酶活性测定
酶活性和质量测定方法及其评价
1.酶活性测定方法（1）按反应时间分类法：20世纪50年代以前大都使用固定时间法。
这种方法是以酶催化反应的平均速度来计算酶的活性，现多已不用。
50年代中期开始采用连续监测法。
这种方法用自动生化分析仪上完成，可以测酶反应的初速度，其结果远比固定时间法准确，在高浓度标本尤为明显，但本法也受到反应时间，反应温度，试剂等的影响，应加以注意。
1）定时法：通过测定酶反应开始后某一时间段内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法，称为两点法，其中t1往往取反应开始的时间。
在酶反应一定时间后，往往通过加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等，使反应完全停止，所以也叫中止反应法。
2）连续监测法：又称为动力学法或速率法、连续反应法。
在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。
3）平衡法：通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法，又叫终点法。
（2）按监测方法分类法：可分为①分光光度法；②旋光法；
③荧光法；④电化学方法；⑤化学反应法；⑥核素测定法；⑦量热法。
2.酶质量测定法随着免疫技术的发展，出现了利用酶的抗原性，通过抗原、抗体反应来直接测定酶的质量，直接用质量单位ng／ml、μg／L来表示酶含量的高低。
免疫学方法与测定活性方法相比，其优点是灵敏度和特异性高，不受体液中其他物质的影响，特别是抑制剂和激活剂的影响，当血液中有酶抑制剂存在，或因基因缺陷，合成了无活性的酶蛋白时，可以测出灭活的酶蛋白量，有利于疾病诊断和科学研究。
如肌酸激酶同酶MB（CKMB）质量测定较活性测定对疾病的诊断价值高。
酶活性测定实验室标准操作规程
酶活性测定实验室标准操作规程
1. 引言
本标准操作规程旨在确保酶活性测定实验室操作的准确性和一
致性。
该实验室用于测定酶的活性，以评估其催化反应速率，为进
一步研究和应用提供依据。
2. 实验室准备
- 确保实验室环境清洁整洁，排除干扰因素。
- 准备所需试剂、仪器和设备，并进行校准和验证。
3. 样品准备
- 按照实验要求准备待测酶样品。
- 保持样品的完整性和稳定性，避免污染和损伤。
4. 实验步骤
4.1 样品稀释
- 使用适当的缓冲液稀释待测酶样品，以达到合适的测试范围。
4.2 酶活性测定
- 将稀释后的样品与适当的底物混合，并按照预定的反应时间进行反应。
- 使用光谱仪、荧光仪或其他相关仪器测定反应产物的生成情况。
4.3 数据处理
- 记录实验过程中所有操作的详细信息。
- 根据实验结果计算酶的活性，并进行数据统计和分析。
5. 质量控制
- 定期进行实验室内部质量控制，包括使用质检样品进行标准曲线校准和验证。
- 确保实验操作符合质量管理体系要求。
6. 安全注意事项
- 遵守实验室的安全规定，包括佩戴适当的个人防护装备。
- 确保试剂的正确使用和储存，避免有害物质的暴露和泄漏。
7. 结论
本标准操作规程为酶活性测定实验室提供了一套明确的操作指南，用于确保实验操作的准确性和一致性。
遵循该规程可提高实验结果的可靠性，并为进一步研究和应用提供有力支持。
酶活性的测定
式中
A—对照KMnO4滴定毫升数； B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；
VT—酶液总量（ml）； V1—反应所用酶液量（ml）;
W—样品鲜重（g）；
1.7mg
1.7—1ml H2O2。
0.1mol/L旳KMnO4相当于
紫外分光光度法:
H化测2O氢量2在，吸2使光40反率nm应旳波溶变长液化下吸速有光度强度即烈可(吸A测2收40出)，随过过反氧氧应化化时氢氢间酶酶而旳能降活分低性解。。过根氧据 以1min内A240降低0.1旳酶量为1个酶活单位（u）。
硫酸盐缓冲液，盐酸羟胺，黄嘌呤，黄嘌 呤氧化酶，醋酸等。
试验环节：
计算措施：
每毫升反应液中SOD 抑止率达50％时相应 旳SOD 量为一种SOD 活力单位（U），待测 样品中旳SOD 活力由下式计算：
SOD克制率（％）＝（A2-A1）/A2×100% SOD 活力（U/ml）＝（A2-A1）
据此，可根据H2O2旳消耗量或O2旳生成量测定该酶活力大小。 在反应系统中加入一定量（反应过量）旳H2O2溶液，经酶促反 应后，用原则高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多出旳H2O2
。
即可求出消耗旳H2O2旳量。
酶表活达性 ：用每克鲜重样品1min内分解H2O2旳毫克数
酶活(mgH2O2/gFW·min)=
测定茶树鲜叶APX活性旳最佳条件
PVPP旳加入量为鲜叶重旳1.5倍，提取液pH 为7.8，反应液pH为7.0，底物AsA浓度为 0.5mmol/L。
注意事项：
（1）因为测定反应是经过加液量控制在60s内，使产生旳A290光值下 降呈良好旳线性关系。
1.试剂： 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液
(pH8.2
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法有多种。
以下列举了常见的几种方法：
1. 酶动力学法：通过测定酶催化底物转化为产物的速率，来确定酶活性。
常用的酶动力学方法有初始速率法、双重倒数法、利用酶反应速率与底物浓度的关系等。
2. 比色法：利用酶与底物反应后产生的色素变化进行酶活性测定。
例如，过氧化物酶活性可通过测量其催化产生的有色产物浓度的变化来确定。
3. 荧光法：利用酶与底物反应后产生的荧光变化进行酶活性测定。
荧光法的灵敏度高，操作简便。
例如，酯酶活性可通过测量底物转化为产物后产生的荧光强度的变化来确定。
4. 放射性同位素法：将放射性同位素标记在底物上，通过测量酶催化底物与同位素的结合来确定酶活性。
例如，放射性同位素法可用于测定DNA聚合酶活性。
5. 电化学法：利用酶与底物反应后产生的电流变化进行酶活性测定。
常用的电化学方法包括循环伏安法和电化学阻抗法。
例如，葡萄糖氧化酶活性可通过测量产生的电流与葡萄糖浓度之间的关系来确定。
值得注意的是，不同酶具有不同的理化性质和催化机制，因此需要根据具体酶的
特性选择适合的测定方法。
酶的测定方法
酶的测定方法酶是一种生物催化剂，广泛应用于医药、食品、化工等领域。
酶的测定方法是评价酶活性的重要手段。
目前常用的酶测定方法有光度法、荧光法、比色法、电化学法等。
光度法是一种常用的酶测定方法。
该方法利用酶催化反应产生的物质吸收或发射光线的特性来测定酶活性。
例如，酶催化反应产生的NADH可以吸收340nm波长的紫外线光线，因此可以通过测定吸光度来评价酶活性。
光度法具有灵敏度高、操作简便等优点，但也存在一定的局限性，如受到其他物质的干扰等。
荧光法是一种新兴的酶测定方法。
该方法利用酶催化反应产生的荧光物质的特性来测定酶活性。
例如，酶催化反应产生的ATP可以发射荧光，因此可以通过测定荧光强度来评价酶活性。
荧光法具有灵敏度高、特异性强等优点，但也存在一定的局限性，如需要特殊的荧光探针等。
比色法是一种常用的酶测定方法。
该方法利用酶催化反应产生的物质的特性来测定酶活性。
例如，酶催化反应产生的葡萄糖可以与某些试剂发生比色反应，因此可以通过测定比色强度来评价酶活性。
比色法具有操作简便、成本低等优点，但也存在一定的局限性，如受到其他物质的干扰等。
电化学法是一种新兴的酶测定方法。
该方法利用酶催化反应产生的电化学信号的特性来测定酶活性。
例如，酶催化反应产生的电子可以通过电极传递，因此可以通过测定电流或电势来评价酶活性。
电化学法具有灵敏度高、特异性强等优点，但也存在一定的局限性，如需要特殊的电极等。
综上所述，酶的测定方法有多种，每种方法都有其优缺点。
在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的测定方法。
同时，还需要注意测定条件的控制，以保证测定结果的准确性和可重复性。
酶活性测定方法
酶活性测定1、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠）0.2mol/L 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液(pH: 9.6)——buffer0.2mol/L NaOH测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min；(3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
计算：每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。
[(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.704 (Eu)2、酸性磷酸酶(Acid phosphatase)试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠）0.2mol/L HAc/Ac缓冲溶液(pH: 4.8)——buffer0.2mol/L NaOH测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min；(3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
计算：每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。
[(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.719 (Eu)3、a-葡萄糖甘酶(a-glucosidase)试剂：0.1% p-nitrophenyl a-D glucopyranoside（p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷）0.2mol/L Tris-HCl (pH: 7.6)测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷及Tris-HCl 37°C 孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL 0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷+2mL Tris-HCl 37°C孵化60 min；(3) 沸水加热3min 终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
酶活性实验报告
酶活性实验报告实验目的：掌握测定酶活性的方法，了解影响酶活性的因素。
实验原理：酶是生物体内一类具有生物催化作用的大分子有机化合物，是生命活动中极为重要的一类物质。
酶的催化作用对于维持生命活动有着不可替代的作用。
酶活性是指酶在一定条件下的催化作用程度的大小。
酶活性是与温度、pH值、酶浓度等多种因素有关的，我们通常采用酶活性测定来研究它们之间的关系。
实验材料：1.蛋白酶酵素;2.2%鱼胆汁液;3.0.1mol/L酸性淀粉酶溶解液;4.0.1mol/L蒸馏水;5.0.1mol/L氢氧化钠;6.四分之一玻璃片。
实验过程：1.将试液2.5mL加入玻璃管中；2.将一枚四分之一的玻璃片浸泡在试管中，并在37℃恒温水浴中孵育10分钟；3.取出玻璃片并观察其表面保留的液体厚度确定其所含淀粉的量；4.将玻璃片放入蒸馏水中清洗干净；5.重复上述步骤并将试液改为酵素水解液，记录结果；6.重复上述步骤并将试液改为鱼胆汁液水解液，记录结果。
实验结果：根据实验记录，可以计算出不同试液在相同条件下对淀粉的酶解率，运用公式E=ΔA/(Δt*V)求出酶活力。
实验分析：通过此次实验可以看出，在不同的试液中酶活力的差异性较大，说明酶活性与酶的种类有关。
同时，在不同温度、pH值等条件下酶活性也会有所不同，反映在实验结果上，也就是影响实验结果的误差。
实验结论：酵素水解液的酶活力最大，鱼胆汁液水解液的次之，而0.1mol/L酸性淀粉酶溶解液的酶活力最小。
相同的温度和时间下，不同的试液酶活力差异明显，不同的试液酶活性与其所含的主要成分有关。
酶活测定原理
酶活测定原理酶活测定是通过测定酶反应产物生成的物质量或反应速率来确定酶活性的一种方法。
这种测试被广泛应用于生物、医学、环境和食品科学领域。
本文将重点介绍酶活测定的原理和方法。
一、酶的定义和分类酶是一类具有催化生物反应能力的蛋白质，在生物体内担任调节代谢过程的重要角色。
酶的活性被认为是其特异性、选择性和效率的关键因素。
酶根据其催化反应类型，可以分为六类：1. 氧化还原酶：例如过氧化物酶和葡萄糖氧化酶，可以将还原剂氧化成相应的氧化物。
2. 转移酶：例如乙醛酸酯酶和谷氨酰胺转移酶，可以将一个基团从一个分子转移到另一个分子。
3. 加水酶：例如酯酶和葡萄糖苷酶，可以加入水分子切断化学键。
4. 合成酶：例如DNA聚合酶和RNA聚合酶，可以将单体结合成聚合物。
5. 裂解酶：例如蛋白酶和纤维蛋白溶解酶，可以降解大分子化合物。
6. 引导酶：例如酰基载体蛋白，可以在代谢过程中向该蛋白基团上结合或从该基团上解离。
二、酶活测定的原理酶活性通常通过测量酶反应的速率来评估。
酶反应速率与底物浓度、酶浓度、反应温度和pH值等条件有关。
在酶活测定中，这些条件必须被控制和标准化。
测量酶活性可以通过直接测量酶反应产物生成的量或测量反应底物消耗的量来进行。
下面介绍常用的酶活测定方法。
1. 进行光学密度测定酶活测定可以通过光学测量来实现。
在酯类水解反应中，酶催化酯水解为醇和羧酸。
在这种反应中，测量分离的醇透过率或吸光度变化，可以计算出相应的反应产物含量。
这种方法可以适用于其他酶反应，例如测定酒精脱氢酶催化的乙醛氧化反应。
2. 进行电化学测定另一种常用的酶活测定方法是电动势测定。
该方法用于测量电位差的变化以检测酶催化反应过程中电子的流动。
在氧化还原酶催化的反应中，测量体系中的电位差可以告诉我们酶的活性程度。
3. 进行放射性测定有些酶活性测定需要使用放射性示踪剂。
在DNA聚合酶催化下进行DNA复制实验中，可以使用放射性示踪剂来测量酶反应产物的数量。
酶活力测定实验报告
酶活力测定实验报告一、实验目的酶活力测定实验的主要目的是了解酶的活性及其影响因素，掌握测定酶活力的基本方法和原理，以及学会使用相关仪器和试剂进行实验操作。
二、实验原理酶是生物体内具有催化作用的蛋白质或核酸。
酶活力是指酶催化一定化学反应的能力，通常用在一定条件下酶催化反应的速度来表示。
本实验采用分光光度法测定酶活力，其原理是基于酶催化反应所产生的产物在特定波长下具有光吸收特性，通过测定反应体系在该波长下吸光度的变化，可以计算出酶催化反应的速度，从而反映酶的活力。
以过氧化氢酶为例，过氧化氢酶能够催化过氧化氢分解为水和氧气。
在本实验中，通过加入一定量的过氧化氢溶液，使其与过氧化氢酶反应，然后使用高锰酸钾溶液滴定剩余的过氧化氢，根据高锰酸钾溶液的用量计算出过氧化氢酶的活力。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的猪肝或土豆等富含过氧化氢酶的组织。
过氧化氢溶液（3%）。
高锰酸钾溶液（002 mol/L）。
磷酸缓冲液（pH 70）。
2、实验仪器研钵。
离心机。
移液器。
分光光度计。
恒温水浴锅。
试管、量筒、容量瓶等玻璃仪器。
四、实验步骤1、酶液的制备称取新鲜的猪肝或土豆组织_____g，置于研钵中，加入适量的磷酸缓冲液（pH 70），研磨成匀浆。
将匀浆转移至离心管中，以_____rpm 的转速离心_____min，取上清液即为粗酶液。
2、酶活力的测定取_____支试管，分别标记为 1、2、3。
在 1 号试管中加入_____mL 磷酸缓冲液（pH 70）作为空白对照，在 2、3 号试管中分别加入_____mL 粗酶液。
向 1、2、3 号试管中分别加入_____mL 过氧化氢溶液（3%），立即摇匀，并同时开始计时。
在反应进行_____min 后，迅速向 1、2、3 号试管中分别加入_____mL 浓度为 2 mol/L 的硫酸溶液终止反应。
用移液器吸取_____mL 反应液，加入到另一支装有_____mL 高锰酸钾溶液（002 mol/L）的试管中，摇匀。
测定酶活的原理
测定酶活的原理
测定酶活的原理是基于酶与底物的特异性结合及催化活性。
一种常用的测定方法是通过测量底物转化为产物的速度来间接衡量酶的活性。
该方法的基本步骤包括：
1. 准备一定浓度的底物溶液，使其与酶反应时达到酶的最佳工作浓度。
2. 添加一定量的酶溶液到底物中，使它们充分混合。
3. 在一定时间间隔内，取出反应液样本，并停止反应，例如通过加入酸性或碱性溶液。
4. 采用一种合适的分析方法，如光度法、荧光法或电化学法，测定样本中产生的产物的浓度。
5. 根据样本中产物浓度的变化，计算出酶的活性，通常以单位时间内产生的产物量来表示。
此外，也可以采用其他方法来直接测定酶的活性，例如测定酶的催化反应速率常数（Kcat）、酶对底物的亲和力（Km）等。
这些方法需要更复杂的实验步骤和数据处理。
总的来说，测定酶活的原理就是利用酶对底物的催化作用，通过测量底物转化为产物的速度或其他相关参数来间接或直接衡量酶的活性水平。
酶活力的测定
4. 抑制剂和激活剂
抑制剂和激活剂是影 响酶活力的其他因素 。抑制剂会抑制酶的 活性，而激活剂则会 增强酶的活性。在测 定酶活力时，需要排 除抑制剂和激活剂的 影响，并进行适当的 样品处理和数据处理 以确保实验结果的准 确性
酶活力的测定
酶活力的测定
三、实验步骤与操作要点
酶活力测定的实验步骤包括样品准备、反应体系配制、温度控制、时间记录、产物或底物 浓度测定等。在操作过程中需要注意以下几点
酶活力是指酶催化特定化学反应的能力， 通常以单位时间内转换底物的摩尔数来 表示
通过测定酶活力，可以了解酶的性质、 作用机制以及底物特异性等方面的信息一、酶活力测 定的基本原理
酶活力测定的基本原 理是利用酶催化的化 学反应速率与酶浓度 成正比的性质，通过 测定反应速率来推算 酶的浓度和活力。常 用的方法有终点法、 动力学法和连续监测 法
酶活力测定结果受到多种因素 的影响，包括温度、pH值、底 物浓度、抑制剂和激活剂等。 为了获得准确的测定结果，需 要严格控制实验条件，并进行 适当的样品处理和数据处理
酶活力的测定
1. 温度
温度是影响酶活力的 重要因素之一。大多 数酶在一定的温度范 围内具有最佳活性， 温度过高或过低都会 影响酶的活性。因此 ，在测定酶活力时， 需要选择适当的温度 ，并进行温度控制以 确保实验结果的准确 性
酶活力的测定
四、时间记录
时间记录是酶活力测定的关键步骤之一。在酶促反应过程中，需要准确记录反应时间，以 便计算反应速率和产物生成量。在时间记录过程中，需要注意控制反应时间，避免过长或 过短的反应时间对实验结果的影响
酶活力的测定
五、产物或底物浓 度测定
产物或底物浓度的测定是酶活力 测定的关键步骤之一。通过测定 产物或底物的浓度，可以计算出 酶的活性。在浓度测定过程中， 需要注意选择适当的测定方法， 并进行准确的浓度计算。常用的 浓度测定方法有分光光度法、色 谱法等
酶活测定方法
酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
测定酶活性浓度的两大类方法
理论上的 V0 在实际工作中是不存在的，必须让酶和底物作用一段时间，消耗掉一 定量的底物，才能测出反应速度，一般说，如消耗底物在 5％内所测到的反应速度都 可认为是初速度，如底物浓度很高时，底物消耗在 20％以内的反应往往还在线性反应 期。
是不是所有类型的酶偶联反应都可用来测酶活性浓度？回答是否定的。因为测酶 的活性浓度是依据测定酶反应速度——△A/△t 或△B/△t 求出。在酶偶联法，此值 无法直接求出，而是通过测定指示酶反应△C/△t 间接求出，要使酶偶联法测得的酶 活性浓度准确可靠，则 Vind＝Vx。换言之，指示酶的最大反应速度必须等于或接近测 定酶的最大反应速度。
只有当反应如曲线 A 时，用“固定时间法”才能测出真实的酶活性，实际工作中 是很少见的，图中曲线 B 代表了最常见的反应情况，在一个很短的线性反应期后在大 部分测定期间内主要为非线性反应期。曲线 C 说明在测定期间包括了延滞期，曲线 D 则不仅包括了延滞期，还包括非线性期，在这些反应中如用固定时间法来测定，结果 是不够准确的，一般是偏低的，而且酶浓度愈高，偏离程度愈大。
从理论上说，用酶偶联反应测酶活性浓度时，最好条件应是测定酶反应为限速反 应。动力学上为零级反应，而指示酶为一级反应，酶反应速度与指示酶底物浓度相关。
（二）指示酶、辅助酶的种类和浓度
指示酶、辅助酶的种类：常规化验中常用的酶偶联法中，多以脱氢酶为指示酶， 在常规化验中的自动分析仪几乎无一例外都有 340nm 波长，通过 NAD(P)H 系统可以很 方便地监测到指示酶反应。但从理论上说，往往可以有不止一种偶联方法，只要设法 使偶联反应中最后一个是指示酶反应，前面已提到测 CK 可以正向逆向二个方向建立 二种不同酶偶联的反应。又如在丙氨酸转氨基酶（ALT）测定法中，正向反应后产生 丙酮酸和谷氨酶，目前最常用的是用乳酸脱氢酶与丙酮酸偶联反应，伴有 NADH 下降。 但也可以用谷氨酸脱氢酶与谷氨酸作用，伴有 NADH 生成。
酶活性测定
实验一植物抗氧化酶活性的测定植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等。
它们普遍存在于植物的各种组织中，可以通过催化植物体内的活性氧，防止发生氧化反应。
所以抗氧化酶活性与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系，经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。
一、超氧化物岐化酶活性测定超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（）的酶，它催化下列反应：2反应产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。
已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。
【原理】本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有可氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲。
后者在560nm处有最大吸收，而SOD可清除从而抑制了甲的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
一个酶活性单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50％）时所需的酶量，据此可以计算出酶活性大小。
【仪器与用具】高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx）；试管数支；黑色硬纸套。
【试剂】1．50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。
2．提取介质50mmol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮）。
3．130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称取1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml。
4．750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取61.33m g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml，现配先用，避光保存。
5．100μmol/L EDTA-Na2溶液：取37.21m g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。
6．20μmol/L核黄素溶液：取7.53m g核黄素定容至1000ml避光保存。
酶活性测定的主要影响因素及控制要点
和 K 可用校准物定期校正。
3.2 校准物
可用作酶活性测定用的校准物分两类。 一类是产物的基准物质，
如对硝基酚、对硝基苯胺等， 用于校准仪器的 值（摩尔吸光系数）。
另一类称酶校准物（Enzyme calibrator），
指样品先与缺乏某种底物的试剂1预孵育一定时 间后，再加入内这种底物的试剂2，开始启动样 品中的待测酶的酶促反应。
好处是在待测酶酶促反应开始之前，可以除去某 些干扰物，包括内源性干扰物和外源性干扰物。
这种模式需要双试剂剂型。
样品启动模式。
指反应所需的试剂先混合在一起，然后加入样品， 依靠样品中的待测酶来启动酶促反应；
酶的测定方法分为绝对定量法和相对定量法两大类，以后者 为主。
酶催化化学反应的能力称为酶活性（activity）。 酶活性浓度的测定受许多因素的影响。
酶活性浓度测定的主要影响因 素
1. 标本及标本采集和处理因素 2. 试剂及方法学因素 3. 仪器因素的影响 4. 测定条件与参数设置
1.标本及标本采集和处理因素 的影响及控制
常见的影响因素
2.1 定时法与连续监测法 2.2 检测底物或检测产物 2.3 底物启动模式与样品启动模式 2.4 正向反应与逆向反应 2.5 试剂的干扰作用
2. 影响因素的控制
选购试剂盒时
要仔细阅读试剂盒说明书； 了解试剂盒所用方法的原理、试剂配方等； 选择IFCC或中华医学会检验学会推荐的常规方
检测系统
光度计的准确性、重复性、线性范围和杂散光等 均会造成结果的偏差。
3 仪器影响因素的控制
在日常工作中，除常规做好仪器和设备的 正确使用和维护外，
酶活性检测
④分光光度法利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。
几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。
如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该法测定。
该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极大的方便。
酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。
酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。
为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。
而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。
下面我们来介绍用-可见分光光度计测定酶活的具体方法。
紫外-可见分光光度法测定酶活：1. β一半乳糖苷酶β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶(Lactase)。
能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。
【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。
【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。
2. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。
SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。
自1969年Mccord等人首次发现了SOD 生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。
欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。
【酶活测定】在25℃4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。
酶活性的测定方法
生物样品预处理预冷解剖用具，采用颈后断头的方法将鱼杀死，立即取肝脏、腮、脑，操作均在4℃下进行，用预冷的0.15 mol/L KCl 溶液洗去血丝，用滤纸吸干后称重。
将肝、脑组织放入预冷的Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 mol/L KCl)匀浆（匀浆比（W/V）1:5），腮组织放入组织匀浆（匀浆缓冲液含40mmol/L咪唑，250mmol/L蔗糖，5mmol/L EDTA，pH7.0），匀浆比为1:40，匀浆速率为10000g，以15s为周期，重复3次。
分别取1ml匀浆液放入1.5ml离心管进行离心，4℃下离心(9000g，20min)，取上清液-80℃下保存，待测。
（1）250mL 0.15 mol/L KCl：取2.7956g（2）Tris-HCl缓冲液：125mL 0.1 mol/L Tris（1.5143g）+ 105mL 0.1 mol/L HCl+ KCl（0.15*0.23*74.55=2.5720g）（Na+＋K+）－ATPase活性的测定1、试剂（1）匀浆液（250ml）：40mmol/L咪唑0.6808g+250mmol/L蔗糖21.3931g +5mmol/LEDTA 0.3653g（2）反应缓冲液（250ml）：80mmol/L咪唑 1.3616g+4mmol/LMgCl2 0.2033 g+40mmol/LKCl 0.7455g（3）16mmol/L Na2ATP（10ml）：0.0988g（4）30%三氯乙酸（TCA）9g TCA+21mlH2O（5）定磷试剂（硫酸亚铁-钼酸胺试剂100ml）：10ml 5mol/LH2SO4+1.3556 g钼酸铵+90mlH2O每10ml加入FeS040.5g（FeS04·7H2O 0.0941g），25ml加入FeSO4·7H2 O 0.2353g，临用前配制。
酶活力测定实验报告
酶活力测定实验报告酶活力测定实验报告引言：酶是一种生物催化剂，能够加速化学反应的速率，对于维持生物体内的代谢平衡起着重要的作用。
酶活力测定实验是一种常用的实验方法，通过测量酶催化反应中底物消耗量或产物生成量的变化，来间接反映酶的活性水平。
本实验旨在通过测定过氧化氢酶（catalase）在不同温度下的活性变化，探究酶活性与温度之间的关系。
材料与方法：1. 实验仪器：分光光度计、恒温水浴槽。
2. 实验试剂：过氧化氢酶溶液、过氧化氢底物溶液、磷酸盐缓冲液。
3. 实验步骤：a. 在分光光度计中设置波长为240nm。
b. 准备一组含有过氧化氢酶、过氧化氢底物和磷酸盐缓冲液的混合溶液，作为实验组。
c. 将实验组的混合溶液分别置于不同温度的恒温水浴槽中反应一段时间。
d. 取出反应后的混合溶液，通过分光光度计测定其吸光度，得到反应速率。
e. 重复以上步骤，分别在不同温度下进行实验，并记录实验数据。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了不同温度下过氧化氢酶的活性变化曲线。
实验结果显示，随着温度的升高，过氧化氢酶的活性呈现出先增加后降低的趋势。
在较低温度下，酶的活性较低，反应速率较慢；随着温度的升高，酶的活性逐渐增强，反应速率也随之增加；然而，当温度超过一定范围后，酶的活性开始下降，反应速率逐渐减小。
这一结果可以解释为酶的活性受到温度的影响。
酶是一种蛋白质，其活性受到温度的变化而变化。
当温度升高时，酶分子内部的振动加剧，使得酶与底物之间的碰撞频率增加，酶活性增强；然而，当温度过高时，酶分子的结构开始发生变化，部分酶分子失去了原有的构象，导致酶活性下降。
这种变化可能是由于酶分子的部分构象发生变化，使得酶活性中心的空间结构发生改变，从而影响了酶与底物之间的互作用。
此外，实验结果还表明，酶活性与温度之间存在一个最适温度。
在最适温度下，酶的活性达到最高点，反应速率最快。
这是因为在最适温度下，酶分子的结构处于最稳定的状态，酶活性中心与底物之间的互作用最为紧密，因此反应速率最高。
线粒体酶活性的测定方法
线粒体酶活性的测定方法
测定线粒体酶活性的方法主要分为三类：光度法、荧光法和电化学法。
1.光度法：
光度法是常见的酶活性测定方法之一。
通常使用4-氨基乙酚(AEBSF)或巴比妥酸等常用酶抑制剂，以阻止线粒体外膜和膜内酶的干扰。
其测定步骤如下：（1）将待测标本加入反应体系中，加入合适的底物，混匀后在恒温下孵育一定时间；
（2）加入显色剂，混匀后再孵育一定时间；
（3）停止反应，并测定反应体系中显色剂的吸光度值；
（4）通过与标准曲线对比，计算出待测样品的酶活性。
2.荧光法：
荧光法是利用荧光物质在线粒体内产生的荧光信号测定酶活性的一种方法。
在测定过程中，荧光物质可以通过与底物或反应产物结合，或与环境中某些分子发生作用而发出荧光信号，进而通过荧光强度的变化来反映酶活性的变化。
常用的荧光物质有琥珀酸钠（NADH）、亚麻酸和ATP等。
3.电化学法：
电化学法利用电极对电化学反应进行监测，测定酶活性的一种方法。
常用的电极有氧化还原电极（ORP）、电化学生物传感器等。
该方法对于测定酶活性具有高
灵敏度、高选择性和高重复性等优点。
通常先将待测标本加入反应体系中，然后通过电极测定反应体系中电压或电流的变化，反映出酶反应的速率和活性水平。
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实验一植物抗氧化酶活性的测定植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等。
它们普遍存在于植物的各种组织中，可以通过催化植物体内的活性氧，防止发生氧化反应。
所以抗氧化酶活性与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系，经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。
一、超氧化物岐化酶活性测定超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（）的酶，它催化下列反应：2反应产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。
已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。
【原理】本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有可氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲。
后者在560nm处有最大吸收，而SOD可清除从而抑制了甲的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
一个酶活性单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50％）时所需的酶量，据此可以计算出酶活性大小。
【仪器与用具】高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx）；试管数支；黑色硬纸套。
【试剂】1．50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。
2．提取介质50mmol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮）。
3．130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称取1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml。
4．750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取61.33m g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml，现配先用，避光保存。
5．100μmol/L EDTA-Na2溶液：取37.21m g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。
6．20μmol/L核黄素溶液：取7.53m g核黄素定容至1000ml避光保存。
【材料与方法】1．酶液提取：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，倒入5ml离心管中，用提取介质冲洗研钵2～3次，最后加缓冲液使终体积为5ml。
于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。
2．显色反应：取试管（要求透明度好）7支，3支为样品测定管，3支为对照管，另外1支作为空白，按表1加入各溶液。
混匀后将空白管置暗处，其他各管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长；温度范围30-37度）。
【结果处理】SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的作空白，分别测定其他各管560nm 波长下的吸光度值，已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。
按下式计算SOD活性：SOD总活性（U·g-1FW）=式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；A0—照光对照管的吸光度值；A S—样品管的吸光度值；V T—样液总体积（ml）；V1—测定时样品用量（ml）；FW—样重（g）；表1-1各溶液加入量试剂（酶）测定管用量(ml) 空白和对照管用量（ml）0.05mol/L磷酸缓冲液130mmol/L Met溶液750μmol/L NBT溶液100μmol/L EDTA-Na2液20μmol/L核黄素酶液蒸馏水总体积1.50.30.30.30.30.050.253.01.50.30.30.30.3加缓冲液0.050.253.0【注意事项】1. 显色反应过程中要随时观察光下对照管的颜色变化，当A0达到0.6-0.8时终止反应。
2. 当光下对照管反应颜色达到要求的程度时，测定管（加酶液）未显色或颜色过淡，说明酶对NBT的光还原抑制作用过强，应对酶液进行适当稀释后再显色，以能抑制显色反应的50%为最佳。
3. 植物组织中的酚类物质对测定干扰，对酚类含量高的材料提取酶液时刻加入聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）消除之【思考题】1．在SOD测定中为什么设照光对照管和暗中空白管？2．影响本实验准确性的主要因素是什么？应如何克服？二、过氧化氢酶活性的测定（采用滴定法）【原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。
根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【仪器与用具】紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶；0.5ml刻度吸管；2ml刻度吸管；10ml 试管；恒温水浴锅；【试剂】1. 0.2mol／L pH7.8磷酸缓冲液(内含1％聚乙烯吡咯烷酮)；2. 0.l mol／L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml。
(用0.1mol／L高锰酸钾标定)。
【材料与方法】1．酶液提取：称取剪碎的植物样品1.0g置研钵中，加入2~3ml 4℃下预冷的pH7.8磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10ml刻度试管中，并用缓冲液冲洗研钵2～3次，合并冲洗液，并定容到刻度，摇匀。
取部分提取液在4 000r/min下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。
2．测定：取10ml试管4支，其中3支为样品测定管，1支为对照管，按表2顺序加入试剂。
表1-2 各溶液加入量管号S1 S2 S3 S0对照粗酶液(ml)0.2 0.2 0.2 0.2（煮死酶液）pH7.8磷酸(ml) 1.5 1.5 1.5 1.5蒸馏水(ml) 1.0 1.0 1.0 1.025℃预热后，逐管加入0.3ml 0.1mol／L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中（可在比色杯中直接加H2O2），240nm下测定吸光度(蒸馏水调零)，每隔lmin读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。
【结果处理】以lmin内A240减少0.1为1个酶活单位(U)。
过氧化氢酶活性（U/g FW/min）=式中A so—加入煮死酶液的对照管吸光值；A sl, A s2, A s3—样品管吸光度值；Vt—粗酶提取液总体积(ml)；V1—测定用粗酶液体积(ml)；FW—样品鲜重(g)：0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位(u)：t—加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。
【注意事项】1. 所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。
2. 凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。
【思考题】1．影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?2．过氧化氢酶与哪些生化过程有关?三、过氧化物酶活性的测定过氧化物酶（POD）通过催化酚类物质与H2O2反应生成醌类来清除植物体内的H2O2。
过氧化物酶还与生长素、NADH、NADPH的氧化有关，在植物代谢中起着重要作用。
【原理】愈创木酚（邻甲氧基苯酚）可作为过氧化物酶的底物，与H2O2反应生成茶褐色产物。
该物质在470nm处有最大吸收峰，故可利用分光光度计测定过氧化物酶的活性。
【仪器与用具】紫外分光光度计；离心机；研钵；5ml量筒；25ml容量瓶；微量进样器；秒表。
【试剂】1. 100 mmol／L P H6.0磷酸缓冲液。
2. 反应混合液：100 mmol／L P H6.0磷酸缓冲液50ml于烧杯中，加入愈创木酚28μL，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19μL，混合均匀，保存于冰箱中。
【材料与方法】1.酶液的提取称取剪碎的植物样品2.0g置研钵中，加适量的磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，将匀浆全部转入离心管中，以4000g离心10min，上清液转入25ml容量瓶。
沉淀用5ml磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶，定容至25ml，低温下保存备用。
（酶浓度太高，样品数可少至1g）2.过氧化物酶活性的测定取两个光径1cm比色杯，于1个比色杯中加入反应混合液3ml和磷酸缓冲液1ml，作为较零对照；另一个比色杯中加入反应混合液3ml和粗酶液1ml(如酶活力过高可适当稀释)，立即开启秒表记录时间，于470nm进行比色测定，每隔1min记录一次吸光度值，共记录5min，然后以每分钟内A470变化0.01为1个酶活性单位。
【结果处理】以lmin内A470变化0.01为1个酶活单位(U)。
过氧化物酶活性（U/g FW/min）=△A470V/0.01WV t t式中△A470反应时间内吸光度的变化；V—为酶提取液总量(ml)；V t—为反应系统中加入的酶液量(ml)；W—样品重(g)：t—反应时间(min)。
四叶绿素含量的测定根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的光密度D与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即：D=kCL式中：k为比例常数。
当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，k为该物质的比吸收系数。
各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的光密度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总光密度等于各组分在相应波长下光密度的总和，这就是光密度的加和性。
测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的光密度D，并根据叶绿素a、b 及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。
在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a、b的80%丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04和9.27，在波长645nm 下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式：D663 = 82.04C a+9.27C b（1）D645 = 16.75C a+45.60C b（2）式（1）、（2）中的D663和D645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的光密度，C a、C b分别为叶绿素a和b的浓度，以mg/L为单位。
解方程组（1）、（2），得：C a = 12.72D663– 2.59D645（3）C b = 22.88D645– 4.67D663（4）将C a与C b相加即得叶绿素总量（C T）：C T = C a + C b =20.29D645 + 8.05D663（5）另外，由于叶绿素a、b在652nm的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为34.5），也可以在此波长下测定一次光密度（D652）而求出叶绿素a、b总量：C T =（D652 × 1000）/ 34.5 （6）在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。