蛋白质免疫印迹技术及
蛋白质免疫印记技术实验报告
实验二蛋白质免疫印迹技术河北大学生命科学学院2010生物技术河北保定071002摘要：目的：学习掌握动物抗血清的制备原理及技术，通过实际操作学会动物抗血清的制备，掌握Western－blotting的基本原理，熟悉Western－blotting的实验操作。
方法：，使用鸡卵类粘蛋白对小白鼠进行常规免疫，获得抗血清，然后利用Western－blotting 检测抗血清。
结果：纯化的鸡卵类粘蛋白能引起小鼠的免疫反应.关键词：常规免疫抗血清免疫印记Abstract：objective：learn to master the theory and technology of preparing animals’antiserum by operating the experiment in person ,learn to prepare the animals’antiserum , mastering the basic principles of Western－blotting, and being familiar with the experiment operation of Western－blotting. Methods : using chicken ovomucoid operating the routine immunization of , and obtain the antiserum, then detecting the antiserumthrough Western－blotting.Result:Purified chicken ovomucoid can lead to the laboratory rat's immunoreaction Keywords: routine immunization antiserum Western－blotting前言免疫印迹(Western blotting)是一种检测固定在固相基质上的蛋白质的免疫化学方法该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种常规技术，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
蛋白质免疫印迹技术
将蛋白质免疫印迹技术与基因测序技术相结合，有助于解析基因表达与蛋白质功能之间的关联，为精准医学和个性化 治疗提供有力支持。
与单细胞测序技术结合
通过将蛋白质免疫印迹技术与单细胞测序技术相结合，可以在单细胞水平上研究蛋白质的表达和功能， 揭示细胞异质性和疾病发生发展机制。
THANKS FOR WATCHING
改进方向
优化样品处理方法 简化样品制备过程，提高处理效 率，降低对实验技能的要求。
提高检测灵敏度和特异性 通过改进技术和方法，提高蛋白 质免疫印迹技术的检测灵敏度和 特异性，进一步减少背景干扰和 假阳性结果。
缩短实验周期 通过改进技术和方法，减少实验 步骤和时间，提高实验效率。
降低成本 寻找更经济实惠的抗体、显影剂 和其他试剂，降低实验成本。
研发自动化、智能化的蛋白质免 疫印迹系统，简化操作流程，减 少人为误差，提高实验效率和准 确性。
定量分析能力
发展蛋白质免疫印迹技术的定量 分析能力，实现蛋白质表达水平 的准确测量，为深入研究生物过 程和疾病机制提供有力支持。
应用领域的拓展
临床诊断
将蛋白质免疫印迹技术应用于临床诊断，为疾病诊断、病情监测和 预后评估提供可靠的蛋白质标志物检测手段。
转膜
选择合适的转移膜
根据实验需求，选择适当的转移 膜，如硝酸纤维素膜或聚偏二氟
乙烯膜。
预处理转移膜
将转移膜在缓冲液中浸泡，使其充 分湿润。
转膜
将凝胶上的蛋白质条带转移到预处 理的转移膜上，完成转膜过程。
抗体孵育与显色
01
一抗孵育
将特异性抗体与转印到膜上的蛋 白质进行孵育，使抗体与目标蛋 白质结合。
原理
基于抗原-抗体反应的特异性，通过将蛋白质样品电泳分离后转印至固相支持物 上，再与特异性抗体进行反应，通过显色反应检测目标蛋白质的存在、表达量 及修饰状态等信息。
蛋白免疫印迹的原理
蛋白免疫印迹的原理
蛋白免疫印迹（western blotting）是一种常用的生物化学实验
技术，用于检测和分析特定蛋白质在复杂混合物中的表达水平和特异性。
其原理基于蛋白质的电泳分离、膜转移和特异性抗体结合。
首先，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将待测蛋白样
品按照分子量大小进行分离。
然后，将分离出的蛋白质在电泳胶上通过膜转移（blotting）的方式转移到固相材料（通常是
聚乙烯二醇涂层的聚丙烯酰胺膜或硝酸纤维素膜）上。
转移完成后，膜上的蛋白质被非特异性蛋白质结合，为了防止进一步非特异性结合，可以使用一种无效蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA）或非脂母细胞肿瘤中抗原（NFSA）来封闭非特
异结合位点。
紧接着，膜上的蛋白质与针对特定蛋白的抗体发生特异性结合。
这些抗体可以是直接标记的（如荧光染料或酶联物质），或者是需要进一步与辅助抗体结合才能被检测到。
特异性抗体与膜上蛋白质结合后，通过洗涤步骤去除非特异性抗体。
最后，通过添加染色剂（如酶底物）或者使用荧光扫描仪，可以可视化结合在膜上的抗体。
蛋白免疫印迹的结果可以用于定量分析蛋白质的表达水平、鉴定特定蛋白的存在以及研究蛋白质的功能和相互作用。
蛋白质免疫印迹技术
2
特异性
该技术能够高度特异性地识别并检测目标蛋白,即使在复杂的生物样品中也不会产生交叉反应。
3
检测限
得益于优化的实验步骤和灵敏的检测方法,免疫印迹技术的检测限可达到皮克摩尔级别,能够灵敏检测极微量的目标蛋白。
4
重复性
该技术具有良好的实验重复性,可以准确定量并复制实验结果,为蛋白质研究提供可靠的数据支持。
蛋白质定量分析
可以利用Western blot结果对特定蛋白的相对含量进行定量分析,为进一步的生物学研究提供数据支持。
结果可视化展示
Western blot采用化学发光检测,可以清晰地显示蛋白条带,结合分子量标准进行数据分析和解读。
实验数据处理
数据分析
实验结果的数据处理通常包括绘制图表、统计分析和计算参数。数据分析可以揭示实验结果的趋势和特点,为后续的实验设计和结果解释提供依据。
技术改进方向
提高灵敏度
通过优化实验条件和试剂配方,不断提高免疫印迹技术的检测敏感度,以更准确地识别低丰度蛋白。
增强特异性
开发高特异性的抗体,减少非特异性结合,提升识别目标蛋白的准确性。
自动化集成
将实验流程进行自动化处理,实现样品预处理、电泳、转膜、免疫反应等步骤的高度整合,提高操作效率。
数据分析优化
2
结果解释和分析
对实验结果进行深入分析,阐述结果的意义和影响,讨论可能的影响因素。提出合理的解释和推论。
3
图表展示质量
使用恰当的图表、图像等辅助手段,直观、生动地展示实验结果。确保图表制作规范,便于理解和分析。
4
结论和建议
根据实验结果提出明确的结论,并提出后续研究或应用的建议,为后续工作提供参考。
实验设备
免疫印迹技术原理
免疫印迹技术原理
免疫印迹技术（Western blot）是一种常用的蛋白质检测方法，它可以检测特定蛋白质在样品中的存在和表达水平。
该技术的原理是利用抗体与特定蛋白质结合的特异性，将蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并通过电泳将其分离成不同大小的蛋白质片段，最后通过蛋白印迹技术检测目标蛋白质。
免疫印迹技术的步骤包括：蛋白质样品的制备、SDS-PAGE电泳分离、转膜、阻断、一抗结合、二抗结合和检测。
首先，需要将蛋白质样品进行制备，通常是将细胞或组织裂解并提取蛋白质。
然后，将蛋白质样品加入SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离，根据蛋白质的大小将其分离成不同的片段。
接着，将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶（PVDF）或硝酸纤维素膜上，形成蛋白质印迹。
为了防止非特异性结合，需要用牛血清白蛋白或非脂类奶粉等物质进行阻断。
然后，加入一抗，即特异性抗体，与目标蛋白质结合。
接着，加入二抗，即与一抗结合的酶标记抗体，使其与一抗结合的蛋白质形成复合物。
最后，通过酶标记物的反应，检测目标蛋白质的存在和表达水平。
免疫印迹技术具有高灵敏度、高特异性和广泛的应用范围。
它可以用于检测蛋白质的表达水平、鉴定蛋白质的分子量、检测蛋白质的修饰状态等。
在生物医学研究中，免疫印迹技术被广泛应用于疾病诊断、药物研发、基因表达分析等领域。
免疫印迹技术是一种重要的蛋白质检测方法，其原理是利用抗体与特定蛋白质结合的特异性，将蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并通过电泳将其分离成不同大小的蛋白质片段，最后通过蛋白印迹技术检测目标蛋白质。
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和鉴定蛋白质的存在以及其在不同样本中的表达水平。
下面将详细介绍WB实验的具体步骤。
1.细胞裂解和蛋白质提取：首先将待检测的组织样本或细胞样本通过离心将其收集，并添加适量的裂解缓冲液。
使用超声波或机械破碎手段将细胞打乱，使蛋白质溶解在裂解缓冲液中。
再通过离心去除细胞碎片和细胞核等。
2.蛋白质浓度测定：根据实验需要，采用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法测定蛋白质浓度，以确定后续实验的载体中待加载的蛋白质量。
3.蛋白质电泳：将相同量的蛋白质样品加入SDS-凝胶槽中，进行电泳。
电泳时蛋白质在凝胶中向阴极迁移，分子量小的蛋白质迁移速度较快，分子量大的较慢。
电泳结束后，将凝胶转移到膜上。
4.膜上瞬时染色：在转移至膜上后，可以使用Ponceau S染色或其他瞬时染色方法，以确认蛋白质在膜上的存在和转移效果。
5.阻断：在膜上的蛋白质检测之前，需要对膜进行阻断处理，以防止非特异性结合。
常用的方法是在膜上加入牛血清蛋白或脱脂奶粉的溶液，进行阻断。
6.一抗反应：加入已稀释好的一抗抗体，与目标蛋白质特异性结合。
一抗的选择要根据待检测蛋白的特异性来确定。
7.清洗：一抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的一抗抗体。
8.二抗反应：9.清洗：二抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的二抗抗体。
10.显色和成像：使用显色剂（如ECL）使膜上的蛋白质发生化学发光反应，然后将膜放入X射线片中，进行曝光。
最后使用化学显影废片机或Gel Doc System等设备进行成像。
11.数据分析：使用专业的成像软件分析成像结果，计算蛋白质的相对表达水平，并与内参蛋白进行比较。
需要注意的是，在进行WB实验的过程中，要严格操作，避免污染和交叉反应的出现。
同时，应根据实验需求选择适当的试剂和抗体，并进行标记、保存和储存等操作。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
蛋白质免疫印迹的原理
蛋白质免疫印迹的原理蛋白质免疫印迹是一种常用的实验技术，用于检测特定蛋白质在混合物中的存在并确定其分子量。
该技术基于蛋白质与特异性抗体之间的特异性结合原理，通过将抗体与蛋白质结合，然后使用特定的检测方法来观察和分析蛋白质的存在与性质。
蛋白质免疫印迹技术需要获取感兴趣的蛋白质样本。
这些样本可以来自细胞、组织、血清等。
通常，需要先对样本进行蛋白质提取和纯化，以获得高质量的蛋白质样本。
接下来，将蛋白质样本进行电泳分离。
常用的电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳法（2-DE）。
通过电泳分离，可以将蛋白质样本按照其分子量和电荷大小进行分离。
分离完成后，将电泳胶中的蛋白质转移到固定膜上。
这通常通过半湿式或干式转移的方法实现。
在半湿式转移中，将电泳胶和膜以间隔层叠放置，通过电流将蛋白质从胶体转移到膜上。
在干式转移中，将电泳胶和膜分开，使用特定的设备将蛋白质转移到膜上。
转移完成后，膜上的蛋白质被固定在膜上，形成蛋白质膜。
为了防止非特异性结合，膜上的蛋白质被处理成一定的条件，如用乙酸酐等进行酰化处理。
这样可以增加膜上蛋白质与抗体之间的特异性结合。
接下来，将蛋白质膜进行免疫染色。
首先，在蛋白质膜上加入特异性抗体。
这些抗体与目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。
然后，用荧光标记的或酶标记的二抗与抗原-抗体复合物结合。
这些二抗可以识别并结合一定类型的抗体，从而实现对蛋白质的检测和定量。
使用相应的检测方法观察和分析蛋白质的存在与性质。
常用的检测方法包括荧光成像、放射免疫测定和酶联免疫测定。
这些方法可以通过测量光信号、放射性信号或酶反应产物的生成来确定目标蛋白质的存在与性质。
总结起来，蛋白质免疫印迹技术是一种基于蛋白质与特异性抗体之间的特异性结合原理的实验技术。
通过将抗体与蛋白质结合，然后使用特定的检测方法来观察和分析蛋白质的存在与性质。
这项技术在生物医学研究和临床诊断中被广泛应用，对于研究蛋白质功能和疾病机制具有重要意义。
蛋白免疫印迹杂交(WesternBlot)技术手册
蛋白免疫印迹杂交〔Western Blot〕技术手册A蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting 的第一步，更是打算WB 成败的关键步骤，总体原则和留意事项：1：尽可能提取完全或降低样本简洁度只集中于提取目的蛋白〔通过承受不同提取方法或选择不同的试剂盒产品〕2：保持蛋白的处于溶解状态〔通过裂解液的PH 盐浓度外表活性剂、复原剂等的选择〕3：提取过程防止蛋白降解、聚拢、沉淀、修饰等，〔低温操作，参与适宜的蛋白酶和磷酸酶抑制剂〕4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子〔通过参与核酸酶或实行不同提取策略〕5：样品分装，长期于-80℃中保存，避开反复冻融。
A-1细胞或组织裂解A-1-1细胞裂解裂解液Lysis buffer 或商品化蛋白抽提试剂盒的选择*目的蛋白分布定位推举裂解液Lysis buffe 推举试剂盒全细胞NP-40 or RIPA〔附录1〕全蛋白抽提试剂盒细胞质〔可溶蛋白〕Tris-HCl〔附录1〕胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒细胞质〔细胞骨架等不溶蛋白〕Tris-Triton〔附录1〕蛋白分级抽提试剂盒细胞质〔磷酸化蛋白〕磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40 or RIPA〔附录1〕膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒细胞核RIPA〔附录1〕核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA〔附录1〕线粒体蛋白抽提试剂盒亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法：1培育的细胞经预冷的PBS 漂洗2 次，裂解液中参与蛋白酶和磷酸酶抑制剂〔种类与量见本节2〕2吸净PBS，参与预冷的裂解液，〔(1 ml per 107cells/100mm dish/150cm2flask; 0.5ml per 5x106cells/60mm dish/75cm2flask).3用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温存地转移至预冷的微量离心管中，44℃摇动30 min54℃离心12,000 rpm，20 min〔根椐细胞种类不同调整离心力〕6轻轻吸取上清，转移至预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.A-1-2组织裂解1 用灭菌的预冷的工具分别目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf 管中，参与液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C，3每约5 mg 参与约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2 小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，〔最终的蛋白浓度至少到达0.1 mg/ml, 抱负的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).44℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀,A-2蛋白酶和磷酸酶抑制剂推举购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项
蛋⽩质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验⽅法原理步骤及注意事项实验⽅法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋⽩质转移到膜上，然后利⽤抗体进⾏检测的⽅法。
对已知表达蛋⽩，可⽤相应抗体作为⼀抗进⾏检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交⽅法类似，但Western Blot采⽤的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋⽩质，“探针”是抗体，“显⾊”⽤标记的⼆抗。
经过PAGE分离的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。
以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应，经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。
该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。
实验材料蛋⽩质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基⼄醇ddH2O⽢氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰⼄酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离⼼机离⼼管硝酸纤维素膜匀浆器剪⼑移液枪刮棒实验步骤⼀、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基⼄醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：⽢氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容⾄1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O⾄1000 ml。
5. 膜染⾊液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；⼄酸2 ml；ddH2O118 ml。
蛋白质印迹技术
蛋白质印迹技术蛋白质印迹（Western blotting）是一种检测固定在固相基质上的蛋白质的免疫化学办法，又称免疫印迹（immunoblotting )。
1979年，Towbin等将分析DNA的Southern blotting技术扩展到蛋白质的讨论领域，并且和特异、敏捷的免疫分析技术相结合，称之为“Western blotting"（蛋白质印迹）。
免疫印迹可分为两个步骤：将蛋白质由凝胶转移至固相基质上；特异性抗体检测。
试验原理蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后，分别为不同的条带，其中含有能与特异性抗体相结合的待检测的蛋白质（抗原蛋白），将凝胶上的蛋白质以电转印的方式，转印至固相支持物（如硝酸纤维素膜，NC膜）上，再用特异抗体作为探针对靶蛋白举行检测的办法。
因为该办法结合了PAGE的高辨别率和固相免疫反应的高特异性等多种优点，可检测到低至1-5 ng的中等分子量大小的靶蛋白。
仪器和材料电转移装置（电源）；摇床；暗匣；转印夹；浅盘（30cm×15cm×3cm)；玻璃棒；杂交袋或杂交盒；胶片；保鲜膜；滤纸；0. 22μm孔径的硝酸纤维素膜。
试剂 (1) Running Buffer (Tris-甘氨酸电泳缓冲液，1×2500ml) ; 25 mmol/L Tris 7. 55g 250mmol/L甘氨酸 47. 0g 10%SDS 25m1 (2) Transfer Buffer ( Tris-甘氨酸电转膜缓冲液，1× 2500m1，pH＝8.3）：48 mmol/L Tris 14. 50g 39mmol/L 甘氨酸 7. 25g 10% SDS 9. 25ml 20％甲醇 500m1 (3) TTBS缓冲液（pH 7.5，2 ×2500ml)： 20 mmol/L Tris 12. l l g 0. 5 M NaCl 146. 1 g 0.05%Tween 20 2. 5 ml (4) Stripping Buffer（pH2. 0，1000m1)：甘氨酸 1. 8768 SDS 10. 0g (5) 10％牛奶封闭液：称取10. 0g脱脂奶粉，溶于80m1 TTBS（pH7.5 )中，搅拌彻低溶解，后加入TTBS定容至100m1，再加入10μl Thimerosal混匀。
蛋白质印迹分析实验原理和操作步骤
蛋白质印迹分析实验原理与操作步骤蛋白质印迹法又称为免疫印迹法,这就是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质得免疫化学技术方法。
待测蛋白既可以就是粗提物也可以经过一定得分离与纯化,另外这项技术得应用需要利用待测蛋白得单克隆或多克隆抗体进行识别。
关键词:印迹蛋白质步骤蛋白质印迹分析蛋白质印迹Westernｂlottinｇimmunoblotｔiｎg免疫印迹法蛋白质印迹法【实验原理】蛋白质印迹法又称为免疫印迹法,这就是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质得免疫化学技术方法。
待测蛋白既可以就是粗提物也可以经过一定得分离与纯化,另外这项技术得应用需要利用待测蛋白得单克隆或多克隆抗体进行识别。
如图所示,可溶性抗原,也就就是待测蛋白首先要根据其性质,如分子量,分子大小,电荷以及其等电点等采用不同得电泳方法进行分离;通过电流将凝胶中得蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上;利用抗体(一抗)与抗原发生特异性结合得原理,以抗体作为探针钓取目得蛋白。
值得注意得就是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白,如牛血清白蛋白对膜进行“封阻”而防止抗体与膜得非特异性结合。
经电泳分离后得蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电泳印迹。
常用得两种电转移方法分别为:１。
半干法: 凝胶与固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿得滤纸之间,通电时间为1０分钟~３０分钟。
2.湿法:凝胶与固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中,转移时间可从45分钟延长到过夜进行、由于湿法得使用弹性更大并且没有明显浪费更多得时间与原料,因此我们在这里只描述湿法得基本操作过程。
对于目得蛋白得识别需要采用能够识别一抗得第二抗体。
该抗体往往就是购买得成品,已经被结合或标记了特定得试剂,如辣根过氧化物酶。
这种标记就是利用辣根过氧化物酶所催化得一个比色反应,该反应得产物有特定得颜色且固定在固相载体上,容易鉴别。
因此可通过对二抗得识别而识别一抗,进而判断出目标蛋白所在得位置。
其她得识别系统包括碱性磷酸酶系统与125I标记系统、1。
免疫印迹法原理
免疫印迹法原理免疫印迹法（Western Blot）是一种常用的蛋白质检测技术，广泛应用于生物医学研究领域。
它通过检测特定蛋白质在样本中的存在与否，以及其相对表达水平，帮助科研人员了解蛋白质的功能、结构和代谢途径。
本文将介绍免疫印迹法的原理及其在科研中的应用。
免疫印迹法的原理主要包括蛋白质分离、转膜、免疫印迹和检测四个步骤。
首先是蛋白质分离。
通常采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将待检测样本中的蛋白质按照大小分离开来。
这一步骤是为了使得待检测的蛋白质能够被免疫印迹所检测到。
接着是转膜。
将SDS-PAGE分离出的蛋白质转移到聚丙烯酸膜或硝酸纤维膜上，形成蛋白质斑点。
这一步骤是为了将蛋白质从凝胶中转移到膜上，以便后续的免疫印迹检测。
然后是免疫印迹。
将转膜中的蛋白质用特异性的抗体进行识别和结合。
首先是将转膜进行孵育，使得抗体与特定蛋白质结合。
然后通过洗涤去除未结合的抗体，最后通过化学发光或染色等方法来检测蛋白质的存在与否。
最后是检测。
通过化学发光、荧光或染色等方法来检测蛋白质的存在与相对表达水平。
这一步骤是为了定量分析待检测蛋白质的表达水平，从而了解其在生物学过程中的功能和作用。
免疫印迹法在生物医学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于检测特定蛋白质的存在与否，从而帮助科研人员了解蛋白质在细胞中的表达情况。
其次，免疫印迹法也可以用于检测蛋白质的修饰状态，比如磷酸化、甲基化等修饰形式，从而揭示蛋白质的功能和调控机制。
此外，免疫印迹法还可以用于筛选药物靶点、诊断疾病和评估治疗效果等方面。
总之，免疫印迹法是一种重要的蛋白质检测技术，其原理简单清晰，应用广泛灵活。
通过对特定蛋白质的检测和定量分析，可以帮助科研人员深入了解蛋白质的功能和调控机制，为生物医学研究提供重要的实验手段和数据支持。
蛋白质免疫印迹技术及PPT课件
实验案例二：蛋白质相互作用分析
总结词
蛋白质相互作用分析有助于了解蛋白质之间的相互作用关系，进一步揭示生物学过程的分子机制。
详细描述
在实验中，首先将蛋白质样品进行分离和提纯，然后通过电泳分离蛋白质，再将其转移到膜上。接下 来，利用抗体技术检测两种蛋白质是否相互作用。这种方法可以用于研究蛋白质之间的相互作用关系 ，为生物学过程的研究提供重要信息。
归一化处理
将目标蛋白的密度与内参蛋白的密 度进行归一化，消除实验误差。
统计学分析
对实验组和对照组的数据进行统计 分析，比较组间差异。
数据分析的注意事项
数据可靠性
确保数据来源可靠，避免数据污染和误差。
数据可比性
确保实验条件一致，使数据具有可比性。
数据解读
结合生物学背景和实验目的，对数据进行合理解 读。
凝胶电泳
01
02
03
确定电泳条件
根据蛋白大小和分离需求， 选择合适的凝胶浓度和电 泳电压。
加样与电泳
将稀释后的蛋白样品加入 凝胶的加样孔中，开始电 泳分离蛋白质。
染色与脱色
电泳结束后，对凝胶进行 染色，使蛋白质条带显现 出来，然后进行脱色处理。
转膜
选择合适的转移膜
根据需要，选择NC膜、 PVDF膜等适合的转移膜。
实验操作流程
1. 样品制备
将细胞或组织提取蛋白，进行浓 度测定。
2. 阻断
将膜置于脱脂奶粉或BSA中，封 闭非特异性结合位点。
3. 抗体孵育
将抗体与膜在适当条件下孵育， 使抗体与目标蛋白结合。
6. 结果观察
通过荧光显微镜或其他成像设备 观察蛋白条带。
5. 显影
将荧光染料或其他标记物与抗体 结合，使蛋白在膜上显像。
蛋白质免疫印迹实验WesternBlot
摇动，待所检测的蛋白带显色达到最深程度后，将硝 酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中停止显色反应。取出 硝酸纤维素薄膜，自然晾干后拍照保存结果。
四 思考题
• 1. 为什么裁剪的滤纸必须与凝胶大小 完全一致？若不是这样结果会怎样？
• 2. 电转移时为什么都必须带手套小心 操作并除去气泡， 否则结果会怎样？
• 在进色后应时应注意哪些问题？ • 请简述免疫印迹实验的原理，并将之与
免疫学相关概念联系起来。
2024/2/11
2024/2/11
一 实验原理
• 电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物 上是通过电转移仪器完成的。它是将固 体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二 者结合在一起，然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治 ”结构，放入电转移仪器上，加入电泳 缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝 胶上转移到固体支持物上。
2024/2/11
一 实验原理
其定量关系符合以下公式： • Ve=Vo+KV1 • Ve：某一溶质的洗脱体积 • Vo：层析柱的外水体积 • Vi：层析柱的内水体积 • K：某一溶质的分配系数
2024/2/11
二试剂和器材
1．试剂
电转移缓冲液 pH8.3 • 39mM甘氨酸 • 4.8mM Tris碱 • 0.037% SDS • 20% 甲醇 • 混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲2源自24/2/11三 操作步骤
蛋白免疫印迹法原理及步骤
蛋白免疫印迹法原理及步骤蛋白免疫印迹法是一种常用的生物化学实验方法，用于检测蛋白质在复杂混合物中的存在和定量。
它基于蛋白质与特异抗体的特异性结合，通过多步骤的操作最终形成可视化的结果。
该方法主要包括以下步骤：1. 样品制备：首先，需要提取目标蛋白质。
这可以通过细胞裂解和蛋白质提取试剂盒等方法来实现。
提取的蛋白质样品需要经过浓缩和纯化步骤，以去除其他干扰物质。
2. SDS-PAGE电泳：接下来，将样品中的蛋白质进行分离，一种常用的方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
在电泳过程中，蛋白质按照其分子量的大小进行迁移，从而分离出不同大小的蛋白质带。
3. 转膜：将电泳分离后的蛋白质从凝胶转移到聚氟乙烯(PVDF)或硝酸纤维素膜上。
这一步骤可以通过湿式转膜或半干式转膜的方法来完成。
4. 阻断：在转膜后，需要使用一种阻断剂，如牛血清蛋白(BSA)或非脂奶粉，来封闭膜上的非特异性结合位点，以减少假阳性结果的产生。
5. 抗体结合：将目标蛋白质与特异性一抗进行孵育，使其结合在膜上。
特异性一抗可以是经过免疫动物制备的抗体，也可以是通过基因工程技术获得的单克隆抗体。
6. 洗涤：将膜进行多次洗涤，以去除未结合的抗体和其他非特异性结合物质。
7. 二抗结合：加入与一抗源动物不同物种的次级抗体，即特异性二抗。
次级抗体通常与酶或荧光素等标记物结合，以便最终形成可视化结果。
8. 可视化：使用适当的底物，如酶联免疫吸附法(ELISA)中的显色底物或荧光染料，来观察免疫复合物的形成。
这样，目标蛋白质就会在膜上形成特异的带状条纹。
蛋白免疫印迹法通过特异性抗体的结合和可视化结果的形成，可以高效、准确地检测目标蛋白质的存在和定量。
它广泛应用于生物医学研究领域，为我们了解蛋白质功能和分子机制提供了重要的实验手段。
蛋白质免疫印迹技术
动物的常规免疫 Western－blotting 检测抗血清
01
注射器
02
蜗旋混合器
动物的常规免疫
四、操作步骤
动物的常规免疫 Western－blotting 检测抗血清
0.5mg/mL菠萝蛋白酶以0.9%生理盐水溶解配置（加少量NaOH促溶）（周二上、周五上）。
03
机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。
04
（一）多克隆抗体的概念
抗体的结构
由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同动物或同种不同品系动物、或不同个体，产生特异免疫应答的强弱是不同的。因此，进行动物免疫时，必须选择对该抗原敏感的、年轻的健康动物。
01
常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。一般为6个月大小的动物。
单击此处添加副标题
202X
实验二 蛋白质免疫印迹技术
研究抗原物质的结构和功能；
免疫应答产物的结构和功能；
抗原刺激机体产生免疫应答的规律。
一、免疫学
免疫学的研究范围很广，与很多相关学科交织在一起，并且发展成了很多学科，如免疫生物学、免疫遗传学、血液免疫学、肿瘤免疫学等。
1
随着免疫生物学的发展，人们发现在高等动物体内存在着具有免疫功能的组织结构（即免疫系统）。
02
（二）用于免疫的动物
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量。 如要获得大量的抗体，多采用大动物； 如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物； 如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体； 如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备。 一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清。
蛋白质免疫印迹法的原理和步骤
蛋白质免疫印迹法的原理和步骤蛋白质免疫印迹法，听起来是不是有点高大上的样子？其实它就是科学家们用来探究蛋白质的一种非常实用的技术，简单来说，就是能帮助我们找到和确认特定的蛋白质。
这种方法在生物医学研究中简直是个大杀器！想象一下，在一片蛋白质的“海洋”中，我们得用放大镜找到一颗珍珠，这可不是件容易的事。
不过，别担心，接下来我就来给你聊聊这个神奇的过程。
我们得准备样品。
这个样品可以是细胞提取液、组织匀浆，甚至是一些体液。
基本上，只要里面有蛋白质的东西都行。
把这些样品放在一个叫做电泳的装置里。
哇，电泳可真是个神奇的东西，想象一下把各种蛋白质按大小排队，像是参加选美比赛。
小的蛋白质跑得快，大的蛋白质则慢吞吞，最后你就能看到一条条的带子，清晰可见。
然后，咱们得把这些“得意的小家伙”转移到膜上，通常是聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）或者硝酸纤维膜。
这一步叫做转膜，感觉就像把蛋糕从烤盘里倒出来，得小心翼翼，不能搞坏了。
转膜之后，膜上就留下了那些宝贵的蛋白质，这时候就开始进行封闭了。
封闭的目的就是为了防止后续步骤中抗体的非特异性结合。
想象一下，你请朋友吃饭，得把桌子清理干净，免得他们被桌上的乱七八糟的东西分心。
封闭完成后，咱们得引入抗体。
抗体就像是一群专门找蛋白质的侦探，它们会识别特定的蛋白质并牢牢绑定上去。
这一步是个技术活，选择合适的抗体至关重要，就像挑选朋友一样，得找对路子。
把抗体加到膜上，让它们跟蛋白质好好“聊聊”，这过程大概要过一阵子，稍等片刻，侦探们就会开始工作。
咱们要用二抗（也就是带有标记的抗体）来检测这些结合的抗体。
这就像在侦探故事里，出现了个助手来协助主角。
这个助手会发光或者变色，让你一眼就能发现目标蛋白质。
真是太神奇了！只要把膜放进化学发光底物里，哇，瞬间就能看到那些闪闪发光的蛋白质位置，仿佛星星在夜空中闪烁。
最后一步，咱们需要记录结果。
可以用专门的成像系统拍照，就像给蛋白质们开个大派对，留个念。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蛋白质浓度测定的各种方法汇总：
/thread-23639-1-1.html
Western Blot
蛋白样品的变性
2×SDS-PAGE上样缓冲液：
1M Tris-HCl(pH6.8) 1M DTT SDS 甘油 溴酚蓝 总体积 10 ml 20 ml 4g 20 ml 0.2 g 100ml
Western Blot
SDS：
阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电 荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线 性化。
Western Blot
Western Blot
转移膜的选择
最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸 纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟 乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜， 此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白 印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于 核酸杂交。 各种膜的详细特点介绍：
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，
简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网
状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明
度。是良好的电泳介质。
Western Blot
聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：
• 单体：丙烯酰胺（Acr）；
• 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）；
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC
膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方 法，称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，
对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的 蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后 蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
蛋白质-SDS胶束的特点：
（1）具有相同的形状，形状 像一个长椭圆棒
（2）平均1g 蛋白质结合
1.4g SDS （3）短轴对不同的蛋白质亚 基-SDS胶束基本上是相同的 （4）长轴的长度则与亚基分
子量的大小成正比
Western Blot
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
不连续的电泳缓冲体系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电 荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。
Western Blot
SDS-PAGE电泳
凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合 均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心， 以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致 宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应 赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否 合适
蛋白质免疫印迹技术及
常见问题分析
张绍进
Western Blot
Western Blot简介
Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析
Western Blot
Western Blot 简介：
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利 用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
Western Blot
Western Blot常见问题分析
Western Blot
SDS-PAGE电泳
胶不平？ 凝胶漏液？ 胶板洗刷干净
加入AP和TEMED的量要合适
加入试剂后摇匀，使其充分混合，防 止部分胶块聚合不均匀
温度合适，受热不均匀导致胶聚合不
均匀 两块玻璃板底部要对齐
Western Blot
Western Blot 流程
蛋白样品的制备
•SDS-PAGE •转膜 •封闭 •一抗杂交 •二抗杂交 •底物显色
Western Blot
蛋白样品的提取
通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白
水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系 统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质 最常用的溶剂 。
Western Blot源自不连续电泳：作用浓缩胶 分离胶 使蛋白样品浓缩 使蛋白样品分离
缓冲液PH
pH6.8TrisCl pH8.8TrisCl
凝胶浓度
低，2-5% 高，根据蛋 白大小
电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。
Western Blot
灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%
（核黄素——TMTED）体系。
Western Blot
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％）
15
线性分离范围（KD)
12-43
10
7.5 5.0
16-68
36-94 57-212
SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方 表：/thread-20726-1-1.html
Western Blot
灌制积层胶
插入梳子
Western Blot
Staking gel
Separating gel
Western Blot
转膜
要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固 相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法： 毛细管印迹法和电泳印迹法。 常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者 的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和 施加电场的机械装置不同。
条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑” 条带？
Western Blot
转膜及抗体检测
凝胶肿胀或卷曲？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液 中浸泡5-10min
条带歪斜或漂移？
单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？
电转仪长期使用导致海绵变薄，“三
明治”结构不紧凑导致。可在两块海 绵之间垫上少许普通的草纸
有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，
包括乙醇、丙酮和丁醇等。
通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
Western Blot
蛋白样品的定量
目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford 法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂 法）、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据 具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说 明操作，测定样品浓度。
1.
1. 2. 3. 4.
对 策
Western Blot
背景太高
原 因 膜没有均匀浸湿
膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交 叉反应 抗体浓度过高
1.
1.
2.
3. 4.
2.
对 策
3.
5.
4.
转膜前用100%甲醇将膜完 全浸湿 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
Western Blot
封闭
为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜 发生非特异性结合，使非特异性背景提高， 需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。
5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h） Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司） Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影
响抗体与抗原的结合。
Western Blot
一抗、二抗孵育
把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以 0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室 温孵育1-2小时或4℃过夜。
回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。
加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温 孵育1-2小时或4℃过夜。
Western Blot
杂交信号很弱
原 因 抗体保存不当
抗原不充足 膜的漂洗过度
1.
1. 2. 3.
对 策
2.
3.
抗体长期保存应在－70℃ ，使用前做效价检测 增加蛋白上样量，做已知 标准量蛋白的对照 减少漂洗的时间和次数
Western Blot
出现非特异带
原因
1.
2.
一抗不是唯一特 异的 二抗出现非特异 结合
Western Blot
凝胶成分
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液
Western Blot
PAGE：聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰 胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)
Western Blot
Western Blot 基本原理
Western Blot
Western Blot 优点
高分辨率的电泳技术 特异敏感的抗原-抗体反应
1-5ng中等大小的靶蛋白
Western Blot
Western Blot应用
目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析
回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。
Western Blot
二抗与底物反应显色
•辣根过氧化物酶法（HRP）
•碱性磷酸酶法（AP）
•化学发光显色法(HRP)
Western Blot