多管发酵法步骤和材料清单
实验十一 多管发酵法测定水中大肠菌群PPT教学课件
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Байду номын сангаас
三、实验材料
1、培养基： 乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍
浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套 管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。 2、仪器或其他用具：
载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭 菌试管等。
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四、操作步骤
1．水样的采取 实验室提供水样 2．河水的检查 （1）初（步）发酵实验
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二、实验原理
发酵法： 又称多管发酵法或三步发酵法
1) 初发酵（推测试验）： 将不同稀释度的水样，分别接种于含有乳
糖等糖类的培养液中（3倍或1倍乳糖液），经 37 ºC培养24 h，观察产酸产气情况，培养基内 加有溴甲酚紫作为PH指示剂，细菌产酸后， 培养基即由原来的紫色变为黄色，以初步判 断是否有大肠菌群存在。
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2）平皿分离（证实试验）
水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能引 起糖类发酵，因此需要进一步证实。
将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美 兰培养基，37 ºC培养24 h，根据菌落特征（带 核心的、有金属光泽的深紫色菌落），挑取可 能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进 一步证实是否为大肠菌群。
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10ml×100 1ml×100 1ml×10-1 1ml×10-2
3×
1×
1支
1×
1×
各3支
图1 2020/12/10 多管发酵测定水中大肠菌群的操作步骤和结果解释 11
PPT教学课件
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水样的稀释： 10-1与10-2
总大肠菌群多管发酵法测定步骤
总大肠菌群多管发酵法测定步骤# 总大肠菌群多管发酵法测定步骤的理论研究大家好，我是这个领域的一名专家。
今天我要和大家分享一下关于总大肠菌群多管发酵法测定步骤的一些理论问题。
我们要知道什么是总大肠菌群。
简单来说，总大肠菌群就是肠道里的一种微生物群落，它们的数量可以反映出一个人是否健康。
而测定总大肠菌群的方法有很多种，其中最常用也最准确的一种是多管发酵法。
那么，多管发酵法是怎么测定总大肠菌群的呢？简单来说，就是将待测样品中的总大肠菌群接种到不同的培养基上进行培养，然后通过观察不同培养基上的菌落生长情况来判断总大肠菌群的数量。
在实际操作中，我们需要准备几个不同的培养基，每个培养基上都涂上一层薄薄的液体。
然后将待测样品中的总大肠菌群接种到这些培养基上，再将这些培养基放入恒温箱中进行培养。
在这个过程中，我们需要注意一些细节。
比如，培养的时间需要控制好，不能太长也不能太短；培养的温度也需要控制好，不能太高也不能太低；还有，培养基的选择也很重要，要选择适合总大肠菌群生长的培养基。
经过一段时间的培养后，我们就可以观察各个培养基上的菌落生长情况了。
一般来说，如果某个培养基上的菌落数量较多，就说明在这个样品中总大肠菌群的数量较多；反之，如果某个培养基上的菌落数量较少，就说明在这个样品中总大肠菌群的数量较少。
我们就可以根据各个培养基上的菌落生长情况来计算出总大肠菌群的数量了。
这就是多管发酵法测定总大肠菌群的基本步骤。
总的来说，多管发酵法是一种非常准确、可靠的测定总大肠菌群的方法。
它的操作过程虽然复杂了一些，但是只要我们掌握了正确的方法和技巧，就能够准确地测定出样品中总大肠菌群的数量。
这对于我们了解肠道微生物群落的情况、预防肠道疾病等方面都有着重要的意义。
实验九 多管发酵法测定水中大肠菌群
证实有大肠菌群存在后，再根据复发酵的阳性管
（瓶）数查表，即得每升水样中的大肠菌群数。
▲ 将100、10、1、0.1（10-1）ml水样的发酵管 结果查表3 ▲ 将10、1、0.1（10-1）、0.01（10-2）ml水 样的发酵管结果查表4
五 实验报告
实验课程论文
封面格式 《水处理微生物学》课程实验
3 复发酵试验
以上大肠菌群阳性菌落，经涂片革兰氏染 色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再 进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸 又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
水样 接种
初步 发酵
产酸 产气
大肠菌群
厌氧芽孢杆菌
好氧芽孢杆菌
平 板 分 离
鉴 别 培 养 基
产酸 复发酵
大肠菌群
二 基本原理
多管发酵法包括三个部分
▲ 初发酵试验 ▲ 平板分离 ▲ 复发酵试验
1 初发酵实验
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置杜氏小套管。 乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群 能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基 内加有溴甲酚紫作为PH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来 的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的 作用。 水样接种于发酵管内，37℃下培养： （1）24h内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变 ，说明水中存在大肠杆菌，疑为阳性结果； （2）在量少的情况下，也可能延迟48h后才产酸产气，此时应 视为可疑结果。
（1） 稀释水样：原水样 10-1
10-2
（2） 初步发酵试验
——接种水样
混匀后，37℃培养24h，24h未产气的继续培养至48h。
水样稀释及接种
多管发酵法检测生活饮用水中总大肠菌群
多管发酵法检测生活饮用水中总大肠菌群摘要：总大肠菌群是指一群需氧及兼性厌氧的在37℃生长时能使乳糖发酵、在24小时内产酸产气的革兰阴性无芽胞杆菌。
总大肠菌群既包括存在于人及动物粪便的大肠菌群，也包括存在于其他环境中的大肠菌群。
在日常的检测过程中，特别是在饮用水的检测中，总大肠菌群的检测对检测环境、检测人员的操作水平和经验要求都很高，且检测时间长达三天，因此其检测结果的准确率都和那提高。
笔者在长期检测中对一些检测过程中出现的问题着重进行了归纳，通过反复的试验，和仔细观察后，摸索出了一些规律和方法，在此加以总结，有助于以提高总大肠菌群检测的高效性和准确性。
关键词：饮用水、总大肠菌群、多管发酵根据总大肠菌群应具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌，在37℃24h内能发酵乳糖并产酸产气，能在选择性培养基上产生典型菌落。
在检测时可用多管发酵法，以100mL水样中污染的总大肠菌群最可能数（MPN）表示的。
不同的方法标准略有差异，但检测步骤大体相同，即：乳糖发酵实验、分离培养和证实试验。
按《生活饮用水标准检验方法》微生物指标GB5750.12-2006的规定，总大肠菌群检测的步骤为：2.1.5.1乳糖发酵实验（初发酵）；2.1.5.2分离培养；2.1.5.3证实实验（复发酵）。
而检测的难点主要在于步骤2.1.5.1、2.1.5.3中“产酸产气”的确认及步骤2.1.5.2中的菌落形态及染色的确认。
初发酵阳性管，不能肯定就是总大肠菌群，经过证实试验后，有时可能成为阴性。
经过多次观察发现在复发酵成阳性的样品，在初发酵时都有着一些共同的现象。
在此，我们从曾经受过微生物污染水样中选出两个最具代表性的样品（污染1＃污染2＃）为例，加以说明。
1、乳糖发酵实验中产酸与产气的判断：分别取10ml水样接种到5只10ml双料乳糖蛋白胨培养液中，置于36℃±1℃的培养箱内培养24h±2h，如所有乳糖蛋白胨培养管都不产酸产气，则报告总大肠菌群阴性，如产酸产气则进行下一步实验。
多管发酵法测定水中大肠菌群
综合实验报告书（2014~2015 学年）实验题目多管发酵法总测定水中大肠菌群学院名称生物与食品工程学院专业（班级）2012级生物工程姓名（学号）孙大林20122151032015年01 月13日多管发酵法测定水中大肠菌群摘要：利用多管发酵法检测自来水和池塘水中大肠菌群的数量，以对不同水样的大肠菌群污染情况做出初步判断。
根据«中华人民共和国国家标准生活饮用水标准检验法»中有关大肠菌群的检测方法与指标对上述水样进行检测。
通过记录阳性管数并查最大可能数表（MPN）查出不同水样中大肠菌群的可能含量。
多管发酵法的原理是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验等三个步骤进行实验，得出水样中总大肠菌群数，实验结果以最大可能数MPN表示。
关键词：多管发酵法、大肠菌群、最大可能数（MPN）Abstract: the use of multiple tube fermentation test of tap water and the number of coliform group, pond water in different water samples of coliform bacteria pollution make a preliminary judgment.According to "the People's Republic of China national drinking water standard inspection » in the fecal coliform detection method and index of the water samples fortesting.Tube by a positive record number (MPN) maximum possible log tables and check of coliform bacteria may content in different water samples.Multi-tube fermentation principle is based on fecal coliform bacteria can ferment lactose produce acid gas and possess a gram negative, no spore, assumes the rods and so on characteristics, through the early (step) fermentation test, plate separation and the complex fermentation test three steps of the experiment, it is concluded that the total number of coliform bacteria in water samples, the experimental results with the greatest possible number of MPN said.Key words: multi-tube fermentation coliform groupthe greatest possible number (MPN)由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。
多管发酵法测定水中大肠菌群实验报告
多管发酵法测定水中大肠菌群摘要：初步发酵实验中将水样接种与乳糖蛋白胨液体培养基的发酵管内，37度下培养，24内小管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，为阳性如果，如果出现产生气泡但不变色或者变色但不产气的情况，应该延长培养至48小时，若仍不的为阴性反应。
平板分离实验中把初实验产期产酸的试管的菌接到伊红美兰琼脂平板上然后培养24小时。
复发酵实验中将以上大肠杆菌阳性菌落，经涂色染色为革兰阴性无芽孢杆菌，通过次试验进一步证实原理：初发酵实验：发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一个杜氏小管。
乳糖能其选着作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠杆菌能发酵乳糖而产气产酸。
为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为指示剂，细菌产酸后培养基由原来的紫色变为黄色。
初步发酵实验中将水样接种与乳糖蛋白胨液体培养基的发酵管内，37度下培养，24内小管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，为阳性如果，如果出现产生气泡但不变色或者变色但不产气的情况，应该延长培养至48小时，若仍不产气的为阴性结果。
平板分离：伊红美兰琼脂培养基有伊红和美兰两种染料，在此作为指示剂，大肠杆菌发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料及结合，使培养基产生有金属光泽的深紫色菌落。
复发酵实验：以上大肠杆菌阴性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢的，通过此试验进一步证实。
原理与初发酵实验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠杆菌阴性结果。
材料与用具：1.培养基乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置杜氏小管）三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（内有杜氏小管）伊红美兰琼脂平板2．无菌水3. 用具载玻片灭菌带玻璃塞空瓶灭菌试管灭菌吸管方法：1水样的采取从不同水体（自来水、河水）中采集样品2自来水检查（1）初发酵实验在2个含有50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入100ml水样。
在10支含有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样。
生化培养箱多管发酵法注意事项
生化培养箱多管发酵法注意事项1．样品的保存采样用的容器使用前应盖好瓶盖，用牛皮纸将瓶盖和瓶颈处包裹好，置干燥箱160℃-170℃干热灭菌2h，或用高压蒸汽灭菌器121℃灭菌15min。
采样后水样的正确保存也很重要，如保存不当可使样品中的大肠菌群细菌死亡或在一定条件下再生长，这些都将影响检测结果的准确性。
检测室接到水样后，应立即检测，如因故不能检测时，应立即将样品置于冰箱内(2℃-10℃)并于2小时内检测。
2．培养温度的要求总大肠菌群中的细菌除生活在肠道中外，在自然环境中的水与土壤中也经常存在，但此等在自然环境中生活的大肠菌群培养的最合适温度为25℃左右，如在37℃培养则仍可生长，但如将培养温度再升高至44．5℃，则不再生长，而直接来自粪便的大肠菌群细菌，习惯于37℃左右生长，如将培养温度升高至44．5℃仍可继续生长。
因此，可用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分，两种方法也都基于此理。
将接种好的样品或装有滤膜的培养基放入生化培养箱时，箱内温度一定要达到所要求的温度(44.5±0.5℃)时，方可放入。
如用恒温水浴箱时，其水面要高于接种物面，放滤膜的培养皿要沉到水浴箱底部。
3．加氯水样的处理经氯处理消毒过的水样，水中含有一定量的余氯，使大肠菌群处于受损或受抑制状态，在采集水样时应提前在采样瓶中加硫代硫酸钠，硫代硫酸钠可以脱氯，使受损的细菌得以复苏与修复，从而避免出现计数结果偏低甚至假阴性的现象。
此外余氯对滤膜法培养的细菌其抑制作用尤为明显，所以抽滤时应对水样进行大量无菌水稀释，以减少余氯的残留。
4．培养物质的制备与保存⑴.多管发酵法所使用的培养液在分装于各发酵管中后，应将发酵管尽快放于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min(注意：这个温度也应控制好，既达到灭菌的作用，还要防止培养物质分解流失)，然后贮存于冰箱或暗处备用。
⑵.滤膜法所采用的M-FC培养基多使用外购的成品，培养基中苯胺蓝的纯度和质量往往影响菌落的颜色，因此，无菌包装的成套培养基在使用前，最好先接种典型粪大肠菌，以观察对比菌落的颜色，来鉴定其稳定性。
Binder生化培养箱在多管发酵法的应用
Binder生化培养箱在多管发酵法的应用1．多管发酵法初发酵实验发酵管内装有单倍或三倍乳糖蛋白胨培养液，并在内倒置有小玻璃管。
培养液中加入溴甲酚紫作为酸度指示剂，细菌产酸后，培养液即由原来的紫色变成黄色。
产酸产气的发酵管表明试验阳性，如在倒管内产气不明显，可轻拍发酵管，有小气泡升起为阳性。
复发酵实验轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm接种环将培养物（2-3环）转接到EC培养液中，在44.5℃±0.5℃下培养24h±2h（提高培养温度可造成不利于来自自然环境的大肠菌群的生长）。
培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。
2．滤膜法滤膜是一种微孔性滤膜，孔径0.45μm。
将水样注入已灭菌的放有滤膜的过滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于M-FC培养基上，在44.5℃±0.5℃下培养24h±2h。
粪大肠菌群菌落在M-FC培养基上呈蓝色或蓝绿色，其他非粪大肠菌群菌落成灰色、淡黄色或无色。
正常情况下，由于温度和玫瑰酸盐试剂的选择性作用，在M-FC培养基上很少见到非粪大肠菌菌落。
二．两种方法的注意事项1．培养温度的要求总大肠菌群中的细菌除生活在肠道中外，在自然环境中的水与土壤中也经常存在，但此等在自然环境中生活的大肠菌群培养的最合适温度为25℃左右，如在37℃培养则仍可生长，但如将培养温度再升高至44．5℃，则不再生长，而直接来自粪便的大肠菌群细菌，习惯于37℃左右生长，如将培养温度升高至44．5℃仍可继续生长。
因此，可用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分，两种方法也都基于此理。
将接种好的样品或装有滤膜的培养基放入生化培养箱时，箱内温度一定要达到所要求的温度（44.5±0.5℃）时，方可放入。
如用恒温水浴箱时，其水面要高于接种物面，放滤膜的培养皿要沉到水浴箱底部。
2．加氯水样的处理经氯处理消毒过的水样，水中含有一定量的余氯，使大肠菌群处于受损或受抑制状态，在采集水样时应提前在采样瓶中加硫代硫酸钠，硫代硫酸钠可以脱氯，使受损的细菌得以复苏与修复，从而避免出现计数结果偏低甚至假阴性的现象。
多管发酵法
多管發酵法目的：大腸桿菌定義為革蘭氏陰性菌，好氧或兼氧之無芽孢桿菌能於35±1℃、48±3小時內、分解乳糖產生酸及氣體。
常作為環境工程水質污染程度的指標，若該水中有發現大腸桿菌表示可能受到汙染，污染指標的優點：1.大腸桿菌常存溫血動物的消化道中，對人體無害2.大腸桿菌的生存力強，如水中無大腸桿菌，則可確定無其他菌類。
3.可依菌數量判斷污染時間4.僅須少量水體就可以檢測原理1了解多管發酵法三種試驗：推定、確定及完成試驗之原理目的對象。
2本實驗僅以推定試驗為主3紀錄水樣來源，並進行連續10倍稀釋，每個濃度至少要有75Ml之水量4推動試驗使用之培養基為硫酸月桂胰化蛋白培養基LST，配置時，要配置成2倍濃度之量，且水量至少250ml，因此，元1000ml水加36gLST，2倍為1000ml 水加72g LST，現僅要250ml，故LST 72/1000=X/255準備16跟試管，內附竇漢氏試管(要倒放)分別加入15ml LST培養液，旋上蓋子但不可旋緊，放入高溫高壓滅菌釜滅菌6滅菌完，用水浴法降溫後，始可加入水樣7.3個不同濃度之水樣，每一個濃度各家15ml至5根含LST之試管，共15根試管，第16根則加入15ml無菌水做為控制組8結束後放置37℃培養箱，隔天看是否有收集氣體9竇漢氏試管有收集氣體為陽性反應10紀錄各濃度呈陽性反應之試管後，查表511攻勢MPN/100ml=稀釋倍數x查表所得值/三種稀釋度之中間水樣體積設備&儀器1.三角錐瓶2.螺紋試管3.試管蓋4.產氣管5.吸球6.玻璃滴管7.不鏽鋼滅菌桶8.隔熱手套9.量筒10.稱藥杓11.稱藥紙12.高溫高壓滅菌釜13.電子分析天平14.恆溫培養箱培養基每1000ml二段水需72.0gLST培養基，而此次配置只需要250m l，因此LST只需要18g菌種或採樣來源菌種：無採樣來源：實驗室正前方水池實驗結果MPN/100ml=10-1X2/15ml查表所得值=2三種稀釋度之中間水樣體積=15ml因此待測水樣之大腸菌數為0.013310^-1 ↓10^-2↓10^-3↓|問題1.以大腸桿菌作為水質污染指標的優點為何？目前我國飲用水質標準中大腸桿菌的規定現值為何？An s：大腸桿菌常存溫血動物的消化道中，對人體無害大腸桿菌的生存力強，如水中無大腸桿菌，則可確定無其他菌類。
多管发酵法测定水中大肠菌群
多管发酵法测定水中大肠菌群
第1页
多管发酵法测定水中大肠菌群
一、试验目标 二、试验原理 三、试验材料 四、试验步骤 五、试验汇报
多管发酵法测定水中大肠菌群
第2页
一、试验目标
1、学习测定水中大肠菌群数量多管发酵法。 2、了解大肠菌群数量在饮水中主要性。
多管发酵法测定水中大肠菌群
划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37 ℃培养 18～24 h，将符合以下特征菌落进行染色镜检。
深紫黑色，有金属光泽；
紫黑色，不带或略带金属光泽；
淡紫红色，中心颜色较深。
多管发酵法测定水中大肠菌群
第9页
（3）复发酵试验 将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌菌株重复初
步发酵试验。并依据初发酵管试验阳性管查表， 即得大肠菌群数。
多管发酵法测定水中大肠菌群
第4页
2）平皿分离（证实试验）
水中除大肠菌群外，还有其它细菌可能引 发糖类发酵，所以需要深入证实。
将初发酵管中已发酵菌液接种于伊红美兰 培养基，37 ºC培养24 h，依据菌落特征（带关 键、有金属光泽深紫色菌落），挑取可能为大 肠菌群菌落制片，经革兰氏染色，深入证实是 否为大肠菌群。
水样稀释： 10-1与10-2
接种：分别吸收1ml 10-2 、 10-1和原水样接入装 有10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管 ；另取10ml原 水样接入装有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管 ， 混匀后，37 ℃培养24 h，24 h未产气继续培养48 h。
多管发酵法测定水中大肠菌群
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（2）平板分离 将经24 h和48 h培养后产酸产气发酵管，分别
2.思索题
（1） 何谓大肠菌群，它主要包含哪些细菌属？
生化培养箱的多管发酵法与滤膜法
生化培养箱的多管发酵法与滤膜法生化培养箱是一种专门用于生物实验的设备，它能够提供温度、湿度、氧气和二氧化碳等环境条件，满足生物生长繁殖所需的各种条件。
生化培养箱的应用范围非常广泛，常见的应用包括细菌、真菌、细胞等的培养、生物转化、酶反应和蛋白质表达等。
在生化培养箱中进行发酵是生物制药、食品工业等生产过程中常用的方式之一。
通常，发酵过程需要培养大量的微生物，而且需要在不同的环境条件下进行控制。
为了满足这些要求，人们发明了各种不同的发酵方法。
其中，多管发酵法和滤膜法是两种常见的发酵方法。
多管发酵法多管发酵法是在生化培养箱中进行的一种传统发酵方法。
这种方法的主要特点是使用多个发酵管，在同一时刻培养多个发酵物。
每个发酵管都有自己的通气孔和温度控制装置，可以独立控制温度、湿度和空气流动速度等生长条件。
多管发酵法的优点是节约空间，同时方便多种细菌在同一条件下进行培养。
但是这种方法的缺点也非常明显，首先，每个发酵挂都需要单独控制，这样会增加操作复杂度；其次，由于多个发酵管都需要独立控制生长条件，设备和维护成本也相对较高。
滤膜法滤膜法是一种新兴的发酵方法，这种方法使用的是一种特殊的多层膜结构，这种膜可以过滤气体和水分，但是可以防止微生物通过。
这种方法可以在生化培养箱中同时进行多个发酵过程，而且不需要单独控制每个发酵的生长条件。
相对于多管发酵法，滤膜法有多个优点。
首先，滤膜法可以节约空间，同时也可以节省设备和维护成本。
其次，滤膜法更加方便和易于操作，只需要在膜上放置发酵物即可，无需像多管发酵法中一样单独控制每个发酵管的成长条件。
此外，由于滤膜法可以提供一定的通气条件，微生物也可以在这种环境中更好地生长和繁殖。
尽管滤膜法有很多优点，但是也存在一些缺点。
首先，由于膜的特殊结构及特殊性质，滤膜法通常需要使用一种新型的耐高温和耐酸碱的材料，这增加了生产成本。
其次，滤膜法需要一定的技术来保证滤膜的完整和性能，否则可能会影响发酵过程的稳定性和可靠性。
总大肠菌群多管发酵法测定步骤
总大肠菌群多管发酵法测定步骤总大肠菌群多管发酵法测定步骤，这可是个不简单的活儿。
咱们得一步一步来，不能马虎。
先说说第一步，准备工作。
1.1 准备实验器材和试剂咱们得准备好实验用的器材和试剂。
实验器材包括：多管发酵装置、恒温水浴锅、磁力搅拌器、显微镜、比色计等。
试剂方面，主要有大肠杆菌培养基、胰蛋白胨、酵母提取物等。
这些器材和试剂都是实验成功的关键，可不能马虎。
1.2 准备大肠杆菌培养基接下来，咱们要准备大肠杆菌培养基。
这个过程可不像吃火锅那么简单，需要耐心和细心。
将胰蛋白胨和酵母提取物分别加入到适量的水中，加热至120°C左右，然后冷却至50°C左右。
接着，将培养基中的氯化镁、硫酸铜等成分加入到上述溶液中，搅拌均匀。
将培养基倒入培养皿中，放入恒温箱中进行灭菌处理。
第二步，大肠杆菌的接种与培养。
2.1 接种大肠杆菌在完成了培养基的制备后，接下来就是接种大肠杆菌了。
这个过程可不能让大肠杆菌逃跑哦！将待测样品加入到培养基中，然后用无菌吸管轻轻搅拌均匀。
接着，将搅拌好的样品转移到多管发酵装置中，进行后续的发酵操作。
2.2 培养大肠杆菌将大肠杆菌接种到培养基中后，接下来就是等待它们成长的过程了。
这个过程可不像看电影那么轻松，需要耐心等待。
一般来说，大肠杆菌在适宜的温度和湿度条件下，大约需要24-48小时才能开始繁殖。
在这个过程中，我们可以观察到大肠杆菌的数量随着时间的推移而逐渐增加，这是一个很好的信号。
第三步，发酵过程的控制与监测。
3.1 控制发酵条件在完成了大肠杆菌的接种与培养后，接下来就是控制发酵条件了。
这个过程可不像玩游戏那么简单，需要我们时刻关注。
我们需要将多管发酵装置放入恒温水浴锅中进行恒温培养。
我们需要使用磁力搅拌器对发酵液进行搅拌，以保证发酵过程的顺利进行。
我们还需要定期检测发酵液中的大肠杆菌数量、营养物质含量等指标，以便及时调整发酵条件。
3.2 监测发酵过程在控制好发酵条件后，接下来就是监测发酵过程了。
实验三 多管发酵法检测水中的大肠菌群
实验三多管发酵法检测水中的大肠菌群（一）实验目的1. 了解饮用水和水源水大肠菌群的原理和意义2．学习检测水中大肠菌群的方法（二）实验原理大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。
大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌（Escherichia coli）为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48小时内发酵乳糖并产酸产气。
我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过三个。
多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。
乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
1．初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。
48小时后仍不产气的为阴性结果。
2．平板分离初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endo′s medium）或伊红美蓝琼脂（eosin methylene blue agar,EMB agar）平板上划线分离菌落。
3．复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
（二）实验器材1.水样自来水2．试剂乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝或复红亚硫酸钠琼脂平板，革兰氏染液。
3．仪器及其它用品载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管，革兰氏染液，显微镜，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，灭菌三角瓶等。
（四）实验方法1．水样的采取水源水2．初发酵试验取16支发酵管，其中10支用移液管加入10ml一倍的乳酸蛋白胨培养液，5支加入5ml 三倍乳糖蛋白胨培养液，1支加入9ml自然水。
[工作]多管发酵法步骤和材料清单
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[工作]多管发酵法步骤和材料清单多管发酵法测定大肠杆菌一、实验器材及药品:序号实验用品(按取2个水样) 数量 1) 试管(带试管塞) 40支2) 小倒管 35个 3) 试管架 2个 4) 10ml量筒 1个 5) 10ml移液管 2个 6) 吸耳球 2个 7) 1ml移液管 8个 8) 接种环 1个 9) 酒精灯 1个 10) 恒温箱 1个 11) 蛋白胨培养液 1瓶 12) EC培养液 1瓶 13) 电炉 1个 14) 500ml 烧杯 4个 15) 玻璃棒(搅拌用) 2个 16) 取样瓶 2个 17) 标签纸和记号笔 1个 18) 电子天平，取样勺 1个 19) 高压灭菌锅 1个 20) 蒸馏水 1桶 21) 洗瓶 1个 22) 冰箱(如果水样和培养基不用长时间放置，可以不用) 1个 23) 恒温水浴锅 1个24) 其它实验辅材若干二、实验步骤2.1 水样接种量将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。
每个样品至少用三个不同的水样量接种。
同一接种水样量要有五管。
相对未受污染的水样接种量为10mL、1mL、0.1mL。
受污染水样接种量根据污染程度接种1mL、0.1mL、0.01mL 或0.1mL、0.01mL、0.001mL 等。
使用的水样量可参考下表1。
表1 接种用水量参考表如接种体积为10ml则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5ml;如接种量为1ml或少于1ml，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL 中。
2.2 初发酵试验将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。
在37??0.5?下培养24h?2h。
产酸和产气的发酵管表明试验阳性。
如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。
2.3 复发酵试验轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到EC 培养液中。
在44.5??0.5?温度下培养24h?2h(水浴箱的水面应高于试管中培养基液面)。
多管发酵法
实验九水中总大肠菌群的测定－多管发酵法一、实验目的和要求1、掌握多管发酵法测定水中总大肠菌群的技术。
2、预习第二章有关活性污泥的有关内容。
二、原理总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。
多管发酵法的原理是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。
试验结果以最可能数（most probable number），简称MPN表示。
三、仪器1.高压蒸气灭菌器。
2.恒温培养箱、冰箱。
3.生物显微镜、载玻片。
4.酒精灯、镍铬丝接种棒。
5.培养皿（直径100mm）、试管（5×150mm），吸管（1、5、10mL）、烧杯（200、500、2000mL）、锥形瓶（500、1000mL）、采样瓶。
培养基及染色剂的制备：1.乳糖蛋白胨培养液：将10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解于1000mL 蒸馏水中，调节溶液pH为7.2—7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于121℃高压灭菌器中灭菌15min，贮存于冷暗处备用。
2.三倍浓缩乳糖蛋白陈培养液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。
除蒸馏水外，各组分用量增加至三倍。
3.品红亚硫酸钠培养基（1）贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20—30g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入3.5g磷酸氢二钾及10g蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水补充到1000mL，调节溶液pH至7.2—7.4。
趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加10g乳糖，混匀，定量分装于250或500mL锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在121℃灭菌15min，贮存于冷暗处备用。
（2）平皿培养基的制备：将上法制备的贮备培养基加热融化。
根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌试管中；再按比例称取无水亚硫酸钠，置于另一灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min（灭菌）。
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多管发酵法测定大肠杆菌一、实验器材及药品：
二、实验步骤
2.1 水样接种量
将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。
每个样品至少用三个不同的水样量接种。
同一接种水样量要有五管。
相对未受污染的水样接种量为10mL、1mL、0.1mL。
受污染水样接种量根据污染程度接种1mL、0.1mL、0.01mL 或0.1mL、0.01mL、0.001mL 等。
使用的水样量可参考下表1。
表1 接种用水量参考表
如接种体积为10ml则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5ml;如接种量为1ml或少于1ml，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL 中。
2.2 初发酵试验
将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。
在37℃±0.5℃下培养24h±2h。
产酸和产气的发酵管表明试验阳性。
如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。
2.3 复发酵试验
轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到EC 培养液中。
在44.5℃±0.5℃温度下培养24h±2h（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面）。
接种后所有发酵管必须在30min 内放进水浴中。
培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。
三、结果的计算
根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目，从表2 或表3 中查得每升水样中的粪大肠菌群。
接种水样为100mL2 份、10mL10 份、总量300mL 时，查表2 可得每升水样中的粪大肠菌群；
接种5份10mL 水样、5 份1mL 水样、5 份0.1mL 水样时，查表3 求得MPN 指数，MPN 值再乘10，即为1L水样中的粪大肠菌群。
如果接种的水样不是10mL、1mL 和0.1mL，而是较低的或较高的三个浓度的水样量，也可查表3 求得MPN 值，再经下式计算成每100mL 的MPN 值。
附：（两种培养基也可以直接购买）
单倍乳糖蛋白胨培养液成分；10g蛋白胨，3g牛肉浸膏，5g乳糖，5g氯化钠， 1.6%溴甲
酚紫乙醇溶液1ml，1000ml蒸馏水。
配置时调节pH：7.2—7.
4
EC培养液成分：20g胰胨，5g乳糖，1.5g胆盐三号，4g磷酸氢二钾，1.5g磷酸二氢钾，5g 氯化钠，1000ml蒸馏水。
灭菌后pH为6.9.。