疏水作用色谱中流动相组成对溶质保留行为的影响

! 结果与讨论
! " # 盐对溶质保留的影响 实验表明， 芳香醇同系物中仅有苯甲醇、 苯乙 醇、 苯丙醇、 苯丁醇能够在本文所述的实验条件下洗 脱， 因此， 本文仅研究这*种小分子同系物的保留行 为。在 0 已证实蛋白质的容量因子的对数 < 5 中， ［0 呈线性关 # "与流动相中水浓度的对数# )］ =! = ’ 系， 符合 ( >? @ A 理论中的表达式： ［0 （ ） # "B # #C$ # )］ 9 =! = = ’ 式中的# # 是反映溶质与固定相间亲和势的一个 = 参数， ［0 为流动相中水的物质的量浓度， )］ $ 表示 ’ 溶质分子被固定相吸附时， 从溶质分子与固定相接 触表面间释放出的水分子数。$ 值已作为反相色谱 （A ） 中溶质、 流动相和固定相性质以及 0 1 $ 5 < 5中
第# ’卷第)期 ! " " #年# #月 !" !!!!!!!!"
色
谱
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研究报告
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! 引言
疏水作用色谱 （7 具有分离条件温和、 能维 8 9） 持蛋白质的生物活性和天然分子构象的优点， 已被 广泛应用于生物大分子的分离和纯化， 以及基因工 程和生命科学领域内的蛋白折叠、 变性蛋白的复性
保留模型 （> ?@ $ A
［ ］ = ） 等理论。根据优先水化作用
机理， 当水合蛋白分子与固定相作用时会释放出蛋 > ?@ $ A 理论则认为， 水合蛋白与水合固定相作用时， 从两者接触表面间
［ ］ ) ， 即> 会释放出一定数量的水分子 ?@ $ A 理论中 ［ ］ ; 白质表面结合的水分子 ， 而
［ ］ ’ 系 ， 但这仅适用于由盐析性的盐组成的流动相情
况。依据 ( 溶质保留因子与 $ 值间存 >? @ A 理论， 在下列关系：
图# 在 （$ ［% 作图 % ( ) "对* )］ +! + &） ’ & 流动相中各种溶质的* ’ ［% , " # . / 0 * 1 0 2 34 * 5 6 7 5 8 * "9 7 * )］ + +! + ’ （ ） 8 5 3 0 2 : / 7 5 * ; 6 0 1 6 / 0< 5 = * 04 / 2 7 0 5 8$ % ( ) &’ & ； ； ； 9 F G H 8 I # & # 6 " K " # ’ F K H 8 H L K # & # 6 " K " # D F D @ K H 8 # @ 9 @ M " & 8 " # J 3 J 3 J 3 3 ； （! ； * F * @ K H 8 # @ 9 @ G N L & 8 " # . F ! @ 6 K ! " L M O 7 8 " H 8 @ 5 K @ 2） ; F " P & # @ 3 J J J 3 = J （) ； （+ ； （$ ） ； 2） 4 F G " P 7 8 H O H O N !& # G N ! 7 8 ( 2） : F # O " I ! H O Q F G N ! 7 8 J J J （5 ；9 （" ；9 6 " 8 & # G N ! 7 8 " 8） , F @ # & 6 L " # " G N # 7 8 @ $ & 6 L） 9 F ! " # " G 7 8 = J = " （? ） ； （5 " 9 ’ F 6 L " 6 K M " ! H L @ 5） F J J J
［ ］ # 等研究领域 。生物大分子在 7 8 9 中的保留是基
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疏水作用色谱中流动相组成对溶质保留行为的影响
赵建国， 姚 丛， 卫引茂， 耿信笃
（西北大学现代分离科学研究所 现代分离科学陕西省重点实验室，陕西 西安 % ） # " " ) ’ 摘要： 首次研究了疏水作用色谱 （7 ） 中芳香醇同系物在不同种类盐流动相中的保留行为。以计量置换保留模型 8 9 中小分子与生物大分子保留行为的差别， 以及不同流动相组成对两种类型溶质的洗脱范 中的参数 ! 分析了 7 8 9 围及洗脱能力的影响。与反相色谱相似， 芳香醇在 7 8 9 中的保留仍存在同系物规律。比较了小分子和生物大分子 在不同盐溶液中的 ! 值变化， 表明流动相中的盐仅改变小分子与固定相的水合程度， 而对生物大分子， 除改变其和 固定相水合程度外， 还会影响生物大分子与固定相接触区的分子构象。 关键词： 疏水作用色谱； 芳香醇同系物； 生物大分子； 保留 文献标识码： 文章编号： （ ） 中图分类号： : ) ; ( < # " " " $ ( % # & ! " " # " ) $ " = ( # $ " =
动相组成影响的中性小分子同系物
芳香醇来研
究保留机理有可能成为新的研究途径。本文研究了 流动相组成对芳香醇和蛋白质保留行为的影响， 将 分子构象不变的小分子和生物大分子在不同盐流动 相中的 ! 值作比较， 证实了不同盐对生物大分子与 固定相接触区分子立体构象的影响不同。
于蛋白分子外露的疏水性氨基酸残基与固定相疏水 性表面的疏水作用力， 这种作用力随流动相组成以 及温度等条件的变化而变化。迄今为止， 有关蛋白 保留与流动相组成关系的研究报道较多， 已提出了
［ ］ ［ ］ ! & 疏溶剂化理论 、 优先水化作用机理 、 计量置换
" 实验部分
" # ! 仪器及色谱条件 （日本） ， 包 > F + , 5 G 3H 9 $ ) < 型高效液相色谱仪 括> 两 9 H $ ) < 系统控制器， > B ? $ ) < I 紫外检测仪， 台H 温度由超级恒温水浴控制在 & 9 $ ) < 泵， " J。 聚乙二醇型疏水作用色谱填料为本实验室合成， 以 高压匀浆法装成# 柱。 " "+ +K = 4 )+ +L 5 L " # " 试剂 苯甲醇为分析纯， 由武汉有机合成化工厂生产； 苯乙醇、 苯丙醇、 苯丁醇由 < 并用甲 . 5 C 6 F公司生产， 醇 水 （体积比为# ） 溶液配成;N ／ $ M # H 溶液。细胞色 素 （9 ） 、 肌红蛋白 （@ ） 、 核糖核酸酶 （A $ 9 O $ 9 P Q , E 1 $ / / 、 牛血清白蛋白 （R 、 乳球蛋白 （ ） 、 卵 <） > <） $ $ H , 6 O ! ! 清蛋白 （: ） 、 糜蛋白酶原 （ ） 、 淀粉酶 < " $ " $ 9 F $ < " $ / （ ） 、 伴清蛋白 （9 ） 和溶菌酶 （H ） 均购自 " $ < + P 2 E / / 并用水配成 ;N ／ > + ,公司， H 溶液。其他试剂均 N 为分析纯。 " # $ 实验方法 在所有实验中， 流动相由 < 液和 R 液混合而 成。< 液分别为& ／ （Q 4 "+ P . H 7 > : = 4 " =） ! = 水溶液、 ／ ／ 水溶液、 + P . HQ , 9 .水溶液、 ; 4 "+ P . HQ 7 < 6 " 4 & =
收稿日期： ! " " # $ " % $ & " 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （ ） & ’ ( " " " &
） ， 男， 山西大同雁北师范学院访问学者。 作者简介： 赵建国 （ # ’ % # $ 通讯联系人： 卫引茂 （ ） ， 男， 博士， 副教授， ： 。 # ’ ) ( $ * $ + , . + 0 1 !2 0 3 4 1 5 3 4 6 2 /
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的 ! 值。B 1 C D 2 E
［ ］ % 等 首次用实验测定了释放出的
分子数， 进一步证实了该理论。对于给定的蛋白， 流 动相组成不同， 蛋白分子与固定相的水合程度不同， 则释放出的水分子数量不同。另一方面， 蛋白分子 被固定相吸附时， 蛋白分子因受疏水作用力的影响， 与固定相接触区域的分子构象会发生微变化并会影 响释放出的水分子数， 因而在 7 8 9 中以蛋白质为溶 质测定出的 ! 值应包括溶质和固定相的疏水作用 以及因蛋白质分子构象上的改变而引起的水合程度 改变这两部分的贡献， 但后者的贡献在色谱中未得 到证实。若采用结构简单、 分子构象不受温度和流
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色
谱
第9 Q卷
／ 水溶液， ／ ! " # $% & ( ) + 液为 , , .! " # $/ 0 1 ) ’ * ’ * 水溶液， 液和 液的 值均为 。以下分别相 0 2 + 4 , 3 ） 流动相、 流动相、 应简称为 （% 0 ( ) % & 5 # % 0 2 6 *’ * * 流动相和 % 流动相。溶质在不同流动相组成 & ( ) ’ * 中的容量因子的测定均采用等浓度洗脱。每次进样 前色 谱 柱 均 用 流 动 相 平 衡 ’ ，流 速 为 9 ,! 7 8 ／ 。 芳香醇同系物和蛋白质的检测波长分别为 ! $ ! 7 8 测定色谱柱的死体 ’ . *8 ! 和’ : ,8 !。用 % & % ) ’ 积。容量因子和流动相中水浓度的计算与文献 ［ ］ ; 相同。
由表9看出， 蛋白质的 $ 值比芳香醇的$ 值大 得多， 那么， 由式 （ ） 可知， 在容量因子变化相同的条 D 件下， 洗脱蛋白时流动相中水浓度对数的变化范围 就远小于洗脱芳香醇时水浓度对数的变化范围， 也 就是说， 在疏水色谱中蛋白在流动相中的洗脱范围 远小于芳香醇小分子。 ! " ’ 不同流动相的洗脱能力 许多研究根据疏溶剂化理论， 用蛋白质作溶质， 说明了盐的洗脱能力与溶液的表面张力有反比关
线性关系良好， 相关系数均大于 , ， 表明生物大 Q Q 分子和芳香醇小分子在 0 < 5 中的保留都遵从 ( >? @ 以# ［0 A 保留模型。从图 9 还可看出， "对 # )］ =! = ’ 作图， 小分子直线斜率的绝对值远小于蛋白质直线 斜率的绝对值。芳香醇同系物和蛋白质在流动相 ，& （% ） 中的保 % & ( ) 5 #和 % 0 2 6中与在 0 ( ) ’ * % * *’ * 留行为类似。表9列出了各种溶质在*种流动相中 测定溶质的 ! 的 $ 值。在等浓度洗脱条件下， "值范 围通常为9 ， 若以! 则： ! 9 , "B 9为基准， ［0 （ ） # 9B# # % $ # )］ ’ = = = ’ ! R 9 B 式 （9） 和式 （’） 相 减 可 得： ［0 # ! R B$ # )］ = = ’ ! R B 9C ［0 ， 由于 ［0 为常数， 则： $ # )］ )］ = ’ ’ ! R B 9 ［0 ／ # # )］ " $ B# = =! ’
表# % > ? 中溶质在不同盐溶液中的 # 值 . 2 = * 0 # @ 2 * ; 0 7 5 8#8 5 3 7 5 * ; 6 0 7 5 1% > ?: 5 * ; < 1 A 6 /B 8 8 0 3 0 1 6 7 2 * 6 7 5 * ; 6 5 1 7 2 6 ! CD ( " # N L H + H 8 I # & # 6 " K " # J 1 K H 8 H L K # & # 6 " K " # J D @ 1 K H 8 # @ 9 @ M " & 8 " # J 3 3 * @ 1 K H 8 # @ 9 @ G N L & 8 " # J $ O " I ! H J J ) P & # G N ! 7 8 ( ) 0 ( ) 2 6 % & 0 & 5 # % ’ * （% *） ’ * % * . : F 9 ; ’ F 9 4 ’ F ; : . F 4 9 9 , F 9 C ’ ; D F Q D ; Q F , 9 9 F ; 9 ’ F 4 9 . F : 9 : F * 4 Q F Q 9 9 : F D 9 , * F 4 9 9 : F D : F * Q F . 9 9 F ’ 9 ’ F 4 . , F 9 . , F 9 : Q F * ; * F : ’ F 4 D F D * F . * F Q C C C C
［ ］ : 生物大分子分子构象变化的表征参数 。
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图9 是 D , E 时 * 种芳香醇同系物和 : 种蛋白 质在 （% ） 流动相中的# ［0 所作 0 ( ) "对# )］ =! = *’ * ’ 的图。