酶活性测定

实验一植物抗氧化酶活性的测定

植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等。它们普遍存在于植物的各种组织中，可以通过催化植物体内的活性氧，防止发生氧化反应。所以抗氧化酶活性与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系，经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。

一、超氧化物岐化酶活性测定

超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（）的酶，它催化下列反应：

2

反应产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。

【原理】

本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有可氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产

生，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲。后者在560nm处有最大吸收，而SOD可清除

从而抑制了甲的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。一个酶活性单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50％）时所需的酶量，据此可以计算出酶活性大小。

【仪器与用具】

高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx）；试管数支；黑色硬纸套。

【试剂】

1．50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。

2．提取介质50mmol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮）。

3．130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称取1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml。4．750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取61.33m g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml，现配先用，避光保存。

5．100μmol/L EDTA-Na2溶液：取37.21m g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。

6．20μmol/L核黄素溶液：取7.53m g核黄素定容至1000ml避光保存。

【材料与方法】

1．酶液提取：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，倒入5ml离心管中，用提取介质冲洗研钵2～3次，最后加缓冲液使终体积为5ml。于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。

2．显色反应：取试管（要求透明度好）7支，3支为样品测定管，3支为对照管，另外1支作为空白，按表1加入各溶液。

混匀后将空白管置暗处，其他各管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长；温度范围30-37度）。【结果处理】

SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的作空白，分别测定其他各管560nm 波长下的吸光度值，已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD活性：

SOD总活性（U·g-1FW）=

式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；

A0—照光对照管的吸光度值；

A S—样品管的吸光度值；

V T—样液总体积（ml）；

V1—测定时样品用量（ml）；

FW—样重（g）；

表1-1各溶液加入量

试剂（酶）测定管用量(ml) 空白和对照管用量（ml）

0.05mol/L磷酸缓冲液130mmol/L Met溶液750μmol/L NBT溶液100μmol/L EDTA-Na2液20μmol/L核黄素

酶液

蒸馏水

总体积1.5

0.3

0.3

0.3

0.3

0.05

0.25

3.0

1.5

0.3

0.3

0.3

0.3

加缓冲液0.05

0.25

3.0

【注意事项】

1. 显色反应过程中要随时观察光下对照管的颜色变化，当A0达到0.6-0.8时终止反应。

2. 当光下对照管反应颜色达到要求的程度时，测定管（加酶液）未显色或颜色过淡，说明酶对NBT的光还原抑制作用过强，应对酶液进行适当稀释后再显色，以能抑制显色反应的50%为最佳。

3. 植物组织中的酚类物质对测定干扰，对酚类含量高的材料提取酶液时刻加入聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）消除之

【思考题】

1．在SOD测定中为什么设照光对照管和暗中空白管？

2．影响本实验准确性的主要因素是什么？应如何克服？

二、过氧化氢酶活性的测定（采用滴定法）

【原理】

H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

【仪器与用具】

紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶；0.5ml刻度吸管；2ml刻度吸管；10ml 试管；恒温水浴锅；

【试剂】

1. 0.2mol／L pH7.8磷酸缓冲液(内含1％聚乙烯吡咯烷酮)；

2. 0.l mol／L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml。(用0.1mol／L高锰酸钾标定)。

【材料与方法】

1．酶液提取：称取剪碎的植物样品1.0g置研钵中，加入2~3ml 4℃下预冷的pH7.8磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10ml刻度试管中，并用缓冲液冲洗研钵2～3次，合并冲洗液，并定容到刻度，摇匀。取部分提取液在4 000r/min下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。

2．测定：取10ml试管4支，其中3支为样品测定管，1支为对照管，按表2顺序加入试剂。

表1-2 各溶液加入量

管号S1 S2 S3 S0对照

粗酶液(ml)0.2 0.2 0.2 0.2（煮死酶

液）

pH7.8磷酸(ml) 1.5 1.5 1.5 1.5

蒸馏水(ml) 1.0 1.0 1.0 1.0

25℃预热后，逐管加入0.3ml 0.1mol／L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中（可在比色杯中直接加H2O2），240nm下测定吸光度(蒸馏水调零)，每隔lmin读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。

【结果处理】

以lmin内A240减少0.1为1个酶活单位(U)。

过氧化氢酶活性（U/g FW/min）=

式中A so—加入煮死酶液的对照管吸光值；

A sl, A s2, A s3—样品管吸光度值；

Vt—粗酶提取液总体积(ml)；

V1—测定用粗酶液体积(ml)；

FW—样品鲜重(g)：

0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位(u)：

t—加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。

【注意事项】

1. 所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。

2. 凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。

【思考题】

1．影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?

2．过氧化氢酶与哪些生化过程有关?

三、过氧化物酶活性的测定