激光共聚焦显微镜样品制备
激光共聚焦显微镜样品制备方法讲解
电子显微学报J.Chin.Eleetr.Microse.Soc.第29卷图I气体CO:冷冻装置。
Fig.1Gas C02frozen equipment.镜下操作后,置于干冰上(临时无干冰,也可置于一80℃冰箱,待冷冻完全后,将样品移至冷冻切片机中,温度平衡后,将样品从冷冻包埋模具中取出,进行冷冻切片。
冷冻包埋模具见图2。
图2冷冻包埋模具。
Fig.2Frozen embedding mold.液氮冷冻法:成年小鼠和大鼠的脑及稍大一些的组织块也可采用此方法冷冻。
将组织块置于样品台的OCT中,为防止组织块爆裂,先在液氮中迅速浸提几次,时间从1s开始逐渐增加,直至样品温度与液氮温度平衡,之后移至冷冻切片机中,使温度与切片机箱体温度一致,进行冷冻切片。
直接冷冻法:将样品直接粘着在涂有OCT的样品台上,于冷冻切片机(箱体温度在一20℃以下中直接冷冻。
3冷冻组织切片的免疫荧光标记将冷冻组织切片从一80℃冰箱中取出,室温放置10min,待切片回温并干燥,浸于PBS中10min 洗去OCT,可以无需Triton处理,即可进行免疫荧光抗体标记,操作步骤与培养细胞反应方法相同口]。
反应在避光湿盒中进行,反应结束时用无荧光封固剂封片,4oC保存。
先用荧光显微镜观察,确认标记成功,移至激光共聚焦显微镜扫描成像。
4荧光染料及荧光蛋白传统应用于荧光标记的染料如异硫氰酸荧光素(fluoreseinisothiocyanate,FITC,ex490nm/em520 nm、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC,ex550nm//em 620am、罗丹明(Rhodamine,ex560nm/em540~ 660nnl、四甲基罗丹明(tetramethyl rhodamine, TMR,ex570nm/em595—600nm、德克萨斯红(Texas red,ex592nm/em610rim、氨甲基香豆素(Aminomethylcoumarin aceticacid,AMCA,ex345 nm/em425am等,结合激光共聚焦显微镜技术的发展,这些经典的荧光染料逐渐被层出不穷的新的荧光染料所替代。
激光扫描共聚焦显微镜操作流程详解
激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope)激光扫描共聚焦显微镜(laser sea nning con focal microscope)，英文简写LSCM，俗称con focal。
LSCM是一种高科技显微镜，属于最先进的细胞生物学分析仪器。
我们学院使用的是瑞士徕卡公司(Leica)的TCS SP5型号的LSCM。
使用流程1、登陆或5号楼606室公用电脑下载?激光共聚焦预约使用审核表?，打印并填写。
2、联系卢剑清(手机：)审核并签名。
3、持已签名的?激光共聚焦预约使用审核表? 至5号楼610室预约使用时间，及领取钥匙，联系人：窦凯飞(手机：。
4、在熟练使用者的指导下，进行实验。
5、实验结束，及时归还钥匙。
仪器构造和原理LSCM的根本结构主要包括荧光显微镜系统及样品台、激光发射器、扫描器、检测器、图像存储处理和输出设备、计算机控制系统。
激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源，普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。
而LSCM以激光为光源，激光具有单色性强、方向性好、高亮度、相干性好等优点,可以防止普通显微镜的缺点。
一般常用的气体激光器如氩(Ar)、氪(Kr)、氦(He)、氖(Ne)。
illu min ati ng pin hole (照明针孔)：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。
且与detector pinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。
分光镜(BeamSplitter)：点光源发出的光经分光镜反射后，通过物镜在样品聚焦。
对标本内焦平面上的每一点进行扫描，Focal plane (焦平面)：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。
该光斑经过物镜和分光镜等一系列装置的处理，分别在照明针孔及探测针孔两处聚焦。
激光共聚焦显微镜原理
LSCM的优越性
动态连续扫描及三维图像重组 LSCM可以对对活细胞和
组织或细胞切片样品的不同层面进行连续逐层扫描, 来获得各个 层面的图像，即所谓的“无损伤的光学切片”。激光扫描共聚 焦显微镜扫描的每个层面之间的间距可以达到0.1um甚至更小。 获得的图像通过计算机重组，可获得精细的细胞骨架、染色体、 细胞器和细胞膜系统的三维图像。与普通光学显微镜获得的图 像相比，LSCM所得 到的重组三维图像清晰度高、立体感强, 可通过计算机软件对细胞内所研究的结构进行各种测量，对细 胞内的空间结构和某些物质在细胞内的定位方面的研究中有广 泛的应用。
发展历史
1957年，Malwin Minsky在其专利中首次阐明了激光共聚焦显微镜技 术的基本工作原理， 1967年，Egger第一次成功能共聚焦显微镜产生了一个光学横断面， 1970年，Sheppard和Wilson 推出第一台单光束共聚集激光扫描显微 镜 1987年，White 和Amos在Nature杂志发表了“Confocal microscopy come of age”,标志着LSCM已成为科学研究的重要工具。
普通荧光显微镜和激光共聚焦显微镜图像的差别
激光共聚焦显微镜的基本原理
利用放置在光源后的照明针孔 (P1)和放置在检测器前的探测针 孔(P2)实现点照明和点探测；激 光经过照明针孔形成点光源， 由物镜聚焦在样品焦面的某个 点上，只有该点所发射 的荧光 成像在探测针孔上，该点以外 的任何发射光线被探测器阻挡， 不能到达PMT探测器，从而提 高了成像效果。照明针孔和探 测针孔 共焦，共焦点为被探测 点，被探测点所在的平面为共 焦平面。
计算机系统
数据采集、处理、转换、应用软件
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共焦显微镜是在传统光学显微镜的基础上，利用激光作为光源，采用共轭聚焦原理和装置，通过计算机对被观察物体进行数字图像处理的一套观察、分析和输出系统。
光学成像的分辨率提高了30%～40%。
荧光探针被紫外线或可见光激发，以获得细胞或组织内部微观结构的荧光图像。
在亚细胞水平上观察生理信号和细胞形态的变化。
它已成为形态学、分子生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域的新一代研究工具。
1激光扫描共聚焦显微镜（lscm）的原理就基本原理而言，共焦显微镜是一种现代光学显微镜。
对普通光学显微镜进行了以下技术改进：1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。
1.2利用共焦技术，在物镜的焦平面上放置一个带小孔的挡板，以阻挡焦平面外的杂散光，消除球差；并进一步消除色差1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。
而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。
这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1.4用计算机采集和处理光信号，用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。
而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。
由于综合利用了以上技术。
可以说ｌｓｃｍ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。
2lscm在生物医学研究中的应用目前,一台配置完备的ｌｓｃｍ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ｐｈ、微分干涉差显微镜(ｄｉｃ等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
激光共聚焦显微镜样品制备方法_一_细胞培养样品
第29卷第2期2010年4月电子显微学报Journal of Chinese Electron Microscopy SocietyVol-29，No.22010-04文章编号：1000-6281（2010）02-0185-04激光共聚焦显微镜样品制备方法（一）———细胞培养样品余礼厚（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海200031）摘要：随着激光共聚焦显微镜在生物学研究中的广泛应用，绿色荧光融合蛋白能够提供蛋白质在细胞体内的精确时空信息。
因此免疫荧光样品的制备也成为基本的细胞生物学实验方法。
本文主要介绍在培养细胞中表达绿色荧光融合蛋白及免疫荧光样品的制备过程。
关键词：绿色荧光蛋白；细胞培养；免疫荧光；激光共聚焦显微镜中图分类号：Q336文献标识码：A收稿日期：2010-03-20作者简介：余礼厚（1982－），男（汉族），四川自贡人，博士，E-mail ：lhyu@.随着生物学研究的不断深入，越来越多的研究要求在细胞体内（in vivo ），甚至是动物体水平上研究蛋白质功能或动态变化。
而随着检测设备的提升、各种显微技术的发展和标记手段的提高，使得研究者能够迅速、准确地观察到蛋白质在细胞内的表达情况和定位。
通过激光共聚焦显微镜观察荧光标记细胞内的蛋白质和分子，为生物学的研究提供了更直观的观测手段。
因此免疫荧光样品的制备也成为生物学研究中的基本技术方法。
鉴于生物体内的复杂多样性，制备免疫荧光样品的方法也存在一些差异。
本文主要介绍构建绿色荧光融合蛋白表达载体，并在培养细胞中表达绿色荧光融合蛋白及免疫荧光样品的制备过程。
1绿色荧光融合蛋白表达载体的构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein ，GFP ）及其突变体能在各种不同的生物系统中表达，这对细胞生物学的研究具有重要意义［1］。
而荧光蛋白的折叠能力及其同细胞内蛋白的融合能力，使研究者能直接在细胞体内观察到蛋白质的特性。
激光共聚焦显微镜样品制备方法_二_组织切片样品_边玮
第29卷第4期2010年8月电子显微学报Journal of Chinese Electron Microscopy SocietyVol.29，No.42010-08文章编号：1000-6281（2010）04-0399-04激光共聚焦显微镜样品制备方法（二）———组织切片样品边玮（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海200031）摘要：应用激光共聚焦显微镜技术对荧光标记的组织切片样品进行三维观察成像是生物学研究的常规手段。
本文主要介绍实验室制备用于激光共聚焦显微镜成像的冷冻组织切片及免疫荧光标记过程。
关键词：冷冻组织切片；免疫荧光；激光共聚焦显微镜成像中图分类号：Q336；TG115.21+5.3文献标识码：A收稿日期：2010-05-07作者简介：边玮（1964－），女（汉族），吉林蛟河人，高级工程师.E-mail ：weibian@.应用于激光共聚焦显微镜的组织切片样品多采用冷冻组织切片，可尽量保持组织样品的抗原活性。
组织采集后，经固定、冷冻包埋、冷冻切片、晾片，进行免疫荧光抗体标记。
1组织的采集、固定和保存不同来源的组织可依据实验条件和实验目的而采用不同的固定和保存方法。
实验室通常采用液氮冷冻法和多聚甲醛（PFA ）固定法。
液氮冷冻法：采取新鲜组织后，即可放入液氮中保存。
多聚甲醛固定法：小鼠、大鼠等实验动物经生理盐水和4%PFA 灌流，采取组织，组织块尽量小于1cm ˑ1cm ˑ1cm ，置于4%PFA 中进行后固定，后固定的时间可根据组织块的大小和致密程度而调整，可以4ħ固定过夜，或室温1 4h 。
之后，用0.01mol /L PBS 缓冲液洗3次，每次10 30min 。
在20%蔗糖中4ħ浸泡1h 以上，待组织块下沉后，即可进行冷冻切片。
组织块可置于4ħ冰箱保存于20%蔗糖（含0.05%NaN 3）中，一个月内完成切片。
表达荧光蛋白的实验动物组织，可遵循以上方法处理样品。
共聚焦原理及操作
一、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。
Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA，能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合，与EGTA 不同的是Fura-2可发出荧光，并且结合Ca2+后荧光特性有改变，Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm和340 nm，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。
Fura-2为一极性很大的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。
后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2，与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。
并且，Fura-2与Ca2+解离容易，随着游离Ca2+的增加或减少，其荧光强度便随之变化。
因此，Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系，据此可以测定[Ca2+]i及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。
Fluo-3/AM是继Fura-2/AM等之后研制的新一代Ca2+ 荧光指示剂，与Fura-2/AM类似，Fluo-3/AM进入细胞后，酯基被水解掉，Fluo-3与细胞内游离Ca2+ 结合，因而其荧光强度可以反映细胞内游离Ca2+ 的浓度。
但优于Fura-2/AM的是，Fluo-3与Ca2+ 结合时的荧光强度较未结合Ca2+ 的游离形式高40 ~ 100倍，避免了自发荧光的干扰，因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映[Ca2+]i的变化。
此外，Fluo-3与Ca2+ 亲和力低，易解离，适合测定细胞内Ca2+ 的快速、微量变化。
Fluo-3 在可见光光谱激发，激发波长为488 nm，可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers, R., et al., 1996)。
激光共聚焦制样
非损伤性导入法：在正常的生理条件下加入Ca2+荧光探针与植物细胞共同孵育, 使探针渗入到细胞内的方法。
在培养液中加人荧光探针和增强膜透性的药物, 如去垢剂digitonin(毛地黄甘)、表面活性剂Pluronic F-127等, 药物使细胞膜通透性增强, 利于荧光探针的导入【1】。
周平等发现：在PH5.6条件下，绿豆、花生、水稻、烟草等细胞原生质体用5~10um ol/L Indo-1-K+或Fura-2-AM共同孵育1.5h,荧光探针可导入部分原生质体【2】。
样品的制备1：样品制备是上机检测前的关键步骤。
样品需经荧光探剂标记( 单标、双标、三标) 。
标本可以是固定的或活的组织, 也可以是固定的或活的贴壁培养, 细胞应培养在Confocal 专用小培养皿或盖玻片上, 悬浮细胞, 甩片或滴片后, 用盖玻片封片。
样品的最大厚度约1~ 2 mm, 使用的盖玻片厚度应小于0117mm, 载玻片厚度应在018~ 112 mm 之间, 而且表面光洁, 厚度均匀, 没有明显的干扰荧光。
固定样品常用封片剂进行封片,常用PH815- 9 的PBS 配制的甘油封片。
样品准备2：样品的最大厚度大约1~2mm(10×/ 0.4 物镜), 它取决于物镜的数值孔径(NA) 、物镜的工作距离、激光的穿透力以及样品的透明度。
一般要求是单层贴壁细胞, 可以是经荧光探针标记(单标、双标、三标)固定的或活的组织; 固定的或活的贴壁培养细胞(Confocal 专用小培养皿, 盖玻片); 用盖玻片封片的经甩片或滴片后的悬浮细胞。
对于非贴壁细胞的粘贴, 一般常用的粘贴剂有多聚赖氨酸﹑伴刀豆球蛋白﹑cell- tak﹑vectabond﹑琼脂凝胶等。
选择粘贴剂的标准是: 不影响实验目的, 对标本无损害[1]。
激光扫描共聚焦显微镜的样品制备技术3：3.1 取材组织标本：包括活检标本、手术切除标本、动物模型标本及尸检解剖标本等，应在标本离体后立即冰冻切片或贮存于-70℃冰箱备用，以充分保存组织的抗原性。
激光共聚焦拉曼显微镜检测标准
激光共聚焦拉曼显微镜检测标准在现代科学研究中，激光共聚焦拉曼显微镜（以下简称激光拉曼显微镜）已经成为一种常用的分析工具。
激光拉曼显微镜通过激发样品中的化学键振动，可以获得关于样品成分、结构和性质的信息，具有高灵敏度和高分辨率的特点。
然而，由于激光拉曼技术的复杂性和多样性，制定相应的检测标准显得尤为重要。
1. 激光拉曼技术的基本原理激光拉曼技术是一种非破坏性的光谱分析方法，通过使用激光和光谱仪来探测样品的分子振动信息。
当激光与样品相互作用时，部分光子被散射，而其余光子则会发生拉曼散射，从而获得特定频率的振动能级信息。
激光拉曼显微镜结合了共聚焦技术，可以实现光学显微镜和拉曼光谱仪的双重功能，不仅能够获得高分辨率的成像，还可以获得高灵敏度的拉曼光谱信息。
2. 制定激光拉曼显微镜检测标准的重要性由于激光拉曼技术的复杂性和多样性，制定相应的检测标准变得至关重要。
标准化的检测流程和方法可以保证实验数据的可靠性和准确性，同时也有利于不同实验室和研究机构之间的结果比对和交流。
制定检测标准还可以促进技术的进步和应用的普及，推动激光拉曼技术在不同领域的应用。
3. 激光拉曼显微镜检测标准的制定内容激光拉曼显微镜检测标准应包括样品制备、仪器校准、数据采集和分析等多个方面。
在样品制备方面，应该明确样品的准备方法、存放条件和处理步骤，以确保实验的可重复性和可比性。
仪器校准也是非常重要的环节，需要制定相应的校准方法和标准物质，以保证激光拉曼仪器的准确性和稳定性。
对于数据采集和分析，应该规定数据的采集参数、处理方法和结果解释的标准流程，以确保实验结果的可靠性和准确性。
4. 个人观点和总结在我看来，制定激光拉曼显微镜检测标准是非常必要的，可以保证激光拉曼技术在科研领域的可靠性和准确性。
我认为，在制定标准的过程中，应该充分考虑实际应用的需求和特点，同时也应该借鉴国际标准和先进经验，以期制定出通用、实用和可操作的检测标准。
激光共聚焦拉曼显微镜检测标准的制定对于推动该技术在不同领域的应用具有重要意义。
激光扫描共聚焦显微镜-仪器百科
一、激光扫描共聚焦显微镜简介激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，简称CLSM）是近代生物医学图像仪器。
它是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针。
利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。
二、激光扫描共聚焦显微镜原理在普通宽视野光学显微镜中，整个标本全部都被水银弧光灯或氙灯的光线照明，图像可以用肉眼直接观察。
同时，来自焦点以外的其他区域的荧光对结构的干扰较大，尤其是标本的厚度在2um以上时，其影响更为明显。
激光共聚焦显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描。
组织样品中如果有可被激发的荧光物质，受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管（PMT）探测收集，并将信号输送到计算机，处理后在计算机显示器上显示图像。
在这个光路中，只有在焦平面的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不能通过小孔。
因此，非观察点的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。
由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔与探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦。
以激光作光源并对样品进行扫描，在此过程中两次聚焦，故称为激光扫描共聚焦显微镜。
三、激光扫描共焦显微镜的优点1.动态连续扫描及三维图像重组。
LSCM可以对对活细胞和组织或细胞切片样品的不同层面进行连续逐层扫描,来获得各个层面的图像，即所谓的“无损伤的光学切片”。
激光扫描共聚焦显微镜扫描的每个层面之间的间距可以达到0.1um甚至更小。
获得的图像通过计算机重组，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。
激光共聚焦显微镜样品制备
激光共聚焦显微镜样品制备激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率、高对比度的显微镜。
它采用了激光光源和共聚合焦系统，可以获得非常清晰的三维显微图像。
这种显微镜主要应用于生物学、药学和材料科学等领域，并且被广泛用于细胞和组织病理学研究，以及纳米材料表征等方面。
首先，样品制备的第一步通常是固定。
固定是指将样品中的细胞或组织固定在特定的位置和形态上，使其保持原有的结构和功能。
最常用的细胞固定方法是使用乙醛或甲醛进行化学固定。
这些化学试剂可以使细胞中的蛋白质交联并固定，保持细胞的形态和结构。
对于组织样本，常用的固定方法是将其浸泡在缓冲福尔马林中，然后进行脱水和浸渍。
然后，经过固定的样品通常需要进行处理和染色。
处理包括去除不需要的物质，如脂肪和胆固醇等。
通常使用洗涤剂，如Tween 20或Triton X-100来帮助去除这些物质。
染色是为了增强对细胞或组织的观察，通常使用DNA染料，如荧光素和硫醇葡萄糖等。
这些染料可以与DNA结合，形成荧光信号，从而使细胞核和染色体能够清晰可见。
接下来，样品需要进行脱水和包埋。
脱水是为了将样品中的水分逐渐去除，从而使其适应显微镜对环境要求。
这通常通过逐渐加入浓度递增的乙醇溶液来实现。
包埋是将样品固定在透明块中，以便于显微观察。
常用的包埋介质有琼脂和覆盖玻璃等。
总结起来，激光共聚焦显微镜样品制备是一项复杂的工作。
它需要对样品进行固定、处理、染色、脱水、包埋等一系列步骤，以便获得高质量的成像结果。
正确选择和操作样品制备方法是确保显微镜成像质量和结果准确性的关键。
因此，在进行激光共聚焦显微镜样品制备时，科研人员和实验室人员应该仔细参考上述步骤和技巧，以获得理想的实验结果。
激光共聚焦显微镜用法
激光共聚焦显微镜用法
激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM）是一种高分辨率的显微镜，其能够通过激光束在样品表面扫描，获得高分辨率的三维图像。
以下是激光共聚焦显微镜的使用方法：
1. 样品制备：将样品制备好，并固定在载玻片或载片上，以便于放入显微镜中观察。
2. 调整显微镜：将载玻片或载片放入显微镜中，调整激光聚焦点的位置和大小，以便于观察样品的细节。
3. 设置参数：根据样品的性质和需要观察的结构，设置激光功率、扫描速度、探测器增益等参数，以获得最佳的成像效果。
4. 开始扫描：启动激光扫描仪，将激光束在样品表面扫描，获得高分辨率的三维图像。
5. 分析数据：通过软件对获得的图像进行处理和分析，以获得更详细的信息和结构。
6. 结果展示：将处理后的图像进行展示和分析，以便于研究人员对样品进行更深入的了解和研究。
总之，激光共聚焦显微镜是一种高分辨率的显微镜，其能够帮助研究人员观察和研究样品的细节和结构，为生物医学研究和材料科学研究提供了强有力的工具。
激光共聚焦样品制备步骤
激光共聚焦使用步骤总结共聚焦实验步骤1.提前将PBS放在37度水浴锅中。
2.将小皿从细胞培养箱中取出，弃掉培养液，用PBS洗2——3次，轻晃几下即可。
注，此步加PBS时一定要轻一点，否则细胞会漂浮起来。
3.弃掉PBS后加1ml 4%多聚甲醛，固定细胞，室温静置30min。
4.弃掉后加PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃。
5.弃掉后加0.1%Triton-X100 1ml，室温透膜静置15min。
6.弃掉后加PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃。
7. 5%PBS脱脂乳，封闭1h，可在摇床上轻晃，也可以室温静置。
8.一抗1h，可在摇床上轻晃。
9. PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃10.二抗1h。
避光可在摇床上轻晃11. PBS，1ml，3次，5min/次避光，可在摇床上轻晃12.DAPI染色15min避光，室温静置13. PBS，1ml，3次，5min/次，避光，可在摇床上轻晃14.激光共聚焦显微镜观察。
激光共聚焦显微镜使用步骤1.打开五个绿色按钮和一个钥匙2.将物镜调至最低点。
3.电脑开启，选择TCS_User4.双击LAS AF 注意，双击软件后就耐心等待不要碰显微镜上任何东西，此时系统正在校准数据。
5.点击OK6.选择configuration7.点击像“注射器”一样的图案Laser，此时后便会出现一个画面，四个小格405 Diode，Ardon，HeNe543，HeNe633和一个尺子一样的长线Stand by。
8.点击选择前三个小格405 Diode，Ardon，HeNe543，将Stand by拉到45左右。
9.选择Acquire10.先确定右侧区域油镜型号是Objective：63×1.4，如果不是点击下拉菜单选择。
11.选择seq，最下面会弹出Sequential Scan区域，该区域作用是根据自己实验需求选择相应激光通道，其中“＋”代表增加激光通道，“－”代表删除激光通道。
激光共聚焦样品制备步骤
激光共聚焦使用步骤总结共聚焦实验步骤1.提前将PBS放在37度水浴锅中。
2.将小皿从细胞培养箱中取出，弃掉培养液，用PBS洗2——3次，轻晃几下即可。
注，此步加PBS时一定要轻一点，否则细胞会漂浮起来。
3.弃掉PBS后加1ml 4%多聚甲醛，固定细胞，室温静置30min。
4.弃掉后加PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃。
5.弃掉后加0.1%Triton-X100 1ml，室温透膜静置15min。
6.弃掉后加PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃。
7. 5%PBS脱脂乳，封闭1h，可在摇床上轻晃，也可以室温静置。
8.一抗1h，可在摇床上轻晃。
9. PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃10.二抗1h。
避光可在摇床上轻晃11. PBS，1ml，3次，5min/次避光，可在摇床上轻晃12.DAPI染色15min避光，室温静置13. PBS，1ml，3次，5min/次，避光，可在摇床上轻晃14.激光共聚焦显微镜观察。
激光共聚焦显微镜使用步骤1.打开五个绿色按钮和一个钥匙2.将物镜调至最低点。
3.电脑开启，选择TCS_User4.双击LAS AF 注意，双击软件后就耐心等待不要碰显微镜上任何东西，此时系统正在校准数据。
5.点击OK6.选择configuration7.点击像“注射器”一样的图案Laser，此时后便会出现一个画面，四个小格405 Diode，Ardon，HeNe543，HeNe633和一个尺子一样的长线Stand by。
8.点击选择前三个小格405 Diode，Ardon，HeNe543，将Stand by拉到45左右。
9.选择Acquire10.先确定右侧区域油镜型号是Objective：63×1.4，如果不是点击下拉菜单选择。
11.选择seq，最下面会弹出Sequential Scan区域，该区域作用是根据自己实验需求选择相应激光通道，其中“＋”代表增加激光通道，“－”代表删除激光通道。
激光共聚焦样品制备步骤
激光共聚焦样品制备步骤激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy，简称LSM）是一种高分辨率的光学显微技术，广泛应用于细胞和组织的研究领域。
在进行激光共聚焦样品制备之前，需要确保实验环境干净整洁，仪器设备正常运行。
下面是激光共聚焦样品制备的一般步骤。
1.样品准备：选择合适的细胞或组织样品。
可以使用活体细胞、培养细胞、切片等多种样品。
样品应该具备较好的生物活性和显微结构。
2.样品固定：为了保持样品的形态和结构，需要进行样品的固定处理。
根据不同的样品类型和研究目的，可以选择适合的固定方法，如甲醛、乙醇、冰醋酸、戊醛等。
3.渗透处理：有些样品在固定后会出现浸泡不透的情况，需要进行渗透处理，使固定液更好地渗透进入样品中。
常用的渗透处理方法有冷冻冰醋酸渗透、冷冻减压渗透、甘油渗透等。
4.包埋：将处理好的样品包埋到透明的固定剂中，以保持形态和结构。
常用的包埋材料有琼脂糖、明胶、聚乙二醇、树脂等。
包埋时要注意使样品均匀分布在包埋剂中，以免出现偏移或扭曲。
5.切片：将包埋好的样品切割成适当的厚度，通常为几十微米至几百微米。
切片的方法有冰刀切片、冷冻切片、石蜡切片等。
切片时需保持样品的完整性和结构。
6.平片处理：将切好的样品平片放在载玻片上，用适当的方法将其固定在玻片上。
常用的固定方法有热熔、冷冻、电荷吸附等。
固定后要确保样品牢固地固定在玻片上并保持平坦。
7.染色：根据需要，可以对样品进行染色增强显微镜观察的效果。
常用的染色方法有荧光染色、荧光蛋白标记、核酸染色等。
8.抗体处理：对于需要检测其中一种特定蛋白质的样品，可以使用特异性抗体进行处理，以增强该蛋白质的信号。
9.清洗：处理完样品后，要对样品进行适当的清洗，去除余留的固定剂、染色剂等。
10.封片：将处理好的样品加入封片介质，如卡宾胶、密封剂等，以减少光透射损失和防止样品变干。
11.显微镜观察：将制备好的样品放入激光共聚焦显微镜中，调整焦距和曝光时间，进行观察和拍摄。
激光扫描共聚焦显微镜的制作流程
本技术涉及一种激光扫描共聚焦显微镜，在激光扫描共聚焦显微镜的载物台加入加热装置；在激光扫描共聚焦显微镜的物镜和样平台之间加入测温装置和红外检测器；在激光扫描共聚焦显微镜的计算机系统加入热图像处理软件。
本技术所涉及的新型检测表征技术：（1）可以研究材料微观形貌。
（2）运用杂质或掺杂相的激发荧光直观观察其大范围内的分布情况。
（3）捕捉荧光，动态跟踪。
（4）经系统经多次调焦，获得不同深度的图像，经计算机处理可对样品进行三维成像。
（5）可同时动态研究各种材料在温度改变时的传热传质过程，由此可建立材料相变的热力学与动力学机制。
技术要求1.一种激光扫描共聚焦显微镜，其特征在于，激光扫描共聚焦显微镜的载物台设有加热装置；所述激光扫描共聚焦显微镜的物镜与载物台之间设置测温装置和红外检测器；所述激光扫描共聚焦显微镜的计算机系统中设有热图像处理软件，所述红外检测器与计算机系统连接。
2.根据权利要求1所述的一种激光扫描共聚焦显微镜，其特征在于，所述加热装置为载物台下方的加热线圈。
说明书一种激光扫描共聚焦显微镜技术领域本技术涉及一种新型的材料样品的分析表征装置，具体涉及一种激光扫描共聚焦显微镜，属材料表征技术领域。
背景技术当前材料样品表面或界面微观形貌表征的主要手段有扫描电子显微镜（SEM），原子力显微镜（AFM），透射电子显微镜（TEM）等：SEM无法测试含水样品，对于一些微小（粒径 <1nm）杂质或掺杂相必须要提高倍率，放大倍数的提高造成视场的减小，故无法在较大的区域（约1mm×1mm）内直观观察微小杂质或掺杂相的分布情况；AFM难易判断出杂相；TEM对样品的要求很高，制样困难，而且与SEM一样，无法在较大的区域内直观观察微小杂质或掺杂相的分布情况。
当前材料样品成分的无损测试手段有X射线衍射（XRD），扫描电子显微镜中加入的能谱仪（EDS）或波谱仪（WDS）等：XRD对于微区特定相或者含量较小的相无能为力；EDS或WDS只能获得元素相对含量，无法判断相类型（如只能知道Ti与O之比为1:2，但是金红石还是锐钛矿却无法判断），且对于空洞内部的成分也无能为力。
激光扫描共聚焦显微镜(研究生)
2）细胞膜用 NBDPC染色（绿），
3）线粒体用 Mitotracker标记 （红）
如何改善图像质量
1、“更多信号！”
1）、 通过减慢扫描速度 2）、 使用“平均”方法 3）、 增加发射滤镜的带宽 4）、 加大针孔直径； 注意：光学切片的厚度也会相应地增大。 5）、 增大激发能（激光功率）； 注意：漂白效应、饱和效应和光毒效应。
2、“更多细节！”
1）、使用较高数值孔径 (NA) 的物镜 2）、增加“帧大小” = 每条线的像素值 + 每帧的线条数 3）、优化扫描焦距 (Z) 4）、增加动态范围
3、“更可靠！”
1）、使用多轨 2）、提供预定义配置。 3）、可同时定义和使用任何形状的多个研 究区。
Cultured cells, multiple fluorescence
原理 优缺点
激光共聚焦显微镜的基本结构
扫描系统
（1）、激光扫描系统通过照相通道或荧光通道和显微 镜相连，与所接显微镜一体化设计
（2）、检测器数量 （3）、共聚焦针孔
50-300微米
（4）、扫描分辨率及灰度级
（5）、连续分光设计系统（或其它光谱分离系统）
（6）、光谱扫描功能 （7）、扫描速度及速度调节
1）蛋白质、单糖和多糖探针； 2）细胞器探针； 3）核酸探针； 4）细胞活性探针； 5）膜和受体探针； 6）细胞膜电位和细胞内pH探针； 7）金属探针； 8）分子的特殊基团结合探针； 9）其他
（三）仪器使用步骤
（1）、选择激光器类型 （2）、选择相应的滤片 （3）、根据实验目的选择适当软件 （4）、按软件要求设置有关参数，进行观 察和分析。
仪器名称
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细胞环境，成份和化学物质的荧光染料
染色/区分活和死细胞 细胞成份染料 （线粒体，溶酶体，内质网和Golgi体） 核酸染料（如：DAPI, Hoechst, BO-PRO, POPO） 离子敏感性染料（Ca2+, Mn2+, Zn2+, Na+, K+, Cl-） 膜电位敏感染料（罗丹明123）
B: Immunostaining against endosomal marker EEA1, cy5-conjugated secondary ab
S. Arnold 10/2002
转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA 与转染试
剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE 右旋糖 苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表：
Alexa 568 DsRed Rhodamine Texas Red DiD
DiI
Organelle markers
PI
Hoechst 33258
PI
DAPI
MitoTracker
Anti-Calnexin
ER
Phalloidin
GM-130
Actin
EEA1
LysoTracker Tubulin
荧光染料
Atto and Tracy (Sigma Aldrich) Alexa Fluor (Invitrogen) BODIPY (Invitrogen) Cy-dyes FluoProbes (Interchim) DyLight Fluor (Thermo Scientific, Pierce) DY and MegaStokes Dyes (Dyomics) Sulfo Cy dyes (CYANDYE, LLC)
荧光蛋白
The FP beach
R.Tsien 2009 Nobel lecture
Page 21
荧光蛋白主要应用
1. 活细胞中的某种蛋白进行准确定位及动态观察 2. 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中或外界 刺激因子的作用下的时空表达, 如某种转录因子的核转位、蛋白激酶C 的膜转位等。 3. GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察该分泌蛋白 分泌到细胞外的过程
[Ca2+]= Kd* Q*(R-Rmin)/(Rmax-R) - R represents the fluorescence intensity ratio F lambda 1 /F lambda 2 in which lambda 1 (~340 nm) and lambda 2 (~380 nm) - Q is the ratio of F min to F max at lambda 2 (~380 nm) - Kd is the Ca 2+ dissociation constant of the indicator D.J. Linden, Purkinje neuron
30
细胞骨架F-actin（F-肌动蛋白）染色：
用FITC或Rhodamine标记的Phalloidin（鬼笔环肽）
膜电位探针
罗丹明123染细胞线粒体（双氢罗丹明123：10uM/ml）： 10ug/ml，室温，15分钟。Ex/Em: 511/534（488/BP505-530） 为膜电荷性染料，对活细胞，能特异与细胞中的线粒体膜结合，产生荧光。 反应线粒体功能。 死细胞无显色。
Ratiometric Ca Indicators Fura-2 Fura-6F Fura Red Indo-1 Indo-5F Mag-indo-1
2+
Mode Ex 340/380 Ex 340/380 Ex 420/480 Em 405/485 Em 405/485 Em 405/485
Kd (nM) 145 5300 140 230 470 35,000
荧光蛋白
量子点 （纳米晶体） 更多
很亮，光稳定，可调变光谱， 特异性细胞内标记比染料还 宽激发光谱，窄发射光谱 难，庞大（10-15nm）
荧光探针的使用
• 定位（蛋白质，DNA，脂类）
• 互相作用，空间结构改变 • 细胞环境报道（pH, Ca++, 酶活性） • 基因表达报道
•选择荧光探针
• 光谱分离性 • 毒性 • 光稳定性 • 光亮度
共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备
共聚焦显微镜生物学相关荧光样品制备 Dr Lijun Wu
2015/10/27
Leica / Shanghai
23/6/2014
3
• 形态学分析
• 免疫组织化学 • 记录基因活动 • 影响基因活动 • 原位杂交 • 多色FISH • 细胞追踪
显微镜：明场、相差、微分干涉、荧光图象
Early Endosome
Fluorescence Microscopy Fluorochromes
Fluorochrome
DAPI (DNA) Hoechst 33258 (Bisbenzimid) Lucifer Yellow GFP green Cyanine Cy2 Alexa 488 FITC Fluoresceinisothiocyanat TRITC, Rhodamin Alexa 546 DiI Indocarbocyanine DiO Carbocyanine Cyanine Cy3 Texas red
荧光团类型
自发荧光
优点
本身，天然
缺点
无法控制，通常是令人讨厌 的
荧光染料
明亮，光谱范围大，相对光 稳定，大的行程移动，尺寸 小，可以做成对环境敏感
通过融合目标蛋白可以在活 细胞内表达；可以作为结构 破坏的靶；对一些环境参数 敏感
特异性标记细胞内蛋白质比 较困难；抗体介导的标记； 细胞通常要被固定
波长选择有限，低光稳定性， 不是很亮，光谱交叉，相对 庞大（5um）
A
Color outside the lines
Whatever comes next…
CGFP Alexa 350 CFP Alexa 488 GFP Fluorescein Oregon green DiO new XFP variants? Alexa 543 YFP DiA
DAPI Hoechst
PKC
IP3 DAG
ATP cAMP+PPi
IP3 DAG
PKC
Ca2+
ATP
cAMP+PPi
PKA
Ca2+
Calmodulin
PKA
Ca2+
Calmodulin
IP 3-R
IP3
Ca2+
ER
CaM KII
IP3
IP 3-R
TAG
Postsynaptic
TAG
Ca2+
ER
CaM KII
MAPK p90rsk-1 (Angenstein)
2）溴化乙啶（EB）和碘化丙啶（PI）： 与DNA结合，于细胞核产生荧光（红色）。 EB（10ug/ml）：510/595，PI（10ug/ml）：536/623
3）DAPI和Hoechst33258，Hoechst33342: 与细胞核DNA结合，产生荧光。 DAPI: 350/470 Hoechst33258: 360/505 Hoechst33342: 340/450
荧光
荧光检测的优缺点
一、优点 1、敏感 2、专一 3、快速 4、容易 5、简单 6、应用范围广 7、可靠 二、缺点 1、试剂贵 2、仪器贵 3、染色后样品不易保存，荧光淬灭
荧光样品染色
• 免疫荧光细胞化学法 • 荧光探针 • 荧光蛋白基因转染 • 量子点法 用于体内标记的荧光探针
生物学中应用的荧光探针
1.荧光染料 Alexa Fluor 系列荧光染料激发和发射光谱窄可用于多重荧光 标记而更少光谱重叠 ATTO 系列荧光染料具有较强的光稳定性和热稳定性，已被 应用于STED (Stimulated Emission Depletion 受激发射损耗) 超 高分辨率显微成像技术 DyLight、CF 等更多新型荧光染料系列都将因其较高的激发 效率、良好的光稳定性、宽泛的PH 稳定性等优越的特性而 被广泛的应用于组织及细胞免疫荧光标记。
Excitation
359 365 428 471 489 495 490 540 556 540-560 550 575 595
Emission Filterset No.
461 480 540 503 505 505 525 580 573 556-575 580 605 620 1, 2, 25 1, 2 5 9, 10, 16, 17 9, 24 9, 24 9, 10, 16, 17,23-25 14, 15, 23-25 14, 15, 23-25 14, 15, 0, 26 9, 10, 14, 15, 0 15, 20, 24 0
Cellular Localization
Afferent Input S2
NMDA AMPA
Afferent Input S1
NMDA
mGluR
1, 5
mGluR
2,3,4,6,7
mGluR
AMPA
1, 5
mGluR
2,3,4,6,7
G
PLC PIP 2
Gi
AC
G
PLC PIP 2
Gi
AC
Ca2+
4. GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显示活细胞 中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的结构
5. 蛋白之间相互作用（FRET）