白分析；
最常用的传感芯片：CM5传感芯片
Biacore实验的基本流程
分析物和配体的定义
固定配体 (Immobilization)：
样品进样 (Injection)
Biacore提供的生物分子相互作用信息：
❖有无结合 (Yes or No) ❖结合的特异性和选择性 (Specificity) ❖两种分子的结合强度 --亲和力 (Affinity) ❖结合和解离的快慢和复合体的稳定性 --动力学
(Kinetics) ❖ 功能复合体形成的参与者、协同者和组装顺序
Fc3-Fc4)
传感芯片
传感芯片
葡聚糖表面
❖亲水性 ❖温和型: 和2%浓度的葡聚糖水溶液环境相
似 ❖非特异性结合量低 ❖高结合容量 ❖易于进行共价结合 ❖出色的化学稳定性
传感芯片的选择
❖ 11种不同的芯片种类 ❖ CM5, CM4, CM3：芯片 蛋白、肽段、小分子等 ❖ CM7：小分子化合物研究 ❖ SA芯片：生物素标记的分子，如核酸、糖类等 ❖ Biotin CAP芯片：可逆性生物素捕获芯片 ❖ NTA芯片：His重组蛋白 ❖ L1 芯片：模拟脂质双分子层环境 ❖ HPA芯片：实现膜系统相关的互作分析 ❖ C1芯片：研究细胞、病毒等大颗粒分子 ❖ Au裸金芯片：客户定制表面（材料、高分子等）
(Mechanism) ❖分子结合的温度与热力学特征 (Thermodynamics) ❖目标分子活性含量的检测 (Concentration)
SPR光学组件
微流控系统(IFC)
❖集成化、自动化的微流路控制系统 ❖样品消耗量低 ❖为互相作用分析而设计优化
微流控系统 (IFC)–流动池
❖IFC上有4个流动池 ❖可选择单独、配对、串联使用。 ❖流动池为配对使用进行了优化(Fc1-Fc2,
表面等离子共振 (SPR)原理
❖ SPR光学原理：光在棱镜与金属膜表面上发生全反射现象 时，会形成消逝波进入到光疏介质中，而在介质 中又存 在一定的等离子波。当两波相遇时可能会发生共振。当消 逝波与表面等离子波发生共振时，检测到的反射光强会大 幅度地减弱。能量从光子转移到表面等离子，入射光的大 部分能量被表面等离子波吸收，使反射光的能量急剧减少。
SPR 生物传感技术的应用领域
❖生物大分子的相互作用： ❖肿瘤研究 ❖免疫学和传染病 ❖神经科学 ❖生物制药 ❖蛋白质组学
Biacore可研究的生物分子范围
❖蛋白质 ❖DNA/RNA ❖脂类 /脂质体/ 生物膜 ❖多糖 ❖多肽 ❖小分子 ❖全细胞/病毒/微生物
可分析的对象
Biacore核心组件
❖ 可以从反射光强响应曲线看到一个最小的尖峰，此时对应 的入射光波长为共振波长，使反射光完全消失的入射角就 是SPR角。SPR角随金膜表面折射率变化而变化，而折射 率的变化又与金膜表面结合的分子质量成正比。因此可以 通过对生物反应过程中SPR角的动态变化获取分子之间相 互作用的特异信号。
SPR生物传感器
表面等离子共振 (SPR) 技术与 Biacore原理
戴璐
表面等离子共振 (SPR)原理
❖ 表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance, SPR) ❖ 消逝波：当光从光密介质射入光疏介质，入射角增大
到某一角度，使折射角达到90°时，折射光将完全消 失，而只剩下反射光，这种现象叫做全反射。 ❖ 当以波动光学的角度 来研究全反射时，人们发现当入 射光到达界面时并不是直接产生反射光，而是先透过 光疏介质约一个波长的深度，再沿界面流动约半个波 长再返回光密介质。则透过光疏介质的波被称为消逝 波。
表面等离子共振 (SPR)原理
❖ 等离子波：把金属表面的价电子看成是均匀正电荷背景下 运动的电子气体，其中正、负带电粒子数目几乎相等，这 实际上也是一种等离子体。当金属受电磁干扰时，金属内 部的电子密度分布会变得不均匀。因为库仑力的存在，会 将部分电子吸引到正电荷过剩的区域，被吸引的电子由于 获得动量，故不会在引力与斥力的平衡位置停下而向前运 动一段距离，之后电子间存在的斥力会迫使已经聚集起来 的电子再次离开该区域。由此会形成一种整个电子系统的 集体震荡，而库仑力的存在使得这种集体震荡反复进行， 进而形成的震荡称等离子震荡，并以波的形式表现，称为 等离子波。
❖ SPR生物传感器的光源为偏振光(polarized light),传感芯片 (sensor chip)表面镀有一层金膜,实验时,先将一种生物分 子 (ligand) 固 定 在 金 膜 表 面 , 然 后 将 与 之 相 互 作 用 的 分 子 (analyte)溶于溶液(或混合液)流过芯片表面。SPR检测器 能跟踪溶液中的分子与芯片表面的分子结合、解离整个过 程的变化,不同角度的反射光的光强被记录后得到角度-光 强曲线图,每条曲线的波谷即为该曲线的共振角,共振角对 应的角度为共振信号(resonance signal),时间与对应共振 信号的曲线即为SPR传感图(sensorgram)。
SPR生物传感器
❖ 以免疫学分析为例,在金膜表面固定某种受体(如抗 体),然后流过含相应配体(如抗原)的样品,配体与受 体的结合将使金膜与溶液界面的折射率上升,从而 导致共振角发生变化。为了表述的方便,共振角(或 共振信号)可以用共振单位(resonance units,RU) 来表示。对大多数生物分子而言,1000RU大约等 于1mm2的面积上有1ng的质量变化，相当于溶液 中蛋白浓度为6mg/ml。SPR生物传感器通过检测 获得共振角的改变程度,便可以对配体浓度进行定 量。
❖分析物 (Analyte)进样后，以恒定的流速和 浓度流过芯片表面
❖样品中的待分析物与固定在芯片表面上的 配体发生结合，芯片表面物质的质量发生 改变，仪器记录下对应的响应值 (response) 的改变
❖进样结束后，切换缓冲液流过芯片表面， 分析物由配体上自发解离，解离的进程由 响应值实时监控。
❖ 30余种不同的试剂盒及缓冲液产品 ： ❖ 氨基偶联试剂盒、巯基偶联试剂盒； GST捕获试剂盒 GST重组蛋白
分析； NTA捕获试剂盒 His 重组蛋白分析；
最常用的传感芯片：CM5传感芯片
Biacore实验的基本流程
分析物和配体的定义
固定配体 (Immobilization)：
样品进样 (Injection)
Biacore提供的生物分子相互作用信息：
❖有无结合 (Yes or No) ❖结合的特异性和选择性 (Specificity) ❖两种分子的结合强度 --亲和力 (Affinity) ❖结合和解离的快慢和复合体的稳定性 --动力学
(Kinetics) ❖ 功能复合体形成的参与者、协同者和组装顺序
Fc3-Fc4)
传感芯片
传感芯片
葡聚糖表面
❖亲水性 ❖温和型: 和2%浓度的葡聚糖水溶液环境相
似 ❖非特异性结合量低 ❖高结合容量 ❖易于进行共价结合 ❖出色的化学稳定性
传感芯片的选择
❖ 11种不同的芯片种类 ❖ CM5, CM4, CM3：芯片 蛋白、肽段、小分子等 ❖ CM7：小分子化合物研究 ❖ SA芯片：生物素标记的分子，如核酸、糖类等 ❖ Biotin CAP芯片：可逆性生物素捕获芯片 ❖ NTA芯片：His重组蛋白 ❖ L1 芯片：模拟脂质双分子层环境 ❖ HPA芯片：实现膜系统相关的互作分析 ❖ C1芯片：研究细胞、病毒等大颗粒分子 ❖ Au裸金芯片：客户定制表面（材料、高分子等）
(Mechanism) ❖分子结合的温度与热力学特征 (Thermodynamics) ❖目标分子活性含量的检测 (Concentration)
SPR光学组件
微流控系统(IFC)
❖集成化、自动化的微流路控制系统 ❖样品消耗量低 ❖为互相作用分析而设计优化
微流控系统 (IFC)–流动池
❖IFC上有4个流动池 ❖可选择单独、配对、串联使用。 ❖流动池为配对使用进行了优化(Fc1-Fc2,
表面等离子共振 (SPR)原理
❖ SPR光学原理：光在棱镜与金属膜表面上发生全反射现象 时，会形成消逝波进入到光疏介质中，而在介质 中又存 在一定的等离子波。当两波相遇时可能会发生共振。当消 逝波与表面等离子波发生共振时，检测到的反射光强会大 幅度地减弱。能量从光子转移到表面等离子，入射光的大 部分能量被表面等离子波吸收，使反射光的能量急剧减少。