实验专题模块三血液生化检验

4） 用血色素吸管吸取人新鲜血清3～5ul，涂于宽2厘米 的点样器末端处，或用点样器在盛有血清的小烧杯中蘸 一下，使其末端粘上薄层血清，然后紧按在薄膜点样线 上，待血清全部渗入膜内，移开点样器。
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2. 电泳:
将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面 （即点样面）向下，点样端置于阴极。槽架上以四层 滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，待平衡5分钟后通电， 电压为10V/cm长（指膜条与滤纸桥总长度），电流为 0.4～0.6mA/cm宽，通电一小时左右关闭电源。
本专题将介绍血清蛋白与血尿素氮等两种生化指标的检测，
使同学们对临床生化检验有一个初步的了解。
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实验一 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
一、实验目的 1. 掌握分离血清蛋白的基本原理及其临床意义。 2. 了解醋酸纤维薄膜电泳的方法及相关仪器的 操作。
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二、背景与原理
血清蛋白的pI都在7.5以下，在pH为8.6的巴比妥缓 冲液中以负离子的形式存在，分子大小、形状也各
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临床意义
正常值： 白蛋白： 57～72%
α1球蛋白：2～5% α2球蛋白：4～9% β球蛋白： 6.5～12%
γ球蛋白： 12～20% 急性肝炎：发病早期蛋白质电泳无变化，发病两周后白蛋白、α2
及β球蛋白减少，γ球蛋白增高。
慢性肝炎：γ球蛋白升高，白蛋白下降较急性肝炎显著。 肝硬化：白蛋白、α1、α2球蛋白均明显下降，γ球蛋白极度升高，
有差异。所以在电场作用下，可在醋酸纤维薄膜上
分离成A、α1、α2、β和γ五条区带。电泳结束后， 将醋酸纤维薄膜置于染色液，使蛋白质固定并染色，
再脱色（洗去多余染料）。将染色后的区带分别用
剪刀分离出来，将其溶于碱液中，进行比色测定，
最后计算出各区带蛋白质的百分数。也可将染色后 的醋酸纤维薄膜透明处理后在扫描光密度计上绘出 电泳曲线，并可根据各区带的面积计算各组分的百 分数。
实验专题模块三 血液生化检验
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 血清尿素氮的测定
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血液是在心脏和血管腔内循环流动的一种组织。成人的血液 约占体重的十三分之一，相对密度为1.050～1.060，pH值为 7.3～7.4，渗透压为313 mmol/L。
血液由血浆和血细胞组成。血浆内含血浆蛋白（白蛋白、球 蛋白、纤维蛋白原）、脂蛋白等各种营养成分以及无机盐、氧、 激素、酶、抗体和细胞代谢产物等。
肾小管内尿流速越快，尿素的重吸收就越少，也即达到了最大清除率。 如果肾功能出现了损害，则有可能导致尿素排出减少，或者是重吸收 增多，使得BUN升高。和血肌酐（SCR）一样，在肾功能损害早期， 血尿素氮可在正常范围。当肾小球滤过率下降到正常的50%以下时， 血尿素氮的浓度才迅速升高。正常情况下，血尿素氮与肌酐之比 （BUN/Scr）值约为10.1，高蛋白饮食、高分解代谢状态、缺水、肾 缺血、血容量不足及某些急性肾小球肾炎，均可使比值增高，甚至可 达20～30；而低蛋白饮食，肝疾病常使比值降低，此时可称为低氮质 血症。
5. 计算:
光吸收总和A总＝AA+Aα1+Aα2+Aβ+Aγ 各部分蛋白质的百分数为：
白蛋白%= (AA / A总)×100%;
1球蛋白%= (Aα1/ A总)×100%;
2球蛋白%= (Aα2 / A总)×100%；
球蛋白%= (Aβ / A总)×100%；
球蛋白%= (A γ / Aa 总)×100%
3. 染色:
通电完毕后用镊子将膜取出，直接浸于盛有氨基黑 10B的染色液中，染5分钟取出，立即浸入盛有漂洗液 的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止。用 滤纸吸干薄膜。
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4. 定量：
取试管6支，编好号码，分别用吸管吸取0.4N氢氧化钠4ml。 剪开薄膜上各条蛋白色带，另一空白部位剪一平均大小的薄 膜条（作为分光光度法调零管），将各条分别浸于上色述试 管内，不时摇动，使蓝色洗出。约半小时后，用分光光度计 进行比色，波长650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照， 读取白蛋白、α1、α2、β、γ球蛋白各管的吸光度值A。
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血清蛋白的pI大多在7.5以下，在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负 离子形式存在，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤维薄膜上分离 成A、α1、α2、β和γ五条区带。
蛋白名称 白蛋白
α
β γ
+
等电点 4.88
5.06
5.12 6.85-7.50
分子量
69000 α1：20000 α2：30000 90000-150000
156000-300000
白蛋白(A) α1
α2 β
γ
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醋酸纤维素薄膜的特性
醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗 透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有 用样量少，分离清晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂 蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。
醋酸纤维素薄膜经1,4－二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透 明，因而可得背景为无色的电泳图谱。
利用生物化学的方法，检测存在于血液中的各种离子、糖类、 脂类、蛋白质以及各种酶、激素和机体的多种代谢产物的含量， 叫做血生化检查。
在正常生理情况下，其各种化学成分的含量非常恒定。但是， 机体的生理变化和病理情况，可导致血液的某些化学成分的含 量发生较大的变化。所以分析血液的化学成分可以了解人体物 质代谢的状况，并协助诊断或者判断预后。
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四、 实验操作
1. 准备与点样：
1） 将薄膜切成2.5×8cm的小块，在薄膜无光泽面距一 端1.5cm处用铅笔划一线，表示点样位置。
2） 将薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上 （缓冲液盛于培养皿中），使膜条自然浸湿下沉。
3） 将充分浸透（指膜上没有白色斑痕）的膜条取出， 用滤纸吸取多余的缓冲液，把膜条两端各贴于两块玻片 上，使点样线空架。
甚至A/G比值倒置。
肾病综合征时，白蛋白降低，α2 、β球蛋白升高。
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实验二 血清尿素氮的测定
一、实验目的 1. 掌握血尿素氮的定义及其测定的意义。 2. 了解二乙酰一肟显色法的原理与操作。
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二、背景与原理
尿素的生成是肝脏的解毒功能之一。通常肾脏为排泄尿素的主要器官， 尿素从肾小球滤过后在各段小管均可重吸收，因此在血液中会有少量 的尿素存在，一般用血尿素氮（BUN）来衡量。