几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记

几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标

记、生物素标记

抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。

一、酶标记

1、辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。

程序一：

(1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/L

NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。

(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。

(3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml)，混匀。

(4)称取Sephadex

G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。

(5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加

1/20V体积新鲜配制的5mg/ml

NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。

(6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose

6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。

(7)酶结合物质量鉴定：

克分子比值测定

酶量(mg/ml)=OD403×0.4

IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62

克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。

标记率=OD403/OD280

酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及

效价、特异性。

(8)HRP抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融;或加入等量60%甘油4℃保存;不宜加NaN3或酚防腐，否则会影响酶活性。必要时冻干保存，以BSA或脱脂牛奶作保护剂。

程序二：

(1)将5mg HRP 溶于0.3mol/L PH8.1

NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml，室温搅拌作用1小时，以封闭HRP分子上的α和ε氨基。

(2)再加1ml 0.06mol/L 过碘酸钠溶液，在室温中避光轻搅30分钟，溶液呈黄绿色;随后加1ml 0.06mol/L

乙二醇，轻搅1小时，中止氧化反应。

(3)移入透析袋中，在1000ml 0.01mol/L

PH9.5碳酸盐缓冲液中，4℃透析过夜，更换三次缓冲液，注意避光。

(4)吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mg IgG的碳酸盐缓冲液1ml，室温轻搅2-3小时，避光;加入5mg NaBH4 ，4℃放置3小时或过夜，或换用乙醇胺(2mol/L PH9.5)0.2ml，作用7小时。

(5)再移入透析袋中，在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析24小时，更换三次缓冲液。

(6)用3000r/min离心30分钟，除去沉淀物。上清液再用半饱和硫酸铵盐析三次，沉淀用少许PBS溶解，透析或层析除盐，必要时进一步层析纯化。

(7)、(8)步骤同程序一。2、碱性磷酸酶(AP)标记

碱性磷酸酶(AP)用于标记抗体，常用戊二醛一步法，将酶和单抗混合，再加入适量戊二醛，使酶和抗体蛋白的NH2分别与两个醛基结合，制备成结合物。该法简便，但所得产物不均一，抗体活性损失大，酶标记率低。其程序如下：

(1)将5mg AP加入1ml抗体溶液(2mg/ml)中溶解，装入透析袋，于4℃对0.01mol/L PH7.2

PBS透析18小时，换液三次。

(2)加入2.5%戊二醛20ul，室温作用1-2小时，4℃对PBS透析过夜，其间换液三次。

(3)换用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。

(4)取出标记抗体，用含1%BSA的Tris-HCl缓冲液稀释至4ml，即为AP标记物原液。

(5)每毫升中加入0.4ml甘油，小量分装，保存备用。

3、PAP、APAAP的制备

PAP(过氧化物酶-抗过氧化物酶桥联酶标技术)、APAAP(碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标技术)的制备对于日益广泛使用单抗的免疫细胞化学有重要意义。现在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊和兔PAP、APAAP试剂供应，只要配以相应的桥抗体，即可非常便利地应用单抗。因为PAP法和APAAP法不用任何化学交联剂处理酶和抗体，它们的活性均不受化学因素的影响，提高了敏感性和特异性。PAP和APAAP试剂的制备方法常采用先将HRP或AP加入抗HRP或AP的抗血清或单抗中而获得免疫沉淀物，再加入酶盐水，过量的酶有助于免疫沉淀物的解离反应，调PH至2.3，随后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半饱和硫酸铵，纯化PAP或APAAP。

根据需要还可将PAP和APAAP试剂先与相应桥抗体结合后，再与特定单抗组成完整的诊断试剂，这样，单抗即可一步法用于诊断或检测试验等。

二、荧光素标记

1、异硫氰酸荧光素(FITC)标记

FITC标记抗体的原理是在碱性条件下，FITC 的异硫氰基能与IgG的自由氨基结合，形成IgG与荧光素的结合物。FITC是最常用的荧光素，其次选用TRITC(四甲基异硫氰酸罗丹明)。FITC和TRITC是常用的双标记组合。其标记