分子生物学实验技术实验内容
分子生物学实验技术实验内容讲解
2006年《分子生物学实验技术》实验内容一、RT-PCR（一）总RNA的提取实验安排：每两人抽提一管。
为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。
操作步骤：1、将100μl液体样品加入1.5ml Ep管中，再加入900μl冰预冷的LS-Biotragents TM（苯酚和异硫氰酸胍的混合物）。
2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。
3、加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。
4、在4℃条件下，以10000×g离心15min。
5、将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。
6、在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。
7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。
8、将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-Free Water）将RNA溶解并于-20℃保存。
注意事项：1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC水浸泡过夜。
3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。
（二）反转录实验安排：每人做一管。
反应体系（20μl）：按下列顺序加样反应条件：42℃ 1h注意事项：1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。
如在一般的PCR反应体系中，应先加水、Buffer、dNTPs、引物，最后加酶和模板。
2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。
3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。
分子生物学实验技术全攻略
分子生物学实验技术目录实验一细菌的培养 2实验二质粒DNA的提取 3实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9实验八 RNA提取与纯化 11实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15实验十一感受态细胞的制备及转化 16实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18实验十三 DNA分析——Southern杂交 19一基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化二、目的基因获取实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA分析——Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。
二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。
特别是常用的大肠杆菌。
大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。
它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。
当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。
然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。
分子生物学实验技术.pptx
DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环 境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、 有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环 境又可以使DNA复性。
SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞 裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌 细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒 DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放 出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。 然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中 性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分 子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中， 而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底 部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出 来。
2. 启始复制子（ori, Origin of
replication)； 3. 多克隆位点(MSC, Multiple cloning
site or polylinker)； 4. 标பைடு நூலகம்基因(Marker gene, such as
LacZ gene)。
Ampr抗性基因
Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地 切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力
分子生物学实验
目录
实验一、植物染色体DNA的提取及纯度鉴定 实验二、大肠杆菌质粒DNA的提取 实验三、琼脂糖凝胶电泳 实验四、ＤＮＡ的限制性酶切 实验五、大肠杆菌感受态细胞的制备及外源DNA
的转化 实验六、PCR基因扩增技术
实验一、植物染色体DNA的提取 及纯度鉴定
一、实验目的
• 掌握真核植物基因组染色体DNA的一种提 取方法
P(BLA) ApaLI (2367)
APr
pUC19
2686 bp
分子生物学实验技术3篇
分子生物学实验技术
第一篇：PCR技术
PCR（聚合酶链反应）是一种基于体外体内 DNA 复制的技术。
PCR 技术广泛应用于分子生物学、生物医学研究、医学诊断、生物技术等领域。
在 PCR 中，核酸模板、引物、聚合酶和反应缓冲液是必不可少的组成部分。
PCR 引物是在特定位置的 DNA 片段，用于诱导聚合酶模板 DNA 的扩增。
聚合酶通过催化模板 DNA 在 DNA 引物的引导下合成相应的 DNA 片段，产生大量的重复 DNA 片段。
PCR 是一种快速、高效、灵敏的 DNA 分析技术，可以对非常小的样本进行扩增。
PCR 的操作流程如下：
1．取得合适的 DNA 样品。
2．准备 PCR 反应体系，包括 PCR 反应缓冲液、聚合酶、DNA 模板和引物。
3．用 PCR 机进行程序设定和反应。
4．检查 PCR 反应产物，包括 PCR 产物的带型和验证PCR 产物的特异性和纯度等。
PCR 的应用
1．DNA 序列鉴定以及 DNA 序列变异检测。
2．基因表达分析、基因定量、等位基因分析等基因功能研究操作。
3．分子诊断，可以根据染色体、基因、蛋白质等材料进行分析。
4．农业和畜牧业生物工程的研究。
优点：
PCR 反应时间逐渐缩短，灵敏度高，重现性好，稳定性强。
PCR 技术可以在非常小范围内进行 DNA 分析，并可以处理复杂的实验体系。
缺点：
PCR 技术还有一些局限性，比如需要合理设计引物，需要准确的温度控制，需要恰当的试剂，且对样品的纯度和净化度有严格的要求。
研究生生物学教案：细胞分子生物学技术实验
研究生生物学教案：细胞分子生物学技术实验一、引言本教案旨在介绍研究生生物学课程中的细胞分子生物学技术实验内容。
通过这些实验，研究生将能够深入了解和掌握细胞分子生物学领域的基本操作和技巧，培养科研素质和实验技能。
二、实验目标1.掌握DNA分离与纯化技术。
2.理解PCR（聚合酶链式反应）原理及其应用。
3.学习基因克隆的方法和原理。
4.熟悉蛋白质表达与纯化技术。
5.实践基因组编辑技术CRISPR-Cas9。
三、实验内容3.1 DNA分离与纯化•实验原理：该实验旨在通过裂解细胞获得DNA，并利用离心等方法进行DNA的纯化。
•实验步骤：•组织样品处理；•细胞裂解；•蛋白质沉淀；•DNA沉淀与洗涤；•最后的DNA溶解。
3.2 PCR技术•实验原理：PCR是一种重复性进行的体外DNA复制方法。
该实验旨在利用PCR技术扩增目标DNA段。
•实验步骤：•DNA模板的准备；•寡核苷酸引物设计；•PCR反应体系配制；•PCR程序设置；•PCR产物分析。
3.3 基因克隆•实验原理：基因克隆是将感兴趣的DNA序列插入载体，并转化到宿主细胞中，使其能够稳定地表达目标蛋白质。
•实验步骤：•DNA片段切割与连接；•载体的选择与准备；•受体菌株的选择与转化；•克隆子筛选与验证。
3.4 蛋白质表达与纯化•实验原理：该实验旨在通过大肠杆菌表达系统表达目标蛋白质，并利用亲和层析等纯化技术纯化蛋白质。
•实验步骤：•表达载体构建与转化；•菌液培养与感诱液处理；•细胞裂解与终浓缩液处理；•蛋白质纯化与分析。
3.5 CRISPR-Cas9基因组编辑•实验原理：CRISPR-Cas9是一项革命性的基因组编辑技术，本实验旨在进行CRISPR-Cas9介导的基因敲除实验。
•实验步骤：•核酸序列设计与构建；•整合载体注射或转染；•细胞培养与筛选；•效果验证。
四、实验评估每个实验的评估将基于学生的实际操作能力、理解程度和结果展示情况，并根据提交的报告和数据进行评分。
分子生物学实验3篇
分子生物学实验第一篇：PCR技术在分子生物学中的应用PCR（聚合酶链式反应）是分子生物学中一项广泛应用的技术，被用于DNA的扩增和检测。
PCR技术已经成为了分子生物学和生物医学研究的基础技术之一。
PCR技术被广泛的应用于遗传学、人类学、医学研究、植物学和动物学研究等各领域。
PCR技术的基本原理是：通过提取DNA，将DNA特异性引物与模板DNA相结合，利用热稳定DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸为反应体系提供能量，使其在一定条件下循环扩增目标DNA片段。
通过PCR扩增后的DNA片段可以进行进一步的分析和检测。
PCR技术的扩增具有明显的优势，可同时扩增不同长度的DNA片段，扩增时间短，扩增的精度和重复性高，且所需的样本量小。
PCR技术在分子诊断、基因组学和分子系统学等领域的应用不断扩展和深化。
随着PCR技术的不断发展，PCR在分子生物学研究中的应用越来越广泛，成为分子生物学研究的重要工具。
第二篇：RNA干扰技术在分子生物学中的应用RNA干扰（RNAi）是分子生物学中一种重要的现象，其中小分子RNA片段通过RNAi途径参与靶基因的沉默和调节。
RNAi技术是人类基因功能研究中最具前途的一种技术之一。
RNA干扰技术的基本原理是通过利用RNAi分子的特异性配对功能，引导RNAi分子与靶基因mRNA相结合，导致mRNA的降解和翻译的抑制，实现对基因表达的调控。
RNA干扰技术在分子生物学研究中有广泛的应用，如：功能基因的筛选、基因表达调节、基因功能验证等。
RNA干扰技术具有多种优点，如高效性、特异性强、节约时间、资源和成本等方面的优势，逐步成为生命科学研究中的重要工具。
在研究过程中，RNA干扰技术常用于寻找分子病理学中新的治疗靶点，鉴定靶点基因和靶点蛋白，为新药物的开发和临床治疗提供了重要的理论和实验基础。
第三篇：基因克隆技术在分子生物学中的应用基因克隆技术始于20世纪70年代，是指将DNA分子导入到载体中，使其在细胞中进行表达的过程。
分子生物学实验室常见实验
分子生物学实验室常见实验
1.基因克隆：通过PCR扩增目标基因或外源基因，将其克隆到载体中，如质粒、病毒等，使其能够在宿主细胞中表达。
2. PCR：聚合酶链式反应，是一种可在体外扩增DNA序列的技术，适用于从少量DNA样品中扩增特定区域的DNA片段。
3. 蛋白质表达与纯化：通过基因克隆，将目标蛋白质表达于宿主细胞中，并通过蛋白质纯化技术将其纯化出来。
4. DNA测序：通过测序仪对DNA序列进行测定，可以用于基因组测序、基因突变分析等。
5. RNA干扰：通过RNA干扰技术，将RNA分子导入到细胞中，靶向特定的基因，从而抑制基因表达。
6. 细胞培养：将细胞放入培养皿中，提供合适的营养物，使其在体外生长并繁殖，可用于体外实验研究。
以上是分子生物学实验室常见实验，这些实验技术广泛应用于生命科学领域的基础研究和应用研究，为疾病诊断和治疗等方面提供了重要的科学支持。
- 1 -。
分子生物学实验方案
分子生物学实验方案实验目的：本实验旨在通过分子生物学技术，研究基因组中特定基因的表达，以及相关信号转导通路的调控机制。
实验原理：1. RNA提取：从细胞或组织中提取总RNA，利用RNA纯化试剂盒抽提RNA样本。
2. cDNA合成：通过逆转录酶反应，利用mRNA模板合成互补的cDNA，并去除RNA模板。
3. 实时定量PCR：使用合适的引物和荧光探针，通过荧光信号实时监测PCR增殖过程，分析特定基因的表达量。
4. 蛋白质免疫印迹：将细胞提取物或组织样本中的蛋白质，通过SDS-PAGE电泳分离，转移到膜上，用特异抗体与目标蛋白结合，再用二抗识别抗体结合，最后显色检测目标蛋白。
实验步骤：1. RNA提取- 准备待检测细胞或组织的样本。
- 使用RNA纯化试剂盒按照说明书进行RNA提取。
2. cDNA合成- 准备反应体系，包括RNA模板、逆转录酶、引物和dNTPs。
- 在PCR仪中进行cDNA合成反应，设定适当的温度和时间。
3. 实时定量PCR- 准备PCR反应体系，包括cDNA模板、引物、探针和荧光染料。
- 在实时荧光定量PCR仪中设定合适的温度程序和循环次数。
- 分析实时PCR数据，计算目标基因的表达量。
4. 蛋白质免疫印迹- 准备待检测细胞或组织的提取物。
- 使用SDS-PAGE分离细胞提取物中的蛋白质。
- 将蛋白质转移到膜上。
- 进行膜上抗体反应，并用二抗结合以增强信号。
- 检测目标蛋白的表达水平。
实验注意事项：1. 实验操作需在无菌环境下进行，以避免外源性RNA或蛋白的干扰。
2. 实验过程中，需使用质量可靠的试剂和仪器设备，确保实验结果准确可靠。
3. 操作时应注意个人防护，避免接触有害物质和受伤。
4. 实验中的样品处理需严格按照操作规程，以确保样品完整性和纯度。
实验结果与分析：通过以上实验方案，可以获得目标基因的表达水平及相关信号转导通路的调控机制。
实时定量PCR结果可用于定量分析目标基因在不同样本中的表达量的差异。
分子生物实验技术
分子生物实验技术
分子生物实验技术是一种应用于生物学领域的实验技术，利用现代分子生物学的基本
原理及技术手段，对生物体内的分子机制进行研究，其中包括基因表达调控、蛋白质结构
与功能等方面。
分子生物实验技术主要包括：DNA/RNA提取、PCR扩增、基因克隆、蛋白质质谱、基因编辑、分子标记等。
其中，DNA/RNA提取是分子生物学实验的基础手段，其过程是通过将细胞裂开，然后
利用一系列的化学方法来分离出DNA/RNA。
PCR扩增是一种在体外人工合成DNA的方法，它可以将DNA扩增至数千万倍，为后续基因克隆和鉴定提供了条件。
基因克隆是将所需的基
因拷贝到向量中，使其可以被转移至其他生物体中并发挥作用的过程。
蛋白质质谱是一种
用来解析蛋白质结构、鉴定蛋白质功能及定量测定蛋白质含量的技术手段。
基因编辑是一
种新近兴起的技术手段，利用这种技术可以直接对基因进行修饰、插入或删除，应用广泛。
分子标记则是将特定基因或序列标记出来，便于后续的研究工作。
分子生物实验技术在现代生物科技中具有重要作用，它们可以广泛应用于基因检测、
基因治疗、生物大数据、新药研发等领域，能够为人类健康和生命科学研究提供有力的支撑。
随着分子生物学不断发展，分子生物实验技术也将不断创新，为生物科学领域的发展
带来更多的科学进步。
分子生物学实验技术与方法
分子生物学实验技术与方法分子生物学是研究生物分子结构、功能与相互作用的学科，其实验技术与方法的发展为深入理解基因、蛋白质及其他生物分子在细胞和生物体中的功能提供了强有力的工具。
本文将探讨常用的分子生物学实验技术与方法，包括基因克隆、聚合酶链式反应（PCR）、凝胶电泳、原位杂交等。
1. 基因克隆基因克隆是指将感兴趣的基因从一个生物体转移到另一个生物体或一种载体上的过程。
其步骤主要包括DNA片段的制备、连接、转化和筛选等。
DNA片段的制备可以通过限制性内切酶酶切、PCR扩增等方法得到。
连接步骤中，需使用DNA连接酶将目标基因和载体进行连接。
连接后的DNA可通过转化将其导入宿主细胞，再经过选择和筛选得到目标克隆。
2. 聚合酶链式反应（PCR）PCR是一种通过体外扩增DNA片段的技术，具有高度特异性和高灵敏度。
其基本步骤包括变性、退火和延伸。
变性步骤中，目标DNA双链结构被分离为两条单链DNA。
接着，在退火步骤中，引物与目标DNA序列相互结合。
最后，在延伸步骤中，DNA聚合酶在退火完成后的DNA链上进行延伸合成。
PCR技术广泛应用于基因分型、基因定量、基因突变检测等领域。
3. 凝胶电泳凝胶电泳是一种将DNA、RNA或蛋白质按照其分子大小和电荷进行分离的技术。
其中，琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的两种凝胶电泳方法。
琼脂糖凝胶电泳适用于分离较大的DNA片段，而聚丙烯酰胺凝胶电泳适用于分离较小的DNA或蛋白质片段。
通过在电场中施加电压，DNA或蛋白质片段会在凝胶中向正极或负极迁移，形成带状分离图谱。
4. 原位杂交原位杂交是一种检测细胞或组织中特定DNA或RNA序列的方法。
其基本步骤包括制备探针、标记探针、固定样本以及杂交等。
制备探针时，需要选择适当的引物进行PCR扩增或使用放射性同位素进行标记。
标记后的探针能与特定的DNA或RNA序列互补杂交。
通过观察探针的信号强度和位置，可以确定目标序列在样本中的分布和表达水平。
分子生物学常用实验技术(精)
分子生物学常用实验技术第一章质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定第二章 DNA酶切及凝胶电泳第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第四章 RNA的提取和 cDNA 合成第五章重组质粒的连接、转化及筛选第六章基因组 DNA 的提取第七章 RFLP和 RAPD 技术第八章聚合酶链式反应 (PCR扩增和扩增产物克隆第九章分子杂交技术第十章测序技术第一章质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定第一节概述把一个有用的目的 DNA 片段通过重组 DNA 技术 , 送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体 (Vector。
细菌质粒是重组 DNA 技术中常用的载体。
质粒 (Plasmid是一种染色体外的稳定遗传因子 , 大小从 1-200kb 不等 , 为双链、闭环的 DNA 分子 , 并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力 , 能在子代细胞中保持恒定的拷贝数 , 并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活 , 而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性 , 如对抗生素的抗性等。
F 质粒 (又称F 因子或性质粒、 R 质粒 (抗药性因子和 Col 质粒 (产大肠杆菌素因子等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型 :紧密控制型 (Stringent control和松驰控制型 (Relaxed control 。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制 , 当染色体不复制时 , 它也不能复制 , 通常每个细胞内只含有 1个或几个质粒分子 , 如 F 因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制 , 在每个细胞中有许多拷贝 , 一般在 20个以上 , 如 Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂 -氯霉素时 , 细胞内蛋白质合成、染色体 DNA 复制和细胞分裂均受到抑制 , 紧密型质粒复制停止 , 而松驰型质粒继续复制 , 质粒拷贝数可由原来 20多个扩增至 1000-3000个 , 此时质粒 DNA 占总DNA 的含量可由原来的 2%增加至 40-50%。
分子生物学的实验技术
分子生物学的实验技术【分子生物学的实验技术】分子生物学作为现代生物科学领域的重要组成部分，以其独特的实验技术为研究人员提供了许多强有力的工具。
本文将对分子生物学中常见的实验技术进行介绍，包括DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳、克隆和测序等。
一、DNA提取DNA提取是分子生物学研究的第一步，也是最基本的实验技术之一。
DNA提取的目的是从生物样本中分离出DNA，并纯化得到高质量的DNA溶液，以便后续实验使用。
常用的DNA提取方法有酚/氯仿法、离心柱法和磁珠法等。
酚/氯仿法是一种传统的DNA提取方法，它利用酚和氯仿的不同密度分离DNA。
首先，将生物样本与裂解缓冲液混合并加入酚/氯仿混合液，通过离心分离出DNA在上层的细胞碎片，然后进行酚/氯仿再萃取和乙醇沉淀，最后得到纯化的DNA。
离心柱法是一种高效的DNA提取方法，它利用离心柱上的纤维素膜或硅胶膜对DNA进行捕获和纯化。
在这种方法中，生物样本与裂解缓冲液混合后，加入离心柱进行离心，DNA能够通过纤维素膜或硅胶膜的作用被固定，而其他杂质则被洗脱掉，最后用纯化缓冲液洗脱得到高质量的DNA。
磁珠法是一种快速、高通量的DNA提取方法，它利用表面修饰的磁珠对DNA进行特异性捕获。
在这种方法中，生物样本与裂解缓冲液混合后，加入磁珠混悬液，并利用磁力使磁珠与DNA结合，然后用磁力将磁珠与DNA一起沉淀到管壁上，洗脱杂质后得到纯化的DNA。
二、PCR扩增PCR（聚合酶链式反应）是一种用于体外扩增DNA的技术，通过反复的循环性温度变化，可以扩增特定的DNA片段。
PCR由于其高度敏感和高效性，被广泛应用于基因分型、基因定量、基因突变分析等领域。
PCR反应的基本组成包括DNA模板、引物、聚合酶、四种脱氧核苷酸和缓冲液。
首先，将DNA模板与引物、脱氧核苷酸和缓冲液混合，并添加聚合酶，然后进行多次温度循环，包括变性、退火和延伸等步骤，从而使DNA模板经过反复扩增，最后得到目标DNA片段的数量大幅增加。
分子实验
分子生物学基础实验分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。
为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。
它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。
实验一质粒DNA的小量制备一、实验原理要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。
载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。
作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。
细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。
质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。
它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。
质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。
每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。
分子生物学实验技术
分子生物学实验技术生物秀—专心做生物！ｗｗｗ．ｂｂｉｏｏ．ｃｏｍ生物秀论坛－学术交流，资源共享，互助社区ｗｗｗ．ｂｂｉｏｏ．ｃｏｍ／ｂｂｓ／目录实验一质粒的制备 (1)实验二质粒DNA 的琼脂糖凝胶电泳 (4)实验三外源DNA片段在质粒载体中的克隆 (7)实验四感受态细胞的制备 (11)实验五质粒的转化及转化子的鉴定 (14)实验六 PCR 技术 (18)实验七植物总 DNA 的快速少量抽提 (20)实验八总 DNA 质量检测及酶切 (23)实验九 Southern分子杂交（一） (26)实验十 Southern分子杂交（二） (30)实验十一植物总RNA的提取 (38)实验十二RT-PCR实验 (40)实验十三 RNA 的电泳，转膜和杂交 (43)实验一质粒的制备质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。
质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。
质粒的提取方法很多，大多包括 3 个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒 DNA 的分离和纯化。
本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。
实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。
实验材料：含有质粒 pUC18/19 载体的大肠杆菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC 的大肠杆菌菌液。
器材：超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面离心管架，试管架，标签纸等，磁力搅拌机。
实验原理：根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。
在pH 12.0～12.6 碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体 DNA 变性分开，而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。
将 pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体 DNA 、大分子量的 RNA 和蛋白质在去污剂SDS 的作用下形成沉淀，而质粒 DNA 仍然为可溶状态。
分子生物学实验技术
分子生物学实验技术目录实验一细菌的培养 (2)实验二质粒DNA的提取 (3)实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 (5)实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA (6)实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 (8)实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 (9)实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA (10)实验八RNA提取与纯化 (12)实验九RT-PCR扩增目的基因cDNA (15)实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 (17)实验十一感受态细胞的制备及转化 (18)实验十二克隆的筛选和快速鉴定 (20)实验十三DNA分析——Southern杂交 (22)一基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化二、目的基因获取实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA分析——Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。
二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。
特别是常用的大肠杆菌。
大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。
它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。
当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。
然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。
分子生物学实验技术
分子生物学实验技术分子生物学是现代生物学的重要分支之一，其在疾病预防、治疗和生物科技等方面有广泛应用。
本文将介绍分子生物学实验中常用的技术，并讨论其原理和应用。
一、基本实验技术1. DNA/RNA提取技术DNA/RNA提取是分子生物学实验中的基础技术之一。
DNA/RNA提取的目的是从细胞或组织中提取高质量的DNA或RNA，为其后续检测和研究做好准备。
现在市场上有多种DNA/RNA提取试剂盒，供实验室使用。
通常，提取DNA首先将组织/细胞裂解，然后进行蛋白质沉淀、DNA沉淀、洗涤和重溶等步骤。
而提取RNA则需要防止RNA酶的污染并保护RNA的完整性。
RNA提取常见的方法是直接裂解和三步酚-氯仿法等。
2. PCR技术PCR（聚合酶链式反应）技术是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
PCR反应是在一个热循环下进行的，包括退火、结合和扩增阶段。
其中，退火温度用于将引物与靶DNA结合，获得高特异性；扩增阶段用于扩增目标DNA片段，通常在72℃左右进行。
PCR技术广泛应用于疾病的诊断、基因多态性分析、DNA指纹鉴定和基因工程等方面。
对于基因工程，PCR技术在基因克隆、定量PCR、mutagenesis、突变扫描和芯片检测等方面也有重要应用。
3. 转染技术转染技术是指将外源基因或其他化合物转入目标细胞中的技术。
常用的转染方法包括：病毒介导的转染、电穿孔、化学转染及基于脂质体的转染等。
转染技术在基因治疗、模型建立、基因表达分析、药物筛选和基因敲除等方面都有广泛应用。
二、高级实验技术1. 基因测序技术基因测序是分子生物学中应用最广泛的技术之一，用于确定DNA序列。
常用的基因测序技术包括Sanger测序和新一代测序（NGS）技术。
Sanger测序是一种传统的测序技术，通过DNA聚合酶、DNA模板、引物和ddNTPs（二脱氧核苷三磷酸）来扩增和定序DNA。
此外，NGS技术的基本原理是平行测序，利用高通量测序技术对DNA样本进行重复测序，得到高质量的DNA序列。
分子生物学实验技术
《分子生物学实验技术》实验报告实验一碱裂解法小量提取质粒DNA一、实验原理在碱性环境中，细菌膜破裂释放内容物。
染色体DNA变性分开，而质粒DNA虽变性但仍处于缠绕状态。
将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。
通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，最后用酚、氯仿抽提纯化得到质粒DNA。
二、操作步骤主要步骤1.细菌的培养2.细菌的收集和裂解3.质粒DNA的分离和纯化4.质粒的鉴定具体操作如下：1. 取1.5 ml过夜菌液于EP管中，12 000 r/min离心1min，弃去上清液。
2. 加100 μl 溶液Ⅰ，剧烈震荡使菌体悬浮均匀，室温放置5min 。
3. 加200 μl 溶液Ⅱ（现配现用），轻柔颠倒混匀4~6次，室温放置5min 。
4. 加150μl预冷溶液Ⅲ，轻柔颠倒混匀4~6次，冰上放置10分钟。
5. 12 000 r/m离心10 分钟(如果上清液仍然浑浊，可将上清液移出，再次离心5分钟）。
6. 吸出上清液，加2.5倍体积的无水乙醇，混匀，室温放置10分钟，12 000r/min离心10分钟，沉淀DNA 。
7. 弃上清，挥干，所得DNA溶于30μlddH2O中，用于后续试验。
三、实验结果获取极少量白色固体，主要为DNA，也不排除有蛋白质等杂质，但是不影响后续实验的继续进行。
实验二氯化钙法进行质粒转化及筛选一、实验原理细菌处于0 ℃，在CaCl2低渗溶液中，菌体细胞膨胀成球形，DNA则与CaCl2形成抗Dnase的羟基－磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，重组子的基因在被转化的细菌中得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
1. 氯化钙（二价钙离子）的作用：提高细胞壁（膜）的通透性。
分子生物学实验技术
分子生物学实验技术分子生物学实验技术分子生物学是生物学的一项重要分支，它研究细胞分子机制、基因调控、遗传信息的传递、处理和表达等。
分子生物学实验技术是对分子生物学研究进行实验室操作和检测的方法与技术。
本文将从基础实验技术、基因克隆技术、基因表达技术、基因分析技术四个方面深入介绍分子生物学实验技术的相关内容。
一、基础实验技术在分子生物学研究中，藏龙卧虎的实验技术为实验的准确性和精细度提供了保障。
以下是分子生物学实验室常用技术的简介：1、聚合酶链式反应PCR技术是分子生物学重要的实验技术，通过PCR技术，能够将极少量的DNA 扩增为大量的DNA。
PCR在分子生物学中有广泛应用，包括基因片段的克隆、置换突变、基因型检测、DNA 测序等诸多方面。
PCR反应需要引物和DNA模板，引物和模板配合的合理性是PCR反应的关键。
PCR反应具体操作时需要根据引物的长度、Tm值、模板浓度、扩增片段长度等因素，进行优化以达到最佳扩增效果。
2、蛋白质电泳蛋白质电泳是一种分离蛋白质的技术，可按照分子质量和电荷分离其中的成分。
蛋白质电泳具体操作时比较复杂，核心是电泳样品的制备和电泳条件的设置。
电泳样品的制备主要包括电泳缓冲液的配制、蛋白质提取、样品准备、蛋白质定量和蛋白质加样。
电泳条件的设置主要包括电泳槽的填充、初始电压、电泳时间、gel浓度等。
3、核酸电泳核酸电泳是一种分离核酸的技术，通过电泳将带负电的DNA/RNA片段从电泳起点移向电极终点，达到分离纯化的目的。
关键是电泳实验条件的设置，包括电泳缓冲液的配制、电泳时间、电压、电泳gel浓度和transfer buffer浓度等。
4、原位杂交法原位杂交法是研究DNA 和RNA 相互作用的一种方法。
该方法能够定量测定DNA或RNA与特定基因的结合能力，从而实现特定基因的检测与鉴定。
原位杂交方法的操作步骤主要包括制备标记探针、制备样品、加标记探针、定性分析、定量分析等。
此方法具有灵敏度高，特异性强等优点。
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2006 年《分子生物学实验技术》实验内容RT-PCR（一）总 RNA的提取实验安排：每两人抽提一管。
为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。
操作步骤：TM（苯冰预冷的900μlLS -Biotragents液体样品加入 1.5ml Ep管中，再加入1、将100μ l 酚和异硫氰酸胍的混合物）。
2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。
3、加入200μl 氯仿，颠倒Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和10s。
4、在4℃条件下，以10000×g 离心15min。
5、将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。
6、在4℃条件下，以10000×g离心15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。
7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁。
8、将RNA 沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl 无RNase污染的水（RNase- FreeWater）将RNA 溶解并于-20℃保存。
注意事项：1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr 或更长时间。
2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC 水浸泡过夜。
3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr 以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm 滤膜过滤除菌。
4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。
二）反转录实验安排：每人做一管反应体系（20μ l）：按下列顺序加样μl4 5× Bufferμl6dNTPsμl1RNA 酶抑制剂μl1Oligo （dT）μ随机引μ反转录AMV1μ提取RNA6总体μ201h42反应条件：℃注意事项：反应体系中，应先1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。
如在一般的PCR 、引物，最后加酶和模板。
dNTPsBuffer 加水、、2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。
3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。
℃，以防酶失活。
4、酶类试剂应放置在冰盒上取用，用完后立即放回-20PCR（三）实验安排：每人做一管。
：按下列顺序加样μ l）反应体系（50ddHO 32.7 μl 2510×PCR Buffer μl4μldNTPs2P1 μl2μlP20.3Taqμl4cDNA template μlμl50Total反应程序：预变性94℃2min30s 变性94℃45s 退火50℃1min 延伸72℃30 cycles10min ℃ 72 终延伸PCR产物的检测：琼脂糖凝胶电泳TBE(10×)的配制：1、电泳缓冲液，定溶至1000ml。
，并加入称取Tris-base 54g，硼酸27.5g0.5M EDTA(pH8.0) 20ml 、1.5% 琼脂糖凝胶的配制：2加100ml，×琼脂糖于三角瓶中，加入10ml 10TBE 缓冲液，并加水定容至称取 1.5g，摇匀后倒入插有梳子的电泳槽，待其凝固后拔去梳子EB(10mg/ml) 热溶解后加入5μ l 即可用于电泳。
3、电泳检测：混合，加入到琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样μ l 产物5μl 与Loading Buffer 1 取PCR 电流进行电泳，约100V DL2000 DNA Marker 作对照，以电压，50mA 品孔旁加入 5 μ l 15min 后于紫外灯下观察结果。
注意事项：、EB有致癌性，电泳操作需戴手套进行。
1 的试污染的手套随意拿其它无EB、禁止将盛有2EB 的器皿随意乱放，且不要戴有EB 剂或仪器。
产物的纯化(四) PCR实验安排：Gel 产物合并后作为一管，用PCR 产物回收试剂盒( E.Z.N.A. 每两人的PCR DNA 。
)回收目的Extraction Kit操作步骤：琼脂糖凝胶电泳后，切下凝胶中含目的条带的胶粒，放入预先称好、1PCR产物经 1.5% 管中。
1.5ml Ep重量的空管放在电子天平上再次称重，计算胶粒的重量。
Ep、将装有胶粒的2．3、按1g胶加1ml的量加入Binding Buffer ，置于55℃－65℃水浴中约7min，其间要摇动Ep 管2－3 次，使胶粒完全溶解。
4、将上述溶胶液加入到HiBind spin -column 中，10000× g 离心1min ，弃去收集管中的液体。
5、加入300μl Binding Buffer ，10000×g 离心1min，弃去收集管中的液体。
6、加入750μl SPW Buffer，静置2min，10000×g 离心1min，弃去收集管中的液体。
7、重复步骤6。
8、空管10000×g 离心1min，以弃去DNA 回收柱中的残余液体。
9、将DNA 回收柱放入新的 1.5ml Ep 管中，并加入30μ l DNA Elution Buffer 至膜的中央，10000×g离心1min，以收集纯化的DNA ，经琼脂糖凝胶电泳检测后于－20℃保存。
注意事项：1、电泳时应换用新配制的TBE buffer，否则会由于电泳缓冲液pH 升高而降低DNA 的产量。
2、在切下含目的DNA 的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜(如一次性手套) ，使用无DNA 污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA 的污染。
3、切胶过程要尽可能短，防止DNA 在紫外线下长时间暴露引起突变，且要把含有目的DNA 的胶块尽可能小的切下，以利于后续步骤的进行。
4、DNA 的洗脱效率与Elution Buffer 的pH 有关，因此用ddHO 洗脱DNA 时，应调节2ddHO 的pH 值至8.0。
2二、基因的克隆（一） DNA片断与载体的连接本实验做PCR 回收产物与pMD-18T载体的连接，应用TaKaRa公司的试剂盒进行。
TA克隆原理：利用Taq酶能够在PCR产物的3'末端加上一个非模板依赖的A，而T 载体是一种带有3'T 突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR 产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中，主要用于PCR 产物的克隆和测序。
实验安排：每两人做一管。
反应体系（10μ l）：Ligation Solution I 5μlPCR 回收产物 4.5μlpMD -18T vector 0.5μlμl 10 总体积以上16℃ 4h 反应条件：（二）感受态细胞的制备实验安排：每人做一管。
试剂配制：：液体培养基（Luria-Bertani）、1LB 去800mlNaCl 10g，溶于称取蛋白胨（Tryptone） 10g，酵母提取物（Yeast extract） 5g，分钟。
高压下蒸气灭菌20 加去离子水至总体积1升,NaOH离子水中，用调pH 至7.5,溶液：、0.1mol/L CaCl22m0.22μ定容至100ml，高压灭菌或称取 1.11g CaCl （无水，分析纯），溶于超纯水中， 2 滤膜过滤除菌。
3、无菌甘油：100ml，高压灭菌即可。
取甘油（无菌操作）：操作步骤液体培养基中，2ml LBDH5 α的平板上挑取一个单菌落，接种于1、从生长有大肠杆菌振荡培养过夜，作为一级种子。
℃200r/min37 振荡培养200r/min℃ 50 比例无菌转接到5ml LB 液体培养基中，371: 2、将一级种子按0.5达到左右。
约2h-3h，至细菌的OD600 30min。
3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的 1.5ml Ep管中，冰浴，弃上清。
离心4000 r/min10min4、4℃ 。
－30min0.1mol/L CaCl、加入1ml 冰预冷的重悬沉淀，继续冰浴15min52 10min，弃上清。
℃ 4000 r/min 离心6、4 悬浮的感受态细胞可直接用轻轻重悬。
用冰预冷的0.1mol/L CaCl2007、沉淀中加入μ l2℃保存管，-70/10015%于转化，若要保存，则需加入无菌甘油至终浓度为，分装μ l 备用。
注意事项：1、细胞生长状态：不要用经过多次转接或储存于4℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中取适量在LB 固体培养基上划线培养，作为制备感受态细胞的菌种。
2、细胞生长密度：以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD 来控制。
6007OD 菌株的DH5 α个/ml 左右（不同菌株情况有所不同，细胞密度在5×10）为0.5600 时比较合适。
密度过高或不足均会影响感受态细胞的转化效率。
3、试剂的质量：所用的试剂，如CaCl 等均需是高纯度的（AR.），并用超纯水配制，最2好于-20℃分装保存。
（三）连接产物的转化实验安排：每人做一份。
试剂配制：1、氨苄青霉素（Ampicillin, Amp）母液：用灭菌的ddHO将氨苄青霉素粉配成100mg/ml 水溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌 2 后，置-20℃保存备用。
＋）：、LB 液体培养基（Amp2在LB 液体培养基中加入1μl 100mg/ml的氨苄青霉素母液后混匀即可，一般现配现用。
＋）：固体培养基（LBAmp 3、在LB 液体培养基中加入 1.5%的琼脂粉，15磅高压蒸气灭菌20min。
待培养基温度降至50℃左右，加入1μl 100mg/ml 的氨苄青霉素母液后，铺制平板。
待培养基凝固后，于4℃保存备用。
操作步骤：1、取-70℃冻存的感受态细胞于冰上融化后，加入连接产物5μl ，轻轻混匀，冰浴30min 。
2、42℃水浴热激90sec，再迅速放回冰上2min 。
3、加入400μl LB 液体培养基，37℃ 200r/min-220r/min 振荡培养45min 后，以恢复质粒的抗性。
4、4℃ 4000r/min 离心5min，弃去上清400μl ，将剩余的100μl 菌液混匀后涂氨苄平板，37℃培养30min（平皿正放），待菌液吸收完全，再将平皿倒置培养约12h－16h，至单菌落出现。
注意事项：1、质粒的浓度：转化效率与外源DNA 的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA 的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。
一般情况下，DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。
2、在感受态细胞中加入连接产物后应轻轻混匀，避免使细胞破裂。
3、同时应做两个对照，以检验氨苄青霉素的抗性和感受态细胞的质量。
对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液，其它操作同上，此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应没有菌落出现。
对照组2：以质粒代替DNA 溶液，其它操作同上，此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应出现大量菌落。