BCIP NBT碱性磷酸酶显色试剂盒
碱性磷酸酶检测试剂盒(PNP比色法)
碱性磷酸酶检测试剂盒(PNP 比色法)简介：碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase ，简称ALP 或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH 9.2~9.8。
Leagene 碱性磷酸酶检测试剂盒(PNP 比色法)(Alkaline Phosphatase Colorimetric Assay Kit)采用PNP 比色法，其检测原理是Para-nitrophenyl phosphate (pNPP)为一种常用的磷酸酶显色底物，可在碱性磷酸酶的作用下生成p -nitrophenol 。
在碱性条件下p -nitrophenol 转变成醌式结构，呈较深的黄色，通过分光光度比色法测定400～415nm处吸光度，据此通过比色分析就可以计算出碱性磷酸酶活性水平。
该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的碱性磷酸酯酶活性。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：操作步骤(仅供参考)：1、 配制检测工作液：① 配制显色工作液： 取出1支pNPP ，恢复至室温后溶解于2ml ALP Assay buffer ，混匀，冰上预冷备用。
新配制的显色工作液应在6h 内用完。
② 配制标准品工作液。
2、 准备样品：① 细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要需进行适当匀浆，低速离心取上清，-80℃冻存，用于碱性磷酸酯酶的检测。
② 血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，-80℃冻存，但为了消除样品本身颜色的干扰，需设置加了血浆或血清但不加底物的对照。
③ 高活性样品：如果样品中含有较高活性的碱性磷酸酶，可以使用原有的裂解液或PBS 等进行稀释，也可以采用ALP Assay buffer 稀释。
编号 名称TE0003 100T Storage试剂(A): ALP Assay buffer 15ml 4℃ 试剂(B): pNPP2支 -20℃ 避光 试剂(C): p -nitrophenol(10mM) 0.1ml -20℃ 避光 试剂(D): Stopping Solution 12mlRT 使用说明书1份3、加样：按照下表设置96孔板空白对照、标准品、待测样品，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。
预混型BCIP、NBT溶液
预混型BCIP/NBT溶液Premixed BCIP/NBT Solution华越洋----------------------------------------------介绍：华越洋预混型BCIP/NBT溶液是在BCIP/NBT底物显色试剂盒的基础改良而得的。
特点：含有BCIP和NBT两种成分的混合液，不需混合和稀释，直接使用，十分方便。
在碱性磷酸酶存在时形成暗紫色沉淀，具有和其他AP底物（包括分开提供的BCIP/NBT溶液）一样的灵敏度。
稳定，使用精心优化的溶剂，在低温条件下可以保存一年。
可用于Western Blot。
运输及保存常温运输和保存（避光），有效期一年。
自备试剂Western印迹膜洗膜液或TBST缓冲液。
使用方法按常规方法进行Western印迹膜杂交，直到跟二抗-AP复合物保温这步结束。
用Western印迹膜洗膜液洗印迹膜5次，每次至少1分钟。
注意：可以用TBST缓冲液代替Western印迹膜洗膜液。
用水迅速冲洗一次。
将印迹膜转移到本产品中（每cm2印迹膜需要0.1mL 本产品），室温平缓摇晃5-30分钟显色。
37℃可加速反应。
细心观察蛋白条带的颜色变化，显色到满意程度后（一般需要20分钟，具体跟蛋白浓度密切相关）迅速将印迹膜转移到盛有超纯水的托盘中摇晃，终止显色反应。
数分钟后需要换水，共三次。
用吸水纸吸干膜上的水分，照相或扫描处理后避光干燥保存印迹膜。
BCIP/NBT反应原理BCIPNBTBCIP被碱性磷酸酶水解后形成一个中间体。
这个中间体被异构化以后的产物与NBT 反应生成白色的中间体二聚体和NBT-蓝紫色结晶物。
BCIP、NBT底物显色试剂盒使用说明
BCIP、NBT底物显色试剂盒使用说明货号：PR1100规格：25ml/125ml保存：-20℃避光保存，复检期至少半年。
产品内容：25ml125ml25×BCIP1ml5ml25×NBT1ml5ml1×AP反应缓冲液30ml75ml×2产品简介：NBT即氯化硝基四氮唑兰(Nitroblue tetrazolium chloride)，为深蓝色无定形微溶物质。
BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate),在碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,AP）的催化作用下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的沉淀。
使用说明：1.取40ul25×NBT加入到1ml1×AP反应缓冲液中，混匀后，再加入40ul25×BCIP混匀，即配成反应工作液，此反应液最好现配现用。
注意：根据膜的大小，1×AP反应缓冲液、25×BCIP、25×NBT的量可以等比例扩大。
2.把经洗涤的PVDF/NC膜浸入反应工作液中，于室温平缓摇动进行温育。
3.当蛋白带的颜色深度达到要求（一般约20-30分钟）时，把膜浸入去离子水中停止反应。
注意事项：BCIP、NBT为可疑致癌物，请采取必要的防范措施。
操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗。
相关试剂：A1800抗体稀释液（普通型）A1830AP标记抗体稀释液SA0012SABC(小鼠IgG)-AP kit。
碱性磷酸酶显色剂使用方法
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate (5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐), BCIP/NBT （四唑硝基蓝）是碱性磷酸酶底物, 产物为深蓝色, 在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP被水解, 水解产物与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。
使用方法1. 在膜或组织切片，最后一次洗涤完毕后，加入适量BCIP/NBT染色工作液2. 室温避光孵育5-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深度.3. 用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应4. 膜标本可干燥后避光保存；组织切片或细胞样品，显色反应终止后，可以用中性红复染染色干细胞成骨诱导的常用染色方法有几种碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。
成骨细胞染色方法以ALP为目标物的检测方法：1 Gomori钙钴法【染色原理】ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。
【孵育液配制】3%β-甘油磷酸钠5ml2%巴比妥钠5ml蒸馏水10ml2% CaCl2 10ml2% MgSO4 1ml【步骤】（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。
（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。
（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。
自来水冲洗数次。
（4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。
（5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。
【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。
2偶氮偶联法：【孵育液配制】萘酚AS-BI磷酸盐20mgDMSO 0.5ml0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2）50ml六偶氮副品红0.5ml1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。
新疆塔里木马鹿茸多肽对小鼠前成骨细胞的影响
新疆塔里木马鹿茸多肽对小鼠前成骨细胞的影响吕秀华;陈伟;周凡;刘斐;武嘉林【期刊名称】《中国中医药信息杂志》【年(卷),期】2015(000)002【摘要】目的：探讨新疆塔里木马鹿茸多肽对小鼠前成骨细胞(MC3T3-E1)的作用机制。
方法以BCA蛋白质定量试剂盒测定马鹿茸多肽样品的浓度；体外培养MC3T3-E1细胞，采用BCIP/NBT碱性磷酸酶(ALP)显色试剂盒染色；诱导分化形成矿化结节，进行茜素红染色；将MC3T3-E1细胞置于马鹿茸多肽高、中、低(10、1.0、0.1µg/mL)3个浓度的培养基中培养，采用MTT法和微量酶标法检测马鹿茸多肽不同浓度对MC3T3-E1细胞增殖和ALP合成的影响。
结果 BCA 蛋白质定量检测结果显示，马鹿茸多肽蛋白浓度为0.07 mg/mL。
体外培养 MC3T3-E1细胞ALP染色呈淡蓝色，阳性率为90%；矿化结染色呈红色。
与对照组比较，第3、7日马鹿茸多肽高、中、低剂量组可促进MC3T3-E1细胞增殖，且呈现剂量依赖效应；第3日马鹿茸多肽高、中、低剂量组均可促进MC3T3-E1细胞分泌ALP(P＜0.01)，且呈现一定的剂量效应。
结论塔里木马鹿茸多肽通过促进MC3T3-E1细胞增殖和ALP合成的分泌，达到治疗骨质疏松症的作用。
【总页数】4页(P47-50)【作者】吕秀华;陈伟;周凡;刘斐;武嘉林【作者单位】新疆医科大学中医学院，新疆乌鲁木齐 830054;新疆华世丹药物研究有限责任公司，新疆乌鲁木齐 830011;新疆华世丹药物研究有限责任公司，新疆乌鲁木齐 830011;新疆华世丹药物研究有限责任公司，新疆乌鲁木齐 830011;新疆华世丹药物研究有限责任公司，新疆乌鲁木齐 830011【正文语种】中文【中图分类】R285.5【相关文献】1.矮壮素对小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1骨骼发育相关基因及蛋白的影响及其机制 [J], 贾丽霞;张琪;侯晓红;孟庆贺;黄尧;周文娟;郝卫东2.小鼠前成骨细胞MC3T3-E1在自组装多肽水凝胶支架中的成骨分化 [J], 林娟;周庆翰;赵晓军3.梅花鹿茸多肽对小鼠成骨细胞MC3T3-E1生物学活性的影响 [J], 吕东辉;韩笑;苑广信;刘玲;安丽萍;杜培革4.HU-308与nHA/PCL电纺丝膜对小鼠前成骨细胞生物学性能的影响 [J], 乔鲁卉;张云涛;杨忠学;马子雨;侯玉东5.复合成骨蛋白-1多肽水凝胶缓释系统对小鼠成骨细胞碱性磷酸酶、骨钙素和核心结合因子α1表达的影响 [J], 胡飞琴;谢志坚;张锋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
“敏筛”说明书
Instruction manual (说明书)：AllergyScreen过敏原检测试剂盒1.用途AllergyScreen过敏原定量检测系统采用免疫印迹方法，定量检测人血清中过敏原特异性IgE抗体。
2.概述IgE免疫球蛋白发现始于1964年，它在I型变态反应发生机制中起重要作用。
免疫应答时B淋巴细胞分化成熟为浆细胞，并合成和分泌不同类型的抗体。
该过程由Th和Ts细胞调节，如果调节失控，通常不会造成损害的抗原也能激发免疫应答，刺激抗原特异性B细胞分化成熟为浆细胞，并产生IgE抗体, IgE抗体通过Fc段同嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面Fc受体结合。
当同一变应原再次进入机体，直接作用于IgE，并通过它的决定簇与IgE分子Fab段间的结合，形成IgE 受体聚集成片,这些变化最终导致嗜碱性粒细胞和肥大细胞脱颗粒释放组胺等生物活性物质，从而产生如麻疹`荨麻疹、皮炎、关节炎，枯草热（过敏性鼻炎）`哮喘及过敏性休克等典型的I型变态反应症状。
3.检测原理特异性过敏原被吸附于硝酸纤维素膜表面，置于反应槽中。
用移液器加入病人血清，室温下孵育，标本中过敏原特异性的IgE抗体与过敏原发生反应，并连接在硝酸纤维素膜上。
将多余的抗体冲洗脱掉，再加入标记了生物素的抗人IgE 抗体，室温下孵育，冲脱未结合上的抗抗体。
然后加入结合有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，室温下孵育，链霉亲和素和生物素结合。
将未结合上的酶标链霉亲和素冲洗干净。
当再加入BCIP/NBT酶作用底物并孵育后，碱性磷酸酶发生特定的酶显色反应，试剂条上出现沉淀。
颜色深浅与血清中sIgE抗体含量成正比。
待试剂条干燥后，CCD相机照相，读取检测结果。
4.检测系统组成每套检测系统包括：1×12 检测条：标记有20种过敏原的硝酸纤维素膜，置于塑料反应槽中（混合过敏原组，吸入组，食物组）1×洗脱液：（TRIS/NaCl，包含0.1%NaN3）可稀释成1x500ml 的清洗液，pH=7.5 （20ml）1×标记有生物素的抗人IgE抗体（白盖，多抗），含 0.1%NaN3 1×酶标链霉亲和素（红盖），连接有碱性磷酸酶的链霉亲和素1×底物（蓝盖），BCIP/NBT12×加样吸管（300微升）1×使用说明书5.未提供的实验所需的其他工具5.1稀释液蒸馏水或去离子水5.2 其他搅拌器；量筒（500毫升），500毫升洗瓶，具10个不同板型的洗板机（也可无），避光的孵育箱（具体要求见MEDIWISS说明书）；水平混匀器；电吹风（也可无）；专用阅读仪（RAPID READER）和电脑（Windows98，Windows2000 ME或Windows2000 PROF 带USB接口）及打印机。
碱性磷酸酶测定试剂盒(NPP底物-AMP缓冲液)产品技术要求dd
碱性磷酸酶测定试剂盒（NPP底物-AMP缓冲液）
组成：
适用范围：用于体外定量测定人血清中碱性磷酸酶的活性。
2.1外观
试剂盒外观应整洁，液体无渗漏，文字符号标识清晰；试剂1：无色澄清液体；试剂2：淡黄绿色澄清液体。
2.2装量
每瓶不少于标示值。
2.3试剂空白吸光度
用指定的空白样品测试试剂（盒），在光径1cm下，在A405nm处测定试剂空白吸光度A≤0.8，空白变化率△A/min≤0.005。
2.4分析灵敏度
试剂测定（120±12）U/L被测物，吸光度变化△A/min≥0.01。
2.5线性范围
2.5.1在[25，750]U/L内，相关系数R≥0.990。
2.5.2在 [25，100]U/L时绝对偏差不超过±10U/L，测定（100，750]U/L相对偏差不超过±10%。
2.6精密度
2.6.1 重复性
重复测试（120±12）U/L的样本，所得结果的变异系数（CV%）应不大于5%。
2.6.2批间差
测定（120±12）U/L样本，所得结果的批间相对极差（R）应不大于10%。
2.7准确度
比对试验相关系数r2≥0.95， [25，100]U/L区间内，绝对偏差不超过±10U/L，（100，750]U/L区间内，相对偏差不超过±10%。
2.8 效期稳定性
试剂有效期为12个月，取到效期后一个月内进行检测，测定结果应符合2.3-2.6.1、2.7项要求。
发光底物
辣根过氧化物酶底物化学发光底物（Western Blotting）用于辣根过氧化物酶在Western Blotting 过程SI-CPS160 KIT 2846 中的化学发光检测。
SI-CPS1120 KIT 5340SI-CPS1300 KIT 11874化学发光底物（ELISA）用于辣根过氧化物酶在ELISA 过程中的化学SI-CPS260 KIT 2760 发光检测。
SI-CPS2120 KIT 5139SI-CPS2300 KIT 11428AEC 底物试剂盒（免疫组化）该产品利用3-氨基-9-乙基-咔唑（AEC ）作为辣根过氧化物酶在免疫组化过程中的底物，在反应位SI-AEC101 KIT 895 点产生红色沉淀。
该试剂盒含缓冲液、色原质和双氧水。
AEC 可用于手动或自动免疫组化系统，可以用苏木精复染。
该产品染色后不能使用有机封片剂，需要水相的封片剂如Crystal/MountTM（B-M02，B-M03 ）。
每个试剂盒可使用至少1000 次。
AEC 片每片含20mg 底物。
5 片195 SI-A6926 50 片1090 100 片1696加强型DAB 试剂盒每片DAB 可以配制5ml 的工作液。
浓缩缓冲液中含有镍离子，强化了DAB 的显色。
DAB 沉淀是黑BI-S14 20 片1495 褐色的，可以用苏木精、甲基绿等复染。
DAB 试剂盒（膜）该试剂盒可以配制500ml 的工作液，用于膜的免SI-D6815 1KIT 2394 疫染色。
DAB 试剂盒（免疫组化）该试剂盒可以配制100ml 的工作液，用于免疫组化。
SI-D3939 1KIT 1208该产品用于辣根过氧化物酶在免疫组化、免疫细产品号规格胞化学和原位杂交过程中的显色。
每片可以配制BI-S16 100 片5-10ml 的工作液。
可以用有机或者水相的封片剂封片。
DAB 底物液（ELISA ，低动力学形式）该产品是一种即用型的溶液，用于ELISA 显色。
原位杂交实验操作步骤
原位杂交实验操作步骤撰写人：范为民一、实验原理原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。
现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。
二、试剂盒本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。
过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。
两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。
用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。
DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。
下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。
三、实验步骤原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。
（一）组织冰冻切片1. 实验准备（1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。
一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。
这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。
（2）缓冲液配备1.1器具准备剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。
以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。
铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。
地高辛标记及检测试剂盒说明书
仅仅研究于生命科学，不适合在诊断过程使用只能在体外使用地高辛DNA标记和检测试剂盒1和NBT/BCIP一起用于颜色检测通过酶联免疫法采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记和检测货号：11 745 832 910此试剂盒储存条件-15o C—-25o C此试剂盒可对10ng-3ugDNA进行12次标记反应可检测100cm2面积的杂交膜24张指导手册2009.11版1前言1.1内容表1前言 (2)1.1内容表 (2)1.2试剂盒内容 (3)2简介 (5)2.1产品概述 (5)3步骤和所需材料 (8)3.1开始之前 (8)3.2地高辛DNA标记 (9)3.3 标记效率的测定 (11)3.4 DNA 的转移和固定 (14)3.5杂交 (16)3.6免疫检测 (18)3.7 DNA印记的洗脱和再杂交 (20)4结果 (21)4.1典型的结果 (21)5附录 (23)5.1故障排除 (23)5.2引用 (24)5.3订购信息 (25)1.2 试剂盒内容附加仪器与所需试剂除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。
在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。
*标记的产品可以从Roche Applied Science 获得2 介绍2.1 产品概况实验原则此试剂盒采用地高辛（DIG），一种甾类半抗原，去标记DNA探针从而通过酶免疫分析应用地高辛标记DNA探针可以用于：所有类型的滤膜杂交总基因组DNA中单拷贝基因的检测，甚至对于高度复杂的生物也可以进行检测，如人，大麦和小麦。
样品材料至少100bp的DNA片段线性的质粒，cos质粒或者λDNA超螺旋的DNA实验时间此表格列出了每一步实验所需的反应时间检测数量一个试剂盒足够用于：不超过3ug的模板DNA的12个标准的标记反应和100cm2有24个斑点的检测质量控制根据操作步骤中的描述，对未标记的对照品DNA（PBR328）进行标记，0.1pg同源DNA 在点杂交中通过16h的显色来检测（1pg同源DNA可以通过1小时的显色进行检测）。
BCIP_NBT比色法测定碱性磷酸酶活力_陈国千
二、 反应时间与产物量的关系 取经生理盐水 稀释为 2. 0 U / L和 4. 0 U / L的两份血清标本 ,按附 表操作 ,反应时间分别为 0. 5、 1、 1. 5、 2、 3、 4 h,结果 见图 2。 在 3 h 内 ,吸光度与反应时间基本成正比。
三、 显色稳定性 取 4份不同 ALP 活力的血 清标本 ,反应 2 h 加终止液后 ,放置 0、 1、 2 h 比色 , 吸光度基本不变。
上海医学检验杂志 1999年第 14卷第 2期
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尿脂肪管型检测对肾病诊断的意义
沈忠新 孙作鹏 (中国医科大学附属第一医院检验科 沈阳 110001)
本 文 用自 行 配 制的 甲 苯 胺 蓝、 副品 红 复 合染 液 (以下简称甲、副染液 )制备尿沉渣涂片 ,用普通光镜 观察肾病患者尿脂肪管型 ,探讨尿脂肪管型检测对 肾病诊断的意义。
四、 精密度试验 两份血清标本用生理盐水稀 释后 AL P活力分别为 5. 0 U / L 和 1. 0 U / L,然后 分别作批内、批间各 10次重复性试验 , 5. 0 U / L标 本 CV 值批内 1. 07% ,批间 4. 13% , 1. 0 U /L 标本 CV 值批内 1. 59% ,批间 4. 38% 。
A colo rim etric method fo r measuring alkaline pho sphata se ( AL P) activity with BCIP a nd N BT as substrates w as established. The low limit o f detection is 0. 2 U / L ( Bessy -Low r y method) . The within run CV s o f two lev els of A L P ac tiv ity ( 5. 0、 1. 0 U /L ) ar e 1. 07% a nd 1. 59% , betw een run CV s 4. 13% a nd 4. 38% , respectiv ely. The cor relation coefficient betw ee n this method and Bessy -Lo wr y me tho d ( kinetic ) is 0. 992. The results show ed that this metho d w as simple , reliable and sensitiv e.
免疫组化 讲座2012
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生物素
4
显色反应
显色反应
显色
复染
封片
显色
HRP显色
DAB显色试剂盒
二氨基联苯胺(DAB)是过氧化酶的生色底物，在过氧化物酶催化下，
形成棕黄色的沉淀。
AEC显色试剂盒
形成红色沉淀，红色产物不溶于水，但溶于有机溶剂。
内源酶封闭
内源性过氧化物酶封闭液
内源性碱性磷酸酶封闭液
作用：
灭活生物体内自身的内源酶（过氧化物酶、碱性磷酸酶） 降低非特异性染色
封 闭
去除非特异结合位点：
Blocking Buffer ：二抗免疫前血清、 3%BSA、5% Milk
封闭用山羊血清工作液
作用：
作用：
掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露 抗原性得到一定程度的恢复 提高免疫组化染色的阳性率
抗原修复
热修复：
高压热修复 微波热修复 沸水浴热修复
柠檬酸缓冲液 PH6.0
EDTA缓冲液 PH8.0
参照一抗说明书，或比较不同修复液效果。
样本制备 仪器
2
预处理
预处理
抗原修复
内源酶封闭
非特异性位点封闭
抗原修复
原理：
甲醛的聚合作用，造成细胞内的蛋白质分子键相互交联
固定液的作用，使氨基酸残基在分子内或分子间形成醛键
细胞内抗原决定簇被掩盖，抗原不能与抗体充分反应
间接法
将荧光、酶等标记在二抗上
Secondary Antibody
地高辛标记与检测DNA试剂盒说明书
地高辛标记与检测D N A试剂盒DIGDNALabelingandDetectionKit采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用NBT/BCIP酶联免疫，随时即用。
此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行25次标记反应，可检测10×10cm2面积的杂交膜50张指导手册1前言1.1内容表1前言1.1内容表1.2试剂盒成分2.介绍2.1产品简介3.操作步骤和所需材料3.1在你开始前3.2流程图3.3地高辛标记DNA3.4标记效率的确定3.5DNA的转移和固定3.6杂交3.7免疫检测3.8DNA印记的洗脱和再杂交1.2试剂盒的成分瓶号标记内容包括功能1 无标记对照DNA12 无标记对照DNA23 DNA稀释缓冲液2管1mL50μg/mL鱼精DNA,10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0在25℃澄清溶液4 DIG标记的对照DNA20μL5μg/mL质粒pBR328DNA（用BamHI线性化）澄清溶液用于确定标记效率5 六聚核苷酸混合物6 标记用混合物7 DNA聚合酶1大片段标记级8 抗地高辛的碱性磷酸酶结合物200μL750U/mL从羊中获取的，Fab段，结合碱性磷酸酶澄清溶液9 NBT/BCIP10 封阻试剂附加仪器与所需试剂除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。
在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。
在每个操作程序的前面提供了详细的信息。
操作程序仪器设备试剂3.3DIG-DNA标记水浴灭菌的双蒸水0.2MpH8.0灭菌的EDTA3.4标记效率的半定量带正电荷的尼龙膜* 地高辛洗涤和封阻缓冲组合*TE缓冲液或者洗涤缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液3.5DNA转移和固定紫外光盒或者商业化可用于紫外交联的其他设备2×SSC或者10×SSC3.6杂交尼龙膜，带正电荷*杂交袋*，或者耐热的塑料袋或者滚筒瓶（分子杂交炉）注意：当用地高辛杂交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。
碱性磷酸酶标记的链霉亲和素-生物素法(SAP法).
1、石蜡切片脱蜡至水，PBS洗3×3min； 2、3%H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化 物酶的活性；蒸馏水洗，PBS浸泡5min； 3、滴加适当比例稀释的胰岛素一抗工作液， 37℃ 孵育1hr； 4、 PBS冲洗，3×3min； 5、 滴加HRP标记羊抗小鼠Ig多聚体，37℃或室温孵 育20～30min； 6、 PBS冲洗，3×3min； 7、显色剂显色（AEC或DAB）； 8、自来水充分冲洗，封片。
实验原理
ABC法
SAP法
实验方法或步骤
1、石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗，PBS浸泡2min；(如需采用 抗原修复，可在此步后进行)。
2、10％正常羊血清封闭，室温孵育10min；
3、倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的胰岛素一抗或一抗工 作液，37℃孵育45min。 PBS冲洗，3×3min；
多聚鳌合物酶法
HRP---多聚化合物---抗体 一、Epos法
Enhanced polymer one-step staining
组织抗原 一抗
HRP
多聚化合物骨架
EPOS 方法
原理：采用一种具有惰性的多聚
化合物作为骨架，将特异
性抗体和HRP，同时标记 在多聚合物分子上，形成
HRP---多聚化合物---特异
碱性磷酸酶标记的链霉亲和 素－生物素法（SAP法）
免疫组织化学实验二
实验材料
Hale Waihona Puke 1、小鼠胰腺的石蜡切片； 2、胰岛素抗体（鼠抗人单克隆抗体）； 3、SAP检测试剂盒； 4、正常羊血清； 5、 0.01M PBS（pH7.2～7.6） ； 6、BCIP/NBT显色试剂； 7、孵育湿盒。
(中文) DIG High Prime DNA标记及杂交检测试剂盒 I
DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I DIG High Prime DNA标记及杂交检测试剂盒I说明书版本：Version11 （2010年8月）利用随机引物法及DIG-dUTP（碱不稳定）进行DNA标记反应，采用酶联免疫方法及发色底物NBT/BCIP进行杂交分子的显色。
本试剂盒可对10ng-3μg DNA进行12次标记反应，可进行24次杂交检测反应（100cm2杂交膜）。
产品目录号：11 745 832 910试剂盒于-15 ~ -25℃保存1. 概况1.1 说明书内容1. 概况 (2)1.1说明书内容 (2)1.2试剂盒组成 (3)2. 介绍 (4)2.1 产品概述 (4)3. 实验步骤和需要的材料 (7)3.1 实验开始前准备 (7)3.2 DIG-DNA标记 (7)3.3定量标记反应效率 (10)3.4 DNA转膜和固定 (12)3.5杂交 (13)3.6 免疫检测 (14)3.7探针洗脱和重探 (16)4. 结果 (17)4.1 典型结果 (17)5 附录 (18)5.1 疑难问题解决 (18)5.2参考文献 (18)1.2 试剂盒组成杂交反应所需的仪器和其他反应试剂请根据您的实验操作流程准备杂交反应所需的仪器和其他试剂，参见下表：带*的试剂为罗氏应用科学部提供的试剂。
2. 介绍2.1 产品概述反应原理DIG High Prime DNA标记检测试剂盒（I）采用地高辛（DIG，一种甾类半抗原）进行DNA 标记，所获得的探针用于后续的杂交反应，带有地高辛分子的杂交子通过酶联免疫反应进行显色检测。
应用DIG标记的DNA探针可用于：•所有形式的膜杂交反应•（微生物，人类，植物等）基因组DNA中的单拷贝基因检测样本•大小在100bp以上的DNA片段•线性化质粒，粘粒或λDNA•超螺旋DNA分析时间试剂盒反应次数本试剂盒包含•对10ng-3μg DNA进行12次标记反应• 24次杂交检测反应（100cm2杂交膜）质量控制对DNA对照品（pBR328，未标记）进行标准标记反应，将0.1pg同源DNA点膜后进行斑点杂交，显色16h呈阳性检测结果（1pg同源DNA的杂交反应显色1h后呈阳性检测结果）。
碱性磷酸酶标记抗体说明书
北京索莱宝科技有限公司碱性磷酸酶标记抗体说明书（AP antibody conjugate）
规格：0.1ml
保存：-20℃保存，避免反复冻融，保质期至少为1年；稀释后2～8℃可保存2周。
产品说明：
碱性磷酸酶标记抗体具有发光信号平台期长、背景值低、底物长期稳定的特点，是常用的化学发光分析法之一。
本公司制备的AP标记抗体，可用于多种免疫学实验，如：ELISA﹑WB﹑IHC等。
本品每0.1ml液体中含有AP200g，IgG含量约100g。
抗体浓度：1mg/ml
储存液：0.01M PBS(pH7.4)﹑1%BSA﹑0.03%Proclin300和50%Glycerol.
工作效价：
ELISA：1：2000-10000
WB：1：1000-10000
IHC：1：100-1000
具体效价以产品标签为准，最佳使用浓度需根据所检测样本的抗原及一抗效价优化而定。
显色说明：用BCIP/NBT作为底物进行显色，最终形成不溶性的深蓝色至蓝紫色沉淀。
第1页，共1页。
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仅供科研使用版本号：180718
BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒
【产品组成】
【保存条件】
4℃,避光,12个月。
【产品概述】
BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit)是一种用于免疫组化显色、Western等膜显色和诱导多功能干细胞iPS鉴定等的试剂盒。
BCIP/NBT是碱性磷酸酯酶的常用底物，在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit可用于细胞或组织的碱性磷酸酯酶显色包括诱导多功能干细胞iPS的鉴定，也可用于Western等结合有碱性磷酸酯酶的膜的显色检测\细胞或组织内源性的碱性磷酸酯酶显色。
【使用方法】
1、对于组织切片或细胞样品或膜，在与碱性磷酸酯酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗
涤液洗涤3～5次，每次3～5min。
2、对于检测内源性碱性磷酸酯酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也用适当洗涤液洗涤3～5次，每
次3～5min。
3、按照如下比例依次加入各溶液，混匀后即配制成BCIP/NBT染色工作液：
4、洗涤完毕后，去除洗涤液。
5、加入适量BCIP/NBT染色工作液，确保能充分覆盖样品。
5、室温避光孵育5～30min或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅。
6、去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸馏水洗涤1～2次即可终止显色反应。
7、对于组织切片或细胞样品，显色反应终止后，如有必要可以用中性红染色液(neutral red staining
solution)染色，以便于观察。
对于膜，显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。
【注意事项】
1、BCIP对人体有刺激性，NBT对人体有害，请注意适当防护。
2、操作过程中，尽量避免强光照射。
3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。