几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
抗体标记方式
抗体标记方式引言：抗体标记是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的方法，通过将抗体与特定的标记物结合，可以实现对目标分子的高度敏感和特异性检测。
本文将介绍几种常见的抗体标记方式，包括荧光标记、酶标记、放射性标记以及磁性标记。
一、荧光标记荧光标记是一种常见的抗体标记方法，通过将荧光染料与抗体结合，可以实现对目标分子的可视化检测。
荧光标记具有高灵敏度、高特异性、实时监测等优点，常用于免疫组织化学、流式细胞术等研究领域。
常见的荧光染料有荧光素、荧光素同工异构体、荧光素同系异构体等。
二、酶标记酶标记是一种常用的抗体标记方式，通过将酶与抗体结合，可以实现对目标分子的间接检测。
酶标记的原理是将酶与底物反应产生可检测的产物，常见的酶标记有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。
酶标记具有灵敏度高、信号稳定、操作简便等特点，广泛应用于酶联免疫吸附试验（ELISA）等实验中。
三、放射性标记放射性标记是一种非常敏感的抗体标记方式，通过将放射性同位素与抗体结合，可以实现对目标分子的定量检测。
放射性标记常用的同位素有^125I、^32P等，其辐射可被探测器捕获，从而实现对目标分子的高灵敏度检测。
放射性标记在免疫组织化学、放射免疫分析等领域得到广泛应用。
四、磁性标记磁性标记是一种新兴的抗体标记方式，通过将磁性颗粒与抗体结合，可以实现对目标分子的快速分离和检测。
磁性标记具有操作简便、快速高效、可重复使用等优点，常用于磁性分离、磁共振成像等研究领域。
磁性标记颗粒的大小和形状可以根据需要进行调节，常用的磁性标记颗粒有超顺磁性颗粒、亚顺磁性颗粒等。
结论：抗体标记是一种重要的生物学工具，不同的标记方式具有各自的特点和应用范围。
荧光标记适用于可视化检测，酶标记适用于间接检测，放射性标记适用于高灵敏度定量检测，磁性标记适用于快速分离和检测。
在实际应用中，选择合适的抗体标记方式非常重要，可以根据研究需求和实验条件综合考虑。
未来，随着技术的不断发展和创新，抗体标记方式将更加多样化和精准化，为生物医学研究和临床诊断提供更多可能。
生物素标记方法
生物素标记方法
生物素标记方法是研究分子生物学、生物医学以及基因工程领域中常用的一种技术手段。
生物素是一种小分子，能够稳定结合在蛋白质、DNA、RNA等生物分子上，然后通过化学反应将其标记，从而实现对这些生物分子的检测、分离、纯化等目的。
下面，我将介绍几种常用的生物素标记方法。
1. 化学合成法
该方法是指直接将生物素与目标分子进行化学反应合成标记物。
一般情况下，将生物素与分子中含有取代基或官能团的氨基酸、碳水化合物、核苷酸等分子反应，形成生物素标记分子。
这种方法操作简单，标记分子的稳定性相对较高，但也存在反应产物多样性和纯化难度较大的问题。
2. 酶标法
生物素酶标方法是通过先将目标分子与无生物素酶的生物素结合蛋白偶联，然后加入酶标记化学底物，使之被生物素结合蛋白吸附，生成酶标记。
该方法不需要化学反应，有色或荧光信号明显，而且有较高的检测灵敏度和特异性，可以用于定量检测和高通量筛选。
3. 亲和柱纯化法
该方法是利用生物素亲和柱的特异性吸附作用，对生物素标记蛋白、DNA等生物大分子进行纯化，从而获得高质量的样品。
最常用的是streptavidin疏水亲和纯化柱和avidin疏水亲和纯化柱。
这种方法操作简单，纯化效果好，但标记分子的稳定性较低，可能存在对目标蛋白活性影响等问题。
以上是生物素标记方法的三种常用技术手段，可以根据不同的研究需求选择合适的方法使用。
生物素标记技术的广泛应用不仅有助于分子生物学和生物医学的研究发展，也为新药发现和治疗提供了重要的帮助。
第六节免疫标记技术
第十一章血清学试验第六节免疫标记技术免疫标记技术是利用抗原抗体反应的特异性和标记分子极易检测的高度敏感性相结合形成的试验技术。
免疫标记技术主要有荧光抗体标记技术、酶标抗体技术和同位素标记抗体技术。
它们的敏感性和特异性大大超过常规血清学方法，现已广泛用于传染病的诊断、病原微生物的鉴定、分子生物学中基因表达产物分析等领域。
其中酶标抗体技术最为简便，应用较广。
这里主要介绍荧光抗体标记技术和酶标抗体技术。
一、荧光抗体标记技术荧光抗体标记技术（fluorescent-labelled antibody technicque ）是用荧光色素标记在抗体或抗原上，与相应的抗原或抗体特异性结合，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。
（一）原理荧光素在10-6的超低浓度时，仍可被专门的短波光源激发，在荧光显微镜下可观察到荧光。
荧光抗体标记技术就是将抗原抗体反应的特异性、荧光检测的高敏性、以及显微镜技术的精确性三者结合的一种免疫检测技术。
（二）荧光色素荧光色素是能产生明显荧光，又能作为染料使用的有机化合物。
主要是以苯环为基础的芳香族化合物和一些杂环化合物。
它们受到激发光（如紫外光）照射后，可发射荧光。
可用于标记的荧光色素有异硫氰酸荧光黄（FITC）、四乙基罗丹明（RB 200）和四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC。
其中FITC M用最广，为黄色结晶，最大吸收光波长为490〜495nm,最大发射光波长520〜530nm可呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC 分子中含有异硫氰基，在碱性（pH9.0〜9.5）条件下能与IgG分子的自由氨基结合，形成FITC-IgG结合物，从而制成荧光抗体。
抗体经荧光色素标记后，不影响与抗原的结合能力和特异性。
当荧光抗体与相应的抗原结合时，就形成了带有荧光性的抗原抗体复合物，从而可在荧光显微镜下检出抗原的存在。
（三）荧光抗体染色及荧光显微镜检查1．标本片的制备标本制作的要求首先是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保持不变。
免疫血清学技术
直接凝集试验： 玻片法：鸡白痢玻片凝集 试管法：布氏杆菌试管凝集 间接凝集试验：
间接血凝试验：猪瘟间接血凝试验
乳胶凝集试验：猪伪狂犬病乳胶凝集试验 协同凝集试验：
SPA +
Ab
SPA-Ab +
Ag
SPA-Ab-Ag
2. 沉淀试验：
可溶性抗原（毒素、病毒、细菌裂解液）与相应抗体结合, 在电解质 存 在情况下，产生可见的沉淀物。
补体结合反应的基本原理
Ag + Ab
Ag Ab +
C
Ag Ab C
Ag?
Ab
Ag+ Ab
C C
E E H
+ 不溶血
H
Ag-
Ab
Ag-
Ab 溶血
C
C
E H
E
H
五、
中和试验
抗原和相应抗血清按适当比例混合作用后可被中和而失去
毒力，接种实验动物、组织细胞、鸡胚而不出现致病作用。
1. 终点法中和试验（End-point neutralizing test）:
Reed 法Muench 计算半数致死量（LD50）。
2. 空班减少试验 ( Plague reduction test)：
应用空斑技术使空斑数减少50%的血清量作为中和滴度。
将已知空斑单位（PFU）的病毒稀释成每一接种剂量含 100 PFU，加等量递进稀释的血清，37 ℃ 1h 。接种细胞后， 覆盖琼脂，培养数天后，计算空斑数，计算血清的中和滴度。
（3）免疫电泳技术 琼脂双扩散与电泳技术结合而成。
包括：免疫电泳
对流免疫电泳 火箭电泳
+
Ag Ab
Ag
Ab
几种常用的抗体检测方法
几种常用的抗体检测方法常用的抗体检测方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光法、免疫组化法、免疫印迹法（Western blotting）、流式细胞术等。
下面将对这些方法进行详细介绍。
1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：ELISA是一种常用的抗体检测方法。
它利用酶标记二抗与被测物中特异性抗体结合，通过酶的底物反应来检测被测抗体的存在。
ELISA有直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、夹心ELISA等多种变种。
这些变种根据目标抗体、需求灵敏度、特异性等因素选择适当的方法。
2.免疫荧光法：免疫荧光法利用荧光染料标记的抗体与特定抗原结合，利用荧光显微镜观察样本中的荧光信号。
它分为直接免疫荧光法和间接免疫荧光法。
直接免疫荧光法直接将荧光素标记于抗体上，观察样本中的荧光信号。
间接免疫荧光法则是先用一抗结合目标抗原，再用荧光素标记的二抗来检测一抗的位置。
3.免疫组化法：免疫组化法是一种用于检测细胞或组织样本中特定抗原的方法。
它利用抗原与抗体的特异性结合来检测目标蛋白的分布。
在免疫组化中，一般使用免疫荧光或酶标记的二抗来观察抗原的位置。
通过对显微镜观察或图像分析，可以得出目标蛋白的表达情况。
4. 免疫印迹法（Western blotting）：免疫印迹法是一种用于检测特定蛋白质的方法。
通过将细胞或组织溶解后的蛋白质样品进行SDS-电泳分离，然后将分离的蛋白转移到膜上，并使用特异性抗体与目标蛋白结合，再用酶标记的二抗或放射性同位素进行信号检测。
通过观察带有目标蛋白的免疫印迹图谱，可以确定特定蛋白的存在及其表达量。
5.流式细胞术：流式细胞术是一种可以通过检测细胞表面或细胞内特定抗原的方法。
它结合了免疫磁珠的标记和激光生物学。
通过将样本中的细胞和抗体共孵育，利用流式细胞仪来检测细胞检测物的存在以及细胞表型特征。
流式细胞术可以用于单细胞检测、免疫细胞表型分析、测定细胞凋亡等方面。
总结起来，常用的抗体检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光法、免疫组化法、免疫印迹法（Western blotting）、流式细胞术等。
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
、酶标记1 、辣根过氧化物酶(HRP) 标记辣根过氧化物酶(HRP) 标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP 的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG 氨基结合，形成Schiff 氏碱。
为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff 氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP 溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3 溶液中加0.5ml 10mmol/LNaIO4 溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2 小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3 混匀。
(3)加入0.75ml 小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml) ，混匀。
(4)称取SephadexG25 干粉0.3g ，加入一支下口垫玻璃棉的5ml 注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4C过夜。
(5)用少许PBS 将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V 体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4 溶液，混匀，室温作用30 分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4C过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200 或Sepharose6B(2.6 X 50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403 X 0.4IgG 量(mg/ml)=(OD280- OD403X 0.3) X 0.62克分子比值(E/P)=酶量X 4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量X体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP 分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280 等于0.4 时，E/P 约为1 。
兽医生物制品是根据免疫学原理
兽医生物制品是根据免疫学原理，利用微生物、寄生虫及组分或免疫应答治疗的生物制剂。
凡是由病原微生物，寄生虫以及其组分或代谢产物所制成的，用于人工自动免疫的一类生物制剂均称为疫苗。
包括常规疫苗与新型疫苗。
用所预防的病原体本身或其弱毒苗或无毒变种所制成的疫苗叫做同源疫苗。
利用具有类属保护性抗原的非同种微生物所制成的疫苗叫做异源疫苗。
类毒素：将有关细菌长生的外毒素，用适当的浓度的甲醛溶液使之脱毒而制成的生物制品称为类毒素。
诊断制品：诊断疾病、群体检验、免疫检测和病原鉴定的一类生物制品。
抗病血清：又称高免血清，为含有高效价特异性抗体的动物血清制剂，能用于治疗或紧急预防相应病原体所致的疾病。
抗毒素：用类毒素和毒素为抗原制备的血清称为抗毒素。
按照生物制品的性质可分为疫苗、诊断制品、抗病血清、微生态制剂和副免疫制品5大类。
免疫应答：是动物机体免疫系统识别各类异物，并将其杀死、降解和排除的过程。
负责体液免疫的是B淋巴细胞。
体液免疫的过程分为1.感应阶段、2.反应阶段和3.效应阶段。
常用的灭活剂:1.甲醛（其中36%~40%的水溶液俗称福尔马林，甲醛的灭活浓度不同，需氧菌一般为0.1%~0.2%，厌氧菌一般为0.4%~0.5,%，病毒灭活的浓度常为0.05%~0.4%，）烷化剂（浓度为0.05%）或0.02%结晶紫影响灭活效果的因素：微生物的种类及特性，灭火剂的种类及特性，灭火剂的浓度，温度，PH值，时间，有机物质。
冻干保护剂的组成：低分子物质，高分子物质，抗氧化剂。
影响冻干保护剂效能的因素:保护剂种类，保护剂组分浓度，保护剂配制方法，保护剂PH值. 佐剂：凡是可以增强抗原免疫应答的物质均称为佐剂。
佐剂选择的标准：佐剂物质应安全、无毒、无致癌性，也不应是辅助致癌物，不能诱导、促进肿瘤形成。
佐剂物质应有较高的纯度，有一定的吸附力，最好吸附性强佐剂物质应该具有在动物内降解吸收的性质，不宜长时间留存而诱发组织损伤佐剂物质不应诱发动物自身超敏性，不含有与动物有交叉反应的抗原物质佐剂应易于保存并且稳定，当与疫苗共同保存时不应发生变质，并且不出现可引起不良反应的物质。
常用的免疫标记技术
常用的免疫标记技术免疫标记技术是一种用于检测和分析生物分子的方法，其中利用特定的抗体或其他免疫物质标记目标分子，从而使这些分子能够被观察和测量。
以下是一些常用的免疫标记技术：1.免疫荧光技术（Immunofluorescence）：在这种技术中，用于检测目标分子的抗体被标记上荧光染料。
通过荧光显微镜观察样本，可以定位和定量目标分子的位置和数量。
2.免疫酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）：这是一种广泛用于检测抗体或抗原的技术。
ELISA 利用酶标记的抗体或抗原与目标分子结合，然后通过酶的底物反应来产生可测量的信号。
3.免疫印迹技术（Western Blot）：Western Blot用于检测蛋白质。
蛋白质被电泳分离，然后通过免疫印迹将其转移到膜上。
接着使用特定抗体标记的酶或荧光物质来检测目标蛋白质。
4.免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）：IHC用于在组织切片中检测特定抗原的存在。
切片上的抗原与标记有酶、荧光染料或其他标记的抗体结合，通过显微镜观察抗原的分布。
5.流式细胞仪技术（Flow Cytometry）：该技术通过激光照射细胞，测量细胞表面或内部的荧光标记物，以分析细胞的类型、状态和功能。
6.蛋白质质谱法（Mass Spectrometry）：将样品中的蛋白质离子化，并通过质谱仪测量质量。
免疫质谱结合了免疫标记和质谱技术，可用于检测和鉴定蛋白质。
7.免疫电镜技术（Immunoelectron Microscopy）：在电子显微镜下观察样本，通过标记的抗体来可视化细胞或亚细胞结构中的特定蛋白质。
8.免疫磁珠技术（Immunomagnetic Bead Assay）：使用带有磁珠的抗体，通过磁场将目标分子分离出来。
常用于细胞分离和分析。
这些免疫标记技术在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域发挥着关键作用，可以用于检测和定量各种生物分子，如蛋白质、抗体、核酸等。
抗体标记方法的比较原理
抗体标记方法的比较原理
抗体标记方法是实验室中常用的技术手段，用于检测和定位特定分子或细胞的存在和分布。
常见的抗体标记方法包括荧光标记、酶标记和放射性标记。
这些方法的比较原理如下：
1. 荧光标记：荧光标记方法利用被标记抗体结合目标分子后，在荧光显微镜下显示特定波长的光信号。
这种标记方法具有高灵敏度、高特异性和多色标记的优势，使其广泛应用于细胞和组织的免疫染色、流式细胞术和光学显微镜观察等。
然而，荧光标记方法对光照条件和荧光物质的稳定性有一定要求，且荧光信号容易受到组织自身荧光的干扰。
2. 酶标记：酶标记方法利用被标记抗体结合目标分子后，通过酶的催化作用来产生显色或荧光信号。
最常用的酶标记方法是辣根过氧化物酶（HRP）标记和碱性磷酸酶（AP）标记。
酶标记方法具有较高的灵敏度和稳定性，适用于免疫组化和免疫印迹等实验。
然而，酶标记对显色反应的条件要求严格，且显色或荧光信号不易于定量。
3. 放射性标记：放射性标记方法利用放射性同位素标记抗体，通过射线的衰变来检测目标分子。
放射性标记方法具有极高的灵敏度和定量性，适用于放射免疫测定等实验。
然而，放射性标记需要较复杂的实验操作和设备，同时存在一定的安全风险。
综上所述，选择适当的抗体标记方法应根据实验需求和目标分子的性质来决定，综合考虑灵敏度、特异性、稳定性、定量性和安全性等因素。
免疫标记技术
常用的酶及其底物 酶 辣根过 氧化物 酶 (HRP) 底物
邻苯二胺 (OPD) 四甲替联苯胺 (TMB) 5氨基水杨酸 (5AS) 邻联苯甲胺 (OT) 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 (ABTS )
显色反应 测定波长
橙红色 蓝绿色 棕色 蓝绿色
蓝绿色
492 450 449 425 642
酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可导致大 量的催化过程，所以极为敏感。它的催化过程 有两种基本形式： (1)E十S →(ES)→E十P (2)E十S →＝(ES) (ES)十D1 →E十P十D2 E为酶，S为酶作用的底物，P为底物分解 后的产物，D，为供氢体，D：为D1的氧化型。 如P或D：为有色化合物，即可用呈色反应显示 酶的存在。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2) 和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型 染料，通过反应可生成有色的氧化型染料 (D)。酶促反应的过程如下: HRP DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如 DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉 淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或 电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA， 但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色， 现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生 鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温 度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时 间内进行测定。
荧光是指一个分子或原子吸收了给 予的能量后，即刻引起发光；停 止能量供给，发光亦瞬即停止。 荧光素是一种能吸收激发光的光能 产生荧光，并能作为染料使用的 有机化合物。目前用于标记抗体 的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄 (FITC)、四乙基罗丹明及四甲基 异硫氰酸罗丹明。
药物标记方法
药物标记方法药物标记方法是现代医学领域一个重要的研究方向，它主要是为了提高药物的选择性、准确性和治疗效果，同时也可以帮助研究人员了解药物在体内的分布和代谢情况。
下面将介绍一些常用的药物标记方法。
1. 放射性同位素标记法放射性同位素标记法是一种常用的药物标记方法，它利用放射性同位素对药物进行标记，通过放射性衰变来进行检测。
常用的放射性同位素有碘-125、碘-131等。
这种标记方法可以提供高灵敏度的检测结果，并且具有较长的检测时间窗口。
但是，由于放射性同位素具有辐射风险，使用时需要注意安全问题。
2. 荧光标记法荧光标记法是一种常用的无创标记方法，它利用具有荧光特性的化合物对药物进行标记，并通过荧光显微镜、荧光成像等技术来进行检测。
荧光标记法具有灵敏度高、分辨率好、操作简便等优点。
同时，荧光标记还可以指示药物在细胞或组织中的定位和分布。
3. 酶标记法酶标记法是一种常用的药物标记方法，它利用酶对药物进行标记，并通过酶活性的变化来进行检测。
常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。
酶标记法具有灵敏度高、稳定性好、操作简便等优点。
这种方法适用于体内体外的检测，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、 Western blot等。
4. 核磁共振标记法核磁共振标记法是一种非侵入性的标记方法，它利用核磁共振技术对药物进行标记，并通过核磁共振成像来进行检测。
这种方法可以提供高分辨率的图像，可以观察到药物在体内的分布情况，并可以研究药物在体内的代谢动力学过程。
5. 金标记法金标记法是一种高灵敏度的药物标记方法，它利用金颗粒对药物进行标记，并通过电子显微镜、原子力显微镜等技术进行检测。
金标记法在生物医学研究中得到了广泛应用，特别是在肿瘤标记和抗体检测等方面发挥了重要作用。
总结起来，药物标记方法涵盖了放射性同位素标记法、荧光标记法、酶标记法、核磁共振标记法、金标记法等多种方法。
这些方法各有优劣，适用于不同的研究领域和应用场景。
免疫标记：四大免疫标记原理介绍
免疫标记：四大免疫标记原理介绍！为提高抗原和抗体检测的敏感性，将已知抗体或抗原标记上易显示的物质，通过检测标记物，反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。
常用的标记物有酶、荧光素、放射性同位素、胶体金及电子致密物质等。
这种抗原或抗体标记上显示物所进行的特异性反应称为免疫标记技术(immunolabelling technique)。
免疫标记不仅大大提高了试验敏感性，若与光镜或电镜技术相结合，能对组织或细胞内的待测物质作精确定位，从而为基础与临床医学研究及诊断提供方便。
免疫标记技术大致分为两大类：一类属于免疫组织化学技术(immunohistochemical technique)，用于组织切片或其他标本中抗原的定位。
另一类称为免疫测定(immunoassay)，用于液体标本中抗原或抗体的测定。
一，免疫酶技术(immunoenzymatic technique)最早应用的免疫酶技术是免疫酶组织化学染色，即用标记的抗体与标本中的抗原发生特异性结合，当加入酶的底物时，在酶的作用下经一系列生化反应产生有色物质，借助光镜作出定位判断。
目前，应用最广泛的是酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。
该法特异性强，敏感性高，既可检测抗体，又能测定可溶性抗原。
主要方法及操作要领见图18.5，除了图示的两种方法外，还有抗原竞争法，现较少应用。
ELISA常采用的酶为辣根过氧化物酶(hosradish peroxidase，HRP)，其底物是二氨基苯胺(DAB)，底物被分解则呈棕褐色，可目测或借助酶标仪比色。
ELISA为非均相免疫测定，另外还有均相法，在此不作介绍。
由于酶免疫测定无需特殊仪器和试剂，且操作简便，利于普及。
因此，在免疫标记技术中，该法应用最为广泛，并在原有方法基础上加以改良，使得众多新的，更敏感的方法应运而生。
①生物素-亲和素放大系统(biotin-avidin system，BAS)，建立于70年代后期，通过将酶标记在生物素或亲和素上，借助生物素与亲和素的高度亲力和生物素能与抗体结合的特点应用于ELISA，显著提高了检测的敏感性。
第六节 免疫标记技术
第十一章血清学试验第六节免疫标记技术免疫标记技术是利用抗原抗体反应的特异性和标记分子极易检测的高度敏感性相结合形成的试验技术。
免疫标记技术主要有荧光抗体标记技术、酶标抗体技术和同位素标记抗体技术。
它们的敏感性和特异性大大超过常规血清学方法，现已广泛用于传染病的诊断、病原微生物的鉴定、分子生物学中基因表达产物分析等领域。
其中酶标抗体技术最为简便，应用较广。
这里主要介绍荧光抗体标记技术和酶标抗体技术。
一、荧光抗体标记技术荧光抗体标记技术（fluorescent-labelled antibody technicque）是用荧光色素标记在抗体或抗原上，与相应的抗原或抗体特异性结合，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。
（一）原理荧光素在10-6的超低浓度时，仍可被专门的短波光源激发，在荧光显微镜下可观察到荧光。
荧光抗体标记技术就是将抗原抗体反应的特异性、荧光检测的高敏性、以及显微镜技术的精确性三者结合的一种免疫检测技术。
（二）荧光色素荧光色素是能产生明显荧光，又能作为染料使用的有机化合物。
主要是以苯环为基础的芳香族化合物和一些杂环化合物。
它们受到激发光(如紫外光)照射后，可发射荧光。
可用于标记的荧光色素有异硫氰酸荧光黄(FITC)、四乙基罗丹明(RB 200)和四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC）。
其中FITC应用最广，为黄色结晶，最大吸收光波长为490～495nm,最大发射光波长520～530nm，可呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC分子中含有异硫氰基，在碱性(pH9.0～9.5)条件下能与IgG分子的自由氨基结合，形成FITC-IgG结合物，从而制成荧光抗体。
抗体经荧光色素标记后，不影响与抗原的结合能力和特异性。
当荧光抗体与相应的抗原结合时，就形成了带有荧光性的抗原抗体复合物，从而可在荧光显微镜下检出抗原的存在。
（三）荧光抗体染色及荧光显微镜检查1．标本片的制备标本制作的要求首先是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保持不变。
免疫组化试题参考答案
免疫组织化学试题参考答案一、名词解释：1.PAS反应：即过碘酸--雪夫反应显示糖原，简称PAS反应。
其原理是通过利用过碘酸的氧化作用，使糖分子中的二醇基氧化为二醛基，释放出醛基，与碱性品红反应，生成紫红色化合物沉淀。
2.Feulgen法：即福尔根反应显示DNA法。
其原理是组织用1NHCl 60℃水解，将DNA分子中脱氧核糖核酸与嘌呤间的连链打开，使之释放出醛基与碱性品红发生反应，生成紫红色化合物沉淀。
3.PAP法：即过氧化物酶一抗过氧化物酶法，该技术原理与其他免疫定位技术相同，即通过抗体使标记分子（抗辣根过氧化物酶）定位于抗原附件。
其不同点为三步法，且有放大作用，反应完全依赖于免疫学结合，不需要标记任何抗体，反应灵敏度高，背景低。
注意一抗与复合物中的抗体必须来源于同一种动物，且二抗必须过剩。
4.核酸探针：指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知标记的核酸片段，可检测待测样品中特定的基因序列。
无标记的探针称裸探针。
5.核酸分子杂交：指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。
杂交的双方分别为待测的核酸序列和已知核酸序列，后者通常用核素或非核素示踪标记，称为探针（probe），杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。
6.质量控制：指组织化学反应各环节中获得最佳效果的技术把握，是组织化学的关键环节，是取得满意效果的必要条件，是提高结果可信度的根本保证。
7.诱发荧光：组织细胞中的某些物质本身不发荧光，但在经过一定的化学反应后可以转变成荧光分子。
此技术目前主要应用在生物胺的显示中。
其中最重要的是甲醛和乙醛酸诱发多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素和5—羟色胺荧光，以及邻苯二醛诱发组织胺荧光的反应。
8.定量分析：定量判断是结果判断中最重要也是具有意义的判断，其判断结果有助于统计学的分析处理。
组织细胞化学结果的定量分析又称定量组织细胞化学，指在组织细胞化学阳性结果的基础上，对阳性结果（最终阳性产物）进行测量，以数值反应被检测物质的含量。
常用分子标记技术原理及应用
常用分子标记技术原理及应用分子标记技术是现代分子生物学、生物化学和生物医学研究中常用的重要方法之一，其原理是利用特定的物质（分子标记）与待检测分子结合，从而实现对待检测分子的定位、测定和分析。
常用的分子标记技术包括荧光标记、酶联免疫法（ELISA）、放射性同位素标记和生物素标记等，下面将详细介绍其中的原理及应用。
1.荧光标记技术荧光标记技术是一种基于物质固有性质的分子标记方法，其原理是将待检测物质与荧光染料结合，通过荧光信号的激发和发射实现对物质的定位和检测。
荧光标记技术具有高灵敏度、多重标记、高分辨率和实时监测等优点，在生物学研究和临床诊断中得到广泛应用。
例如，荧光标记技术可应用于细胞内分子定位、蛋白质相互作用研究和病原体检测等领域。
2.酶联免疫法（ELISA）酶联免疫法是一种常用的免疫学实验方法，其原理是将待检测物质与特异性抗体结合，然后再用酶标记的二抗对抗体进行反应，通过酶底物的转化反应实现对待检测物质的定性和定量分析。
酶联免疫法具有高灵敏度、高特异性和简单易行等特点，在医学诊断和生物分析中被广泛应用。
例如，酶联免疫法可用于检测临床血清中的肿瘤标志物、抗体和炎症因子等，对于早期疾病诊断、药物研发和治疗效果评估具有重要意义。
3.放射性同位素标记技术放射性同位素标记技术是一种基于放射性元素的分子标记方法，其原理是将待检测物质与放射性同位素结合，通过放射性同位素的放射衰变实现对物质的定位和追踪。
放射性同位素标记技术具有极高的灵敏度和追踪性，广泛应用于核医学、分子显像和生物研究等领域。
例如，放射性同位素标记技术可用于肿瘤显像、药物代谢研究和放射免疫测定等，对于肿瘤早期诊断、药物研发和治疗效果评估有着重要的作用。
4.生物素标记技术生物素标记技术是一种基于生物素-亲和素相互作用的分子标记方法，其原理是将待检测物质与生物素结合，通过生物素和亲和素之间的特异性结合实现对物质的定位和检测。
生物素标记技术具有高特异性、高亲和力和多重标记等优势，在生物学研究和生物医学中得到广泛应用。
抗体荧光标记方法
抗体荧光标记方法1. 嘿，你知道直接标记法不？就像给抗体穿上一件闪闪发光的外套！比如说，把荧光染料直接连接到抗体上，哇哦，这样不就很直观地看到抗体啦！就像给小宠物戴上一个漂亮的铃铛，一下子就能找到它。
2. 还有间接标记法呢！这就好比接力赛呀。
先让一抗去结合目标，然后再用带荧光的二抗去结合一抗。
举个例子，就像先派个侦查员去找到目标，再让带着荧光信号的大部队去跟上，酷吧！3. 生物素-亲和素系统标记法也很厉害呀！就像搭积木一样，生物素和亲和素能紧密结合。
比如说在抗体上连上生物素，再和带荧光的亲和素结合，这多巧妙呀！4. 酶标抗体法也不容小觑哦！可以让酶去作用产生能发光的东西。
就好像是点燃了一个小烟花来引起注意，不是很有趣吗？比如用特定的酶让底物发光来指示抗体的位置。
5. 量子点标记法呢，那可是很神奇的哟！量子点就像一个个超级闪亮的小精灵。
比如用它们标记抗体后，那光芒简直耀眼，能非常清晰地显示出来。
6. 荧光蛋白标记法也很棒呀！不就跟让抗体带上了会发光的小彩灯一样嘛。
就像给抗体化了个闪亮的妆，一下子就变得与众不同啦，比如说用绿色荧光蛋白来标记。
7. 化学发光标记法也很好玩呀！虽然它不是直接发荧光，但能产生化学反应发光呢。
这就好像变魔术一样，突然就亮出光芒了，比如免疫反应后产生化学发光来指示抗体的存在。
8. 金标抗体法你可别小瞧呀！小小的金颗粒可是有大作用呢。
就如同给抗体配上了一个独特的标志，很容易被发现。
比如说金颗粒聚集后就能看到明显的信号啦。
我觉得这些抗体荧光标记方法都各有各的奇妙之处，根据不同的需求可以选择合适的方法，它们真的是科研中的好帮手呀！。
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
一、酶标记1、辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。
为了防止HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/LNaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。
(3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml)，混匀。
(4)称取SephadexG25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。
(5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403×0.4IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。
标记蛋白质的方法
标记蛋白质的方法
1. 荧光标记：利用荧光染料或荧光蛋白（如绿色荧光蛋白）与蛋白质结合，通过荧光信号来检测和观察蛋白质的位置和表达水平。
2. 酶标记：将酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）与蛋白质结合，然后通过添加底物使其产生颜色或荧光信号来标记蛋白质。
3. 放射标记：利用放射性同位素（如³H、³²P、¹²⁵I等）与蛋
白质结合，通过放射性衰变来检测和测量蛋白质的存在和活性。
4. 生物素标记：将生物素与蛋白质结合，然后利用亲和试剂与其结合，通过添加荧光染料或酶底物进行检测。
5. 金标记：利用金颗粒与抗体结合，形成金标记复合物，通过电子显微镜可以观察到金颗粒的位置和蛋白质的分布。
6. 核酸标记：利用荧光标记的DNA或RNA探针与蛋白质结合，通过荧光显微镜等技术来检测蛋白质的位置和表达水平。
生物标记法
生物标记法生物标记法是指利用生物分子或者生物细胞作为标记，通过分析它们的特征来确定某个物质或者过程的存在或者发生。
近年来，随着科学技术的发展，生物标记法已经成为生物和医学研究领域中不可缺少的技术手段之一。
生物标记法包括很多种不同的技术方法。
其中，常见的包括：免疫标记法、荧光标记法、同位素标记法、DNA标记法等。
下面将对这些技术方法进行简要介绍。
免疫标记法免疫标记法利用抗体对目标物质进行特异性识别，从而实现对这个物质的检测。
这种方法的原理基于抗原与抗体的结合作用，而抗体又与一种标记物质（如酶、荧光物质等）结合，从而形成可见的信号。
因此，免疫标记法的优点在于：具有高度的特异性和灵敏度、能够快速检测低浓度的物质。
荧光标记法荧光标记法是利用荧光分子作为标记，通过检测荧光信号来确定目标物质或过程的存在。
荧光分子常见的是荧光染料或者荧光蛋白。
这种方法的优点在于：可以进行实时检测、对样品量的要求较低、适用于多重标记。
同位素标记法同位素标记法利用同位素对分子内部的位置进行标记，通过检测特定同位素的信号来确定目标物质或过程的存在。
同位素标记法的优点在于：标记效果稳定、不产生外部信号干扰、量只能测量等。
DNA标记法DNA标记法是利用针对目标DNA的特异性结合和杂交情况，通过分析标记DNA的信号来确定目标DNA的存在和特征。
这种方法的优点在于：高水平的特异性和灵敏度、适用于多种样品类型。
总体来说，生物标记法可以利用分子生物学、细胞生物学、免疫学等多种技术手段实现对生物系统的详细分析，从而拓展人们对于生物系统的理解和认识。
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几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
一、酶标记1、辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。
为了防止HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/LNaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。
(3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml)，混匀。
(4)称取SephadexG25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。
(5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403×0.4IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。
标记率=OD403/OD280酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、特异性。
(8)HRP抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融;或加入等量60%甘油4℃保存;不宜加NaN3或酚防腐，否则会影响酶活性。
必要时冻干保存，以BSA或脱脂牛奶作保护剂。
程序二：(1)将5mg HRP 溶于0.3mol/L PH8.1NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml，室温搅拌作用1小时，以封闭HRP分子上的α和ε氨基。
(2)再加1ml 0.06mol/L 过碘酸钠溶液，在室温中避光轻搅30分钟，溶液呈黄绿色;随后加1ml 0.06mol/L乙二醇，轻搅1小时，中止氧化反应。
(3)移入透析袋中，在1000ml 0.01mol/LPH9.5碳酸盐缓冲液中，4℃透析过夜，更换三次缓冲液，注意避光。
(4)吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mg IgG的碳酸盐缓冲液1ml，室温轻搅2-3小时，避光;加入5mg NaBH4 ，4℃放置3小时或过夜，或换用乙醇胺(2mol/L PH9.5)0.2ml，作用7小时。
(5)再移入透析袋中，在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析24小时，更换三次缓冲液。
(6)用3000r/min离心30分钟，除去沉淀物。
上清液再用半饱和硫酸铵盐析三次，沉淀用少许PBS溶解，透析或层析除盐，必要时进一步层析纯化。
(7)、(8)步骤同程序一。
2、碱性磷酸酶(AP)标记碱性磷酸酶(AP)用于标记抗体，常用戊二醛一步法，将酶和单抗混合，再加入适量戊二醛，使酶和抗体蛋白的NH2分别与两个醛基结合，制备成结合物。
该法简便，但所得产物不均一，抗体活性损失大，酶标记率低。
其程序如下：(1)将5mg AP加入1ml抗体溶液(2mg/ml)中溶解，装入透析袋，于4℃对0.01mol/L PH7.2PBS透析18小时，换液三次。
(2)加入2.5%戊二醛20ul，室温作用1-2小时，4℃对PBS透析过夜，其间换液三次。
(3)换用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。
(4)取出标记抗体，用含1%BSA的Tris-HCl缓冲液稀释至4ml，即为AP标记物原液。
(5)每毫升中加入0.4ml甘油，小量分装，保存备用。
3、PAP、APAAP的制备PAP(过氧化物酶-抗过氧化物酶桥联酶标技术)、APAAP(碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标技术)的制备对于日益广泛使用单抗的免疫细胞化学有重要意义。
现在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊和兔PAP、APAAP试剂供应，只要配以相应的桥抗体，即可非常便利地应用单抗。
因为PAP法和APAAP法不用任何化学交联剂处理酶和抗体，它们的活性均不受化学因素的影响，提高了敏感性和特异性。
PAP和APAAP试剂的制备方法常采用先将HRP或AP加入抗HRP或AP的抗血清或单抗中而获得免疫沉淀物，再加入酶盐水，过量的酶有助于免疫沉淀物的解离反应，调PH至2.3，随后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半饱和硫酸铵，纯化PAP或APAAP。
根据需要还可将PAP和APAAP试剂先与相应桥抗体结合后，再与特定单抗组成完整的诊断试剂，这样，单抗即可一步法用于诊断或检测试验等。
二、荧光素标记1、异硫氰酸荧光素(FITC)标记FITC标记抗体的原理是在碱性条件下，FITC 的异硫氰基能与IgG的自由氨基结合，形成IgG与荧光素的结合物。
FITC是最常用的荧光素，其次选用TRITC(四甲基异硫氰酸罗丹明)。
FITC和TRITC是常用的双标记组合。
其标记步骤如下：(1)以碳酸盐缓冲液(PH9.3，Na2CO3 8.6g，NaHCO3 17.3g，蒸馏水1000ml)调整抗体浓度至10mg/ml。
(2)取5ml抗体溶液置于10ml小烧杯中。
(3)称取1mg FITC溶于0.2mlDMSO中，待溶解后立即缓慢滴加于抗体液内，边加边轻搅;其后室温避光作用2小时。
(4)将交联物经Sephadex G25或G50柱层析除去游离的荧光素;分管收集第一峰为标记的抗体。
(5)FITC的结合物质量鉴定IgG量(mg/ml)=(OD280-OD495×0.35)/1.4F/P=2.87×OD495/(OD280-OD495×0.35)，一般说，FITC对抗体的摩尔比为3：1时适合于组织切片染色，为5-6：1时适合于细胞悬液染色。
以标记抗体染色各种抗原，测定其特异性染色滴度和非特异染色的程度。
(6)标记抗体的保存：宜保存于4℃，加NaN3防腐。
2、异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记：基本与FITC标记相同。
三、同位素标记必须强调的是在使用同位素标记单抗或其他蛋白之前，应掌握同位素操作和防护知识。
正常情况下应包括避免物理的接触和对γ-射线照射的有效保护，操作和使用同位素标记抗体时，应利用防护装置，并合理处置含放射性的废料。
1、碘标记用碘标记抗体是一种有效的标记方法。
125I衰变产生低能的γ和χ射线，很容易被检测出来，而其60天的半衰期保证足够的有效使用期，且能很方便地处理放射废料。
最常用的碘标记方法是氯胺T法，即将氧化剂氯胺T加入到抗体和碘化物的溶液中，Na125I在氯胺T作用下I转化成I2，游离I2可与抗体分子中酪氨酸和一些组氨酸发生卤化反应，用还原剂和游离酪氨酸终止反应，经凝胶过滤将标记的抗体与碘化酪氨酸及还原剂分离开。
其主要操作步骤如下：(1)在进行标记之前，先选用截流分子量为20000-50000的凝胶，制备1ml凝胶柱，然后分别用10倍体积的1%BSA/PBS/0.02%叠氮钠和PBS洗涤柱体，封住柱下口，备用。
(2)加入10ug纯化单抗至含有25ul 2.5mol/L磷酸钠(PH7.5)的1.5ml指形管内。
随后，加入500uCiNa125I混匀。
(3)加入25ul新配制的2mg/ml氯胺T。
室温放置60秒。
再加入50ul氯胺T终止液(含2.4mg/ml偏重亚硫酸钠，10mg/ml酪氨酸，10%甘油和0.1%环乙烷酰二甲苯的PBS)。
(4)将上述碘标记物上样在凝胶柱表面，小心放开柱体下口，用1.5ml指形管收集。
当碘标记物全部进入柱体，加入0.3ml含0.03%叠氮钠的PBS，用另一指形管收集0.3ml，然后再加0.3ml0.03% NaN3PBS，下口收集0.3ml，重复进行，同时用同位素检测仪测定标记与未标记的单抗。
标记抗体大约在第二至第四管出现。
无害化处理柱子和非单抗标记部分。
(5)将标记单抗保存于4℃可使用6周时间。
2、生物合成法标记将杂交瘤细胞培养在含有放射性前体的培养基中，随着抗体分子的合成、组装，同位素会标记在抗体分子的初级氨基酸链上，本方法不会导致抗体活性的丧失。
其主要步骤是：(1)离心收集处于对数生长期的杂交瘤细胞，约需2×106个细胞。
以预热37℃不含甲硫氨酸的培养基洗涤上述细胞。
(2)用含2%PBS不含甲硫氨酸的培养基悬浮杂交瘤细胞至106个/ml，加入35S甲硫氨酸(每次加入100uCi可产生105-106cpm的抗体)。
(3)经C02培养箱中培养过夜，离心后，吸出培养上清，分别加入1/20体积的1mol/LTris(PH8.0)及叠氮钠至浓度0.02%。
该标记抗体可按纯化单抗方法进行。
四、生物素标记生物素标记反应常用生物素琥珀酰亚胺酯进行。
生物素是与抗体分子的游离赖氨酸等发生偶联反应而完成标记。
其主要步骤是：1、用二甲基亚砜配制10mg/ml的N-羟琥珀酰亚胺生物素(应根据需要选用不同大小和间臂长的生物素化琥珀酰酯)。
2、用硼酸钠缓冲液(0.1mol/L，PH8.0)稀释单抗溶液至1-3mg/ml。
3、每毫克抗体加入25-250ug的生物素酯，混匀后，室温作用4小时。
4、按每250ug生物素酯加入20ul 1mol/L NH4Cl终止反应，室温放置10分钟。
5、以PBS充分透析除去游离生物素，标记抗体冻存。
五、其他标记技术适用于蛋白质的其他标记方法也可用于单抗，如金标记、化学发光标记、SPA标记、铁蛋白标记等。
免疫标记是一种操作简单、灵敏度高的技术，主要原理是级联方法效应。
单抗已经广泛用于疾病诊断等，主要是利用单抗标记的诊断试剂盒进行的。