8.转录产物的加工

真核生物的tRNA加工
酵母tRNATyr加工为例
①转录产物前体具有特征 茎环结构的二级结构 ②RNAaseP D内切酶识别 二级结构，并切除5’端16nt 前导区和3’ 端额外的2nt ③ tRNA核苷酸转移酶将5’CCA-3’序列添加到3’端， 形成成熟的3’端 ④内切酶切除14nt的内含子，再将两分子片段连接
哺乳类动物的18S、5.8S和28S rRNA基因转录产生45S rRNA前体 酵母的17S、5.8S和26S rRNA基因的转录产物为37S的 rRNA前体。
新手产物 新生的rRNA前体与蛋白质结合，形 成巨大的前体核糖核蛋白(pre-rRNP)颗粒。 剪切过程 核仁、多个步骤 无内含子 大多数真核生物rRNA基因 有些rRNA基因有内含子，但转录产物中的内含 子可自体催化切除，或不转录内含子序列。例如， 果蝇的285个rRNA基因中有约1/3含有内含子，但都 不转录。四膜虫(Tetrahymena)的核rRNA基因和酵母 线粒体的rRNA基因含有内含子，它们的转录产物可 自体催化切除内含子序列。 机制: snoRNA指导的核苷酸修饰，以及snoRNA 与rRNA前体形成的特定立体结构为参与切割的 RNase提供了识别位点。
RNA processing
mature RNA.
8.1
原核生物RNA的转录后加工
在原核生物中，rRNA的基因与某些 tRNA的基因组成混合操纵子，其余tRNA基 因也成簇存在，并与编码蛋白质的基因组成 操纵子。它们在形成多顺反子转录物后，经 切割成为rRNA和tRNA的前体，然后进一步 加工成熟。除了少数例外，原核生物的 mRNA一经转录，通常都立即进行翻译，一 般不进行转录后的加工。
8.2.3 在3'-端添加-CCA
真核生物中所有tRNA前体分子均缺乏3'-端的CCA-OH结构，必须在tRNA核苷酸转移酶催化下， 由CTP和ATP提供胞苷酸和腺苷酸，添加3'-端的CCA-OH结构。
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8.2.4
核苷酸的修饰
tRNA分子中稀有核苷酸很多，有多种酶参与 tRNA分子核苷酸修饰，主要是多种tRNA甲基化酶， 催化tRNA分子特定位置上的甲基化，例如A → m7A， G55 → m7G55等。此外还有一些其它类型的酶，如 催化合成tRNAΔ2-异戊烯的tRNA异戊烯转移酶，催化 S4U以及含硫嘧啶化合物合成的tRNA硫转移酶等。
8.3.2 rRNA前体的核苷酸修饰 8.3.2.1 snoRNA的结构 已发现上百种snoRNA存在于核仁内，长约87～275nt，能 与核仁纤维蛋白或自身免疫抗原等结合，生成核仁小分子核糖 核蛋白体(snoRNP)。snoRNP可指导rRNA中核糖和碱基的修饰， 参与rRNA前体的剪切。 在指导核苷酸修饰的过程中，snoRNA分子内与rRNA互补 的序列片段，以高密集的方式复盖于rRNA分子的保守区域上。 新生的rRNA被加工修饰以后，在RNA解旋酶作用下，snoRNA 从rRNA解离下来，再与新生的rRNA前体结合，周而复始地参 与rRNA前体的加工，其作用具有分子伴侣的特征。 snoRNA分为两类。一类是C盒/D盒snoRNA，可借助互补序 列识别rRNA前体中进行甲基化和切割的位点，C盒的序列为 UGAUGA，D盒为CUGA。另一类是H盒/ACA盒snoRNA，含H 盒(ANANNA)和ACA盒，能识别假尿苷酸(ψ)化位点。
④酶的剪切，首先 RNaseⅢ剪切释放出16S、23S前体分
子， RNaseE剪切释放出5S前体分子；随后 RNase M16、M23 、 M5分别在其前体分子末端进一步剪切， 最终释放成熟的rRNA分子
8.1.3 原核生物mRNA前体的加工 细菌的转录和翻译不存在时空间隔，mRNA的初始转录 产物一般不需要加工，在转录的同时即可翻译。多顺反子的 mRNA可被翻译成多聚蛋白质，再切割成不同的蛋白质分子， 少数多顺反子mRNA需通过内切核酸酶切成较小的单位后 才进行翻译。例如，E.coli位于89～90位置的一个操纵子含有 rp1J(编码核糖体大亚基蛋白L10)、 rplL(编码核糖体大亚基蛋 白L7/L12)、rpoB(编码 RNA pol β亚基）和rpoC (编码 RNA pol β'亚基)4个基因，在转录出多顺反子mRNA前体后，由 RNase III将核糖体蛋白与RNA pol亚基的mRNA切开，各产生两个成
8.1.1
原核生物tRNA前体的加工
原核生物的tRNA基因以多顺反子(polycistron)的形式被转录，转录产物都是很长 的前体分子。通常由多个相同tRNA基因或 不同的tRNA串联排列，或与rRNA的基因， 或与编码蛋白质的基因组成混合转录单位。 tRNA前体必须经过切割和核苷酸的修饰， 才能成为有功能的成熟分子。
8.2 真核生物tRNA前体的转录后加工 8.2.1 真核生物tRNA前体的结构特点 真核生物tRNA基因的结构与原核生物有两个较大的差异。 (1) 基因排列 tRNA基因数目比原核生物多，E.coil约有 60个tRNA基因，果蝇有750个，酵母有320～400个，爪蟾约 8000个。真核生物的tRNA基因成簇排列，基因之间有一定间 隔。各tRNA基因作为独立单位转录， tRNA前体是单顺反子的。 (2) 内含子结构 真核生物tRNA基因有内含子，其前体必 须经过剪接。内含子的特点是： ① 长度和序列没有共同性，16～46个核苷酸。 ② 位于反密码子的下游(即在3‘-端一侧)。 ③ 内含子和外显子间的边界没有保守序列，其内含子的剪 接方式不符合一般规律。真核生物tRNA前体中内含子的精确 切除信号是tRNA分子高度保守的二级结构，而不是内含子的 保守序列，剪接需要RNase的参与。
第8章
转录产物的加工
加工是必要的吗？
基因转录的直接产物即初级转录物通常是没有功 能的，必须经历转录后加工才会转变为有活性的成熟 RNA分子。 转录产物的加工是基因表达的一个重要环节 核酶就是在研究转录产物加工时发现的。 参与转录产物加工的小RNA，及其与蛋白质的复 合物RNP如何影响某些基因的表达和细胞的功能，有 无可能用此途径控制疾病，
8.3 真核生物rRNA前体的转录后加工 8.3.1 rRNA基因的结构 rRNA基因在基因组内成串重复数百次，转录 区与非转录区交替 每个rRNA基因由16S～18S, 5.8S和26S～28S rRNA基因组成一个转录单位，彼此被间隔区分开， 经RNA pol I转录产生一个长的rRNA前体。
8.1.2 原核生物rRNA前体的加工 E.coli有rrnA～rrnG共7个rRNA转录单位 分散在基因组中，每个转录单位由16S rRNA、 23S rRNA、5S rRNA以及tRNA的基因组成。 它们在染色体上并不紧密连锁，但每个rRNA 的排列和序列十分保守。tRNA基因在操纵子 中的数量、种类和位置都不固定，或在16S rRNA和23S rRNA之间的间隔序列中，或在5S rRNA的3'-端之后。所有的转录单位都含有两 个启动子，P1在16S rRNA基因的转录起点上 游150～300bp处，P2在P1下游110bp处。
图8-1为原核生物rRNA前体加工的示意图，图中1所指的是 RNase III的水解位置，2所指的是RNase P的水解位置，3所指的 是RNase E的水解位置。
前体rRNA的加工过程
① 转录产物内部碱基配对折叠形成茎环结构
②茎环结构与蛋白复合，形成 RNPs
③特定碱基的甲基化(S-腺苷甲硫氨酸，SAM)
原核生物rRNA前体的加工
16S
23S
tRNA
5S
tRNA
rRNA基因的初级转录物为30S的 rRNA前体分子，其Mr 为2.1×106，约6500nt，5'-端为pppA。由于原核生物rRNA前 体的加工一般与转录同时进行，因此不易得到完整的前体。 rRNA前体的加工主要由RNase III负责，从RNase III缺陷型 的E.coli中可分离得到30S rRNA前体(P30)。RNase III是一种 负责RNA加工的内切核酸酶，它的识别部位是特定的RNA 双螺旋区。比较不同rRNA前体分子序列时发现，其间隔序 列很相似，且23S rRNA和16S rRNA各自的5'-端与3'-端可形 成茎环结构。RNase III在茎部错位两个2bp的位点切割，产 生16S rRNA的前体P16(17S)，和23S rRNA的前体P23(25S)。 5S rRNA的前体P5在RNase E作用下产生，RNase E可识别P5 两端形成的茎环结构。随后，P5、P16和P23两端的多余序 列需被核酸酶切除。
Cytoplasm Nucleus or Nucleolus
primary transcript
Removal of nucleotides addition of nucleotides to the 5’- or 3’- ends modification of certain nucleotides
8.1.1.2 tRNA分子5′-端的成熟 由RNaseIII水解生成的tRNA片段，其5'-端仍含有额外的核 苷酸，这些额外的核苷酸由RNase P催化切除。来自细菌和真 核细胞细胞核的RNase P结构非常类似，都含有RNA和蛋白质， 体外实验发现Ml RNA单独存在时，也有一定的催化活性。 tRNA前体分子的5'-端一般都有约40nt的前导序列，可以形成 RNase P能够识别的茎环二级结构，使RNase P能将tRNA前体5'端额外的核苷酸逐个切除。 8.1.1.3 核苷酸的修饰 成熟的tRNA分子中存在着许多的修饰碱基等成分，包括各 种甲基化碱基和假尿嘧啶核苷。tRNA修饰酶具有高度特异性， 每一种修饰核苷都有催化其生成的修饰酶。tRNA甲基化酶对碱 基及tRNA序列均有严格要求，甲基供体一般为S-腺苷甲硫氨酸。 tRNA分子中的假尿嘧啶核苷合成酶催化尿苷的糖苷键转移， 由尿嘧啶的N1变为C5。
(3) 添加3‘-端CCA 已知所有成熟tRNA分子的 3’-端都有CCA-OH结构，这是氨基酸接受部位的特 有结构。细菌有两类不同的tRNA前体，I型前体分 子的附加序列被切除后，即显露出自身所具有的3‘端CCA-OH结构。II型前体分子自身没有3’-端的 CCA结构，其成熟分子的CCA-OH结构是在切除3‘端附加序列后，在tRNA核苷酰转移酶的作用下，逐 个添加上去的。 tRNA + CTP → tRNA-C + PPi tRNA-C + CTP → tRNA-CC + PPi tRNA-CC + ATP → tRNA-CCA-OH + PPi
8.2.2 内含子的剪接
① tRNA内切核酸酶切割前体分子中的内含子； ② RNA连接酶将两个半分子连接在一起。又称为tRNA的半分子，是剪切 的中间产物。
3‘-端切点生成2’, 3‘-环磷酸 5'-端切点生成-OH基，由于3'-端 的末端结构特殊，不能直接连接， 需在环磷酸二酯酶作用下，使2', 3'-环磷酸水解，形成3'-OH和2'磷酸基。3'-端半分子的5'-OH在 多核苷酸激酶催化下磷酸化，才 能进行连接反应。在连接过程中， 首先由ATP通过形成连接酶AMP共价中间物将连接酶激活， 然后，将两个外显子通过3', 5' 磷酸二酯键连接起来。多余的2'磷酸由磷酸酶水解除去。
8.1.1.1
tRNA 3'-端的成熟
tRNA前体分子的3'-端是在多种RNase的共同参与下逐 步加工成熟的，在离体条件下，这些酶是RNase P、RNase F、 RNase D、RNase BN、RNase T、RNase PH、RNase II和多 核苷酸磷酸化酶(polynucleotide, PNPase)。 (1) 切割 首先由内切核酸酶RNase P将tRNA前体分子 水解成为3'-端和5'-端仍含有额外核苷酸的tRNA片段，随后， 由内切核酸酶RNase F对tRNA前体靠近3'-端处进行逐步切割。 研究发现，RNase PH和RNase T对tRNA前体分子3'-端的正确 剪接和成熟十分重要。 (2) 修剪 外切核酸酶RNase D从前体3'-端再逐个切去附 加序列，这个酶具有严格的选择性，它能识别整个tRNA分 子的结构，是tRNA的3'-端成熟酶。
熟的mRNA，之后再各自进行翻译。?
某些噬菌体多顺反子mRNA也有类似的加工过程，如大肠 杆菌T7噬菌体早期转录区的6个基因，转录生成一条多顺反子的 mRNA前体，前体分子内每个mRNA之间分别形成茎环结构。 由RNase III对茎结构内不配对的小突环进行酶切，将前体分子 酶切成为6个成熟的mRNA，再进行各自的翻译。研究发现，这 种由茎环结构调控的RNA加工有一定的普遍性。