分子生物学实验技术实验内容

2006 年《分子生物学实验技术》实验内容

RT-PCR

（一）总 RNA的提取

实验安排：每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。

操作步骤：

TM（苯冰预冷的900μlLS -Biotragents液体样品加入 1.5ml Ep管中，再加入1、将100μ l 酚和异硫氰酸胍的混合物）。

2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。

3、加入200μl 氯仿，颠倒Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和10s。

4、在4℃条件下，以10000×g 离心15min。

5、将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。

6、在4℃条件下，以10000×g离心15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。

7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁。

8、将RNA 沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl 无RNase污染的水（RNase- Free

Water）将RNA 溶解并于-20℃保存。

注意事项：

1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr 或更长时间。

2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC 水浸泡过夜。

3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr 以上。然后用高压灭

菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水

配制，然后经0.22μm 滤膜过滤除菌。

4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。

二）反转录

实验安排：

每人做一管反应体系（20μ l）：按下列顺序加样

μl4 5× Buffer

μl6dNTPs

μl1RNA 酶抑制剂

μl1Oligo （dT）μ随机引

μ反转录AMV1

μ提取RNA6

总体μ20

1h

42反应条件：℃

注意事项：反应体系中，应先1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。如在一般的PCR 、引物，最后加酶和模板。dNTPsBuffer 加水、、2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。℃，以防酶失活。4、酶类试剂应放置在冰盒上取用，用完后立即放回-20

PCR

（三）实验安排：每人做一管。

：按下列顺序加样μ l）反应体系（50

ddHO 32.7 μl 2510×PCR Buffer μl

4μldNTPs

2P1 μl

2μlP2

0.3Taq

μl

4cDNA template μl

μl50Total

反应程序：

预变性94℃2min

30s 变性94℃

45s 退火50℃

1min 延伸72℃

30 cycles

10min ℃ 72 终延伸

PCR产物的检测：琼脂糖凝胶电泳TBE(10×)的配制：1、电泳缓冲液，定溶至1000ml。，并加入称取Tris-base 54g，硼酸27.5g0.5M EDTA(pH8.0) 20ml 、1.5% 琼脂糖凝胶的配制：2加100ml，×琼脂糖于三角瓶中，加入10ml 10TBE 缓冲液，并加水定容至称取 1.5g，摇匀后倒入插有梳子的电泳槽，待其凝固后拔去梳子EB(10mg/ml) 热溶解后加入5μ l 即可用于电泳。3、电泳检测：混合，加入到琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样μ l 产物5μl 与Loading Buffer 1 取PCR 电流进行电泳，约100V DL2000 DNA Marker 作对照，以电压，50mA 品孔旁加入 5 μ l 15min 后于紫外灯下观察结果。

注意事项：、EB有致癌性，电泳操作需戴手套进行。 1 的试污染的手套随意拿其它无EB、禁止将盛有2EB 的器皿随意乱放，且不要戴有EB 剂或仪器。

产物的纯化(四) PCR实验安排：Gel 产物合并后作为一管，用PCR 产物回

收试剂盒( E.Z.N.A. 每两人的PCR DNA 。)回收目的Extraction Kit

操作步骤：琼脂糖凝胶电泳后，切下凝胶中含目的条带的胶粒，放入预先称好、1PCR产物经 1.5% 管中。1.5ml Ep重量的空管放在电子天平上再次称重，计算胶粒的重量。Ep、将装有胶粒的2．

3、按1g胶加1ml的量加入Binding Buffer ，置于55℃－65℃水浴中约7min，其间要摇动Ep 管2－3 次，使胶粒完全溶解。

4、将上述溶胶液加入到HiBind spin -column 中，10000× g 离心1min ，弃去收集管中的液体。

5、加入300μl Binding Buffer ，10000×g 离心1min，弃去收集管中的液体。

6、加入750μl SPW Buffer，静置2min，10000×g 离心1min，弃去收集管中的液体。

7、重复步骤6。

8、空管10000×g 离心1min，以弃去DNA 回收柱中的残余液体。

9、将DNA 回收柱放入新的 1.5ml Ep 管中，并加入30μ l DNA Elution Buffer 至膜的中央，10000×g离心1min，以收集纯化的DNA ，经琼脂糖凝胶电泳检测后于－20℃保存。

注意事项：

1、电泳时应换用新配制的TBE buffer，否则会由于电泳缓冲液pH 升高而降低DNA 的产量。

2、在切下含目的DNA 的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜(如一次性手套) ，使用无DNA 污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA 的污染。

3、切胶过程要尽可能短，防止DNA 在紫外线下长时间暴露引起突变，且要把含有目的DNA 的胶块尽可能小的切下，以利于后续步骤的进行。

4、DNA 的洗脱效率与Elution Buffer 的pH 有关，因此用ddHO 洗脱DNA 时，应调节2ddHO 的pH 值至8.0。2

二、基因的克隆

（一） DNA片断与载体的连接

本实验做PCR 回收产物与pMD-18T载体的连接，应用TaKaRa公司的试剂盒进行。