植物亚细胞定位载体卡盒pCEG的构建及验证
亚细胞定位PTEN基因真核表达载体的构建与鉴定
亚细胞定位PTEN基因真核表达载体的构建与鉴定李洪凌;朱向辉;姜新;曲雅勤;李亮【摘要】目的:构建人野生型亚细胞定位PTEN基因真核表达载体,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法:以胎盘组织RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增H的基因片段.PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-PTEN质粒,进行酶切鉴定和测序.以T-PTEN质粒为模板,利用PCR技术将核定位信号(NSL)加入PTEN序列.PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-NSL-PTEN质粒.真核表达载体pcDNA3.1及T-NSL-PTEN质粒经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后连接,转化大肠杆菌,获得重组载体pcDNA3.1-NSL-PTEN,进行酶切和测序鉴定.结果:重组质粒PUM-PTEN酶切在1 200 bp处见目的片段,与预期结果符合.测序结果显示基因序列与目的基因完全一致;重组质粒PUM-NSL-PTEN酶切在1 200 bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与设计一致,核定位信号成功加入;重组质粒pcDNA3.1-PTEN酶切在1 200 bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与目的基因相同;重组载体pcDNA3.1-NSL-PTEN经双酶切和测序证实了其正确性EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切在1 200 bp处见目的片段,与预期结果一致.测序结果显示,核定位信号成功加入,其后是阅读框架正确的PTEN基因序列.结论:成功构建可表达亚细胞定位PTEN的真核表达载体pcDNA3.1-NSL-PTEN.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2009(035)006【总页数】4页(P1057-1060)【关键词】亚细胞定位;PTEN基因;质粒【作者】李洪凌;朱向辉;姜新;曲雅勤;李亮【作者单位】吉林大学第二医院放疗科,吉林,长春,130041;吉林大学第二医院放疗科,吉林,长春,130041;吉林大学第二医院放疗科,吉林,长春,130041;吉林大学第二医院放疗科,吉林,长春,130041;复旦大学附属金山医院医学影像中心,上海,200540【正文语种】中文【中图分类】Q78PTEN基因是一种重要的抑癌基因，在50%～80%的实体瘤中发生了突变[1]。
真核表达载体 pcDN A3．1（＋）-G FP-M C1R 的构建及在羊驼毛囊干细胞中的表达
真核表达载体 pcDN A3．1（＋）-G FP-M C1R 的构建及在羊驼毛囊干细胞中的表达白瑞;王振华;尹志红;弓慧敏;于志慧;庞全海【摘要】旨在构建含有 MC1R基因的pcDNA3．1（＋）真核重组表达载体，为进一步研究 MC1R的生物学功能奠定基础。
应用RT‐PCR技术从羊驼皮肤cDNA 文库中扩增 MC1R基因全长cDNA ，然后通过双酶切将 MC1R基因全长cDNA 克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋），然后采用脂质体法转染体外培养的羊驼毛囊干细胞后，通过G418筛选培养，建立稳定的转染体系，直接荧光观察pcDNA3．1／MC1R融合蛋白在细胞中的分布定位，并通过Western Blot方法检测 MC1R在羊驼毛囊干细胞中的表达。
结果表明，成功构建了pcDNA3．1／MC1R重组表达载体，并且发现试验组的毛囊干细胞中表达 MC1R蛋白显著高于空白组（P＜0．05）。
成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pcDNA3．1／MC1R ，且 MC1R基因在羊驼毛囊干细胞中获得表达。
%It is the base of further study on MC1R biological functions to construct the pcD‐NA3 .1 eukaryotic expression vector of MC1R gene in alpaca .MC1R gene was amplified by RT‐PCR with the cDNA from alpaca skin library .PCR products and pcDNA3 .1 plasmid were digested and recycled by BamHI and EcoRI endonuclease .The positive clones were selected , from which plasmid DNA was abstracted and identified by restriction endonuclease ,sequence identification and sequencing . ThepcDNA3 .1/MC1R recombinant expression plasmid was transfected into alpaca hair follicle stem cells by Lipofectamine TM 2000 .After screening culture by G418 ,a stably‐transfected cell system wasestablished .Fluorescent microscopy was em‐ployed to reveal the localization o f MC1R in alpaca hair follicle stem cells ,and the transcrip‐tion and expression of the MC1R were identified by Western Blot .The results show that eu‐karyotic expression vector pcDNA3 .1/MC1R was successfully constructed .When pcDNA3 . 1/MC1R recombinant expression plasmids were transfected into alpaca hair follicle stem cells , the expression ofMC1R was up‐regulated (P<0 .05) .This study successfully constructed eu‐karyotic expression vector containing green fluorescent protein gene pcDNA 3 .1/MC1R .It c ould up‐regulate the expression of MC1R in alpaca hair follicle stem cells .【期刊名称】《河北农业大学学报》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】5页(P86-90)【关键词】羊驼;黑素皮质激素受体1;毛囊干细胞;真核表达载体;转染【作者】白瑞;王振华;尹志红;弓慧敏;于志慧;庞全海【作者单位】山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801; 山西医科大学晋祠学院，山西太原 030025;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801【正文语种】中文【中图分类】Q7822种天然毛色是羊驼的非常重要的经济性状之一［1］。
植物亚细胞定位载体卡盒pCEG的构建及验证
Ａｂｓ ｒ ｔ ｔ ａｃ ：ＧＦ ｅ ｅ ｗａ ｄ ｌ ｐ ｌ ｄ ｉ ｈ ｒ ｎ ｇ ｉ ｌｎｓ ａ ｄ ｇ ｅ ｕ ｃｉｎＳ ｐ ｏ ｉｇ ｓｕ ｙ Ｐ ｇ ｎ ｓ ｗｉｅｙ ａ ｐｉ ｎ ｔ ｅ ｔａ ｓ ｅｎｃ ｐａ ｔ ｎ ｅｎ ｓｆ ｎ ｔ 。 ｒ ｖｎ ｔ ｄ ． ｅ ｏ
第４ 卷 第 ４ ２ 期
２ １ 年 ４月 ０１
东
北
农
业
大Leabharlann 学学报 ４ １ ８ －８ ２ ： ３ ７ Ａｐ ｉ ２ １ ｒｌ ０１
Ｊ ｕｎａ ｆ ｒｈ ａ ｔ ｒｃ ｌｕａ ｉｅｓｔ ｏ ｒ ｌ ｔｅ ｓ ｉｕ ｔｒｌ ｏ Ｎｏ Ａｇ Ｕｎｖ ｒｉ ｙ
植 物 亚 细胞 定 位 载体 卡 盒 ｐ Ｅ Ｃ Ｇ的 构 建 及 验 证
ｂ ｘ ｏ ＣＥＧ／ Ｈ ａ ， Ｎ ｉ Ｈ ａ ｍｎ ， Ｈ ＮＣ ａ ， Ｉ ｏ ｇ Ｂ Ｉ ｉ Ａ ｕ ， Ｉ ｏ ｆｐ ｚ ｕＤ ｎ ＷＡ Ｇ Ｘ， ＵＹ ｎ ｉ Ｃ Ｅ ｈｏ Ｌ Ｙ ｎ ， Ａ ， Ｉ ａ Ｊ Ｚ ｇ Ｘ Ｃ Ｈ
Ｗｅ （ ｏｌｇ ｆ ｉ ｃｅ ｃ ｓ Ｎ ｒ ｅ ｓＡ ｒ ｕ ｕａ Ｕ ｉ ｒｉ， ａ ｂ ５ ０ ０ Ｃｈｎ ） ｉＣ ｌ ｅｏ ｆ Ｓ ｉ ｅ ， ｏｔ ａ ｔ ｇｉ ｌ ｒｌ ｎ ｅｓ ｙ Ｈ ｒｉ １ ０ ３ ， ｉａ ｅ Ｌｅ ｎ ｈ ｃｔ ｖ ｔ ｎ
ｍｉｒ ｃ ｐ ． ｅ ｒ ｓ ｌ ｄｉｐａ ｅ ｈ ｔｔ ｅ Ｇ Ｆ ｐ ｔ ｉｓ ｅ ｐ ｅ ｓ ｄ ｎ ｏ ｈ ｃ ｔ ｐａ ｍ ｄ ｕ ｌｕ ，ｔ ｉ ｃｏｓ ｏ ｅＴｈ ｅ ｕｔ ｓ ｌｙ ｄ ｔ ａ ｈ Ｐ ｒ ｅｎ ｘ ｒ ｓ ｅ ｉ ｂ ｔ ｙｏ ｌｓ ａｎ ｎ ｃｅ ｓ ｈｓ ｏ ｍｅ ｓ ｔｅ ｐ ａｎ ｈ ＣＥＧ ｏ ｎ ｂ ｓ ｄ ｃ ｎ ｅ ｉｎ ｌ ｒｐａ ｔｇ ｎ ｓ ｓ ｃ ｌ ｌｒｌｃ ｌ ａ ｉ ｎ ｌｓｓａｎ ｒ ｖｄ ｂ ｘｃ ｅｕ ｅ ａ ｏ ｖ ｎｅ ｔ ｆ ｌｎ ｅ ｅ ｕｂ ｅｌ ａ ａ ｉ ｔ ｙｏ ｕ ｏ ｚ ｏｎ ａ ａｙ ｉ ｄ ｐ ｏ ｉｅ ａ ｌｔｏ ｓ ｂｅ ｒ ｓｒ ｔ ｎ ｅｎ ｙ ｅ ｃ ｒｎ ｉ ｒ ｐａｎ ｅｎ ｕ ｉ ｅ ｔ ｏ ｆｕ ａ ｌ ｅ ｔｉ ｉ ｚ ｍ ｕ ｉｇ ｓｔ ｆ ｌ ｔｇ ｅｓ ｆ ｓｏｎ ｄ ｗｉ ＧＦＰ，ａ ｄ ｔ ｅ ｐ ｃｏ ｅｏ ｈ ｎ ｈ ＣＥＧ ｏ ｓ ｂ ｘ ｉ ｃ ｎ ｅｎｅｎ ｒｐａｎ ｅｎ ｓｆ ｃ ｉ ｎ ｙ ｉ ｄ ｈ ｓｇ ｅ ｔｕ ｅｖ ｕ ｏ ｖ ｉ ｔ ｌ ｔ ｏ ｆ ｇ ｅ ｕｎ ｔ ａ ａｌｓｓａｎ ａ ｒ ａ ｓ ａｌｅ． ｏｎ
一种植物质体表达载体的构建方法及应用与流程技术
一种植物质体表达载体的构建方法及应用与流程技术构建植物质体表达载体是一种将外源基因导入植物细胞并在植物细胞内进行表达的方法。
以下是一种常见的植物质体表达载体的构建方法及其应用与流程技术：
1.选择载体：选择适合植物质体表达的载体，通常是质粒
（plasmid）或病毒载体。
质粒载体通常由选择标记基因、启动子、终止子和目标基因构成。
2.克隆目标基因：将目标基因（外源基因）插入载体的多克
隆位点中。
这可以通过限制性内切酶切割质粒载体和目标基因的DNA，然后利用DNA连接酶将两者连接起来。
3.构建表达载体：将含有目标基因的质粒进行转化，例如通
过化学方法或电穿孔等手段将质粒导入植物细胞，形成表达载体。
4.选择转化植物细胞：通过对转化植物细胞进行筛选，例如
添加抗性选择剂或利用标记基因表达进行筛选，以筛选出含有目标基因的转基因植物细胞。
5.确认目标基因表达：通过PCR、RNA分析或蛋白质分析等
技术，检测和确认目标基因在转基因植物细胞内的表达情况。
6.稳定转基因植物的培养：将成功表达目标基因的转基因植
物细胞进行培养，以获得稳定转基因植物种子或植株。
7.功能性验证与应用：对获得的稳定转基因植物进行功能性
验证，例如检测表达的蛋白质具有特定的生物活性或应用
于农艺改良、抗病虫害等方面。
8.申请相关许可：如果打算将转基因植物及其产品用于商业
化目的，需要申请相关的许可和审批文件，以确保遵守法
规和伦理规范。
需要注意的是，植物质体表达载体的构建方法与特定目标基因、植物物种和研究目的有关。
一种亚细胞定位表达载体及构建方法[发明专利]
![一种亚细胞定位表达载体及构建方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/803262ba690203d8ce2f0066f5335a8103d26658.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011135875.4(22)申请日 2020.10.22(71)申请人 山东省农业科学院玉米研究所（山东省农业科学院玉米工程技术研究中心）地址 250100 山东省济南市桑园路11号(72)发明人 丁照华 程文 王志武 唐媛 崔海燕 赵苏娴 卢增斌 (74)专利代理机构 济南尚本知识产权代理事务所(普通合伙) 37307代理人 杨宝根(51)Int.Cl.C12N 15/66(2006.01)C12N 15/65(2006.01)(54)发明名称一种亚细胞定位表达载体及构建方法(57)摘要本发明属于基因工程技术领域，公开了一种亚细胞定位表达载体及构建方法，在TA载体中获得ccdB毒性蛋白，同时利用PCR在Gateway载体p2FGW7中扩增得到eGFP片段，在pCambia载体中获得多克隆位点以及载体的骨架，获得P35s∷ccdB ‑eGFP片段。
用多克隆位点进行酶切后，所获得的线性片段中不再含有ccdB蛋白，同时获得黏性末端，可以利用连接酶将含有相应黏性末端的目的片段插入到载体中。
本发明的亚细胞定位载体既可以用于瞬时转化，研究亚细胞定位，也可以利用农杆菌介导的方法，获得稳定的转基因植株；获得的转基因材料可以用于下一步的生理生化与功能分析。
权利要求书1页 说明书3页序列表5页 附图2页CN 112266925 A 2021.01.26C N 112266925A1.一种亚细胞定位表达载体的构建方法，其特征在于，所述亚细胞定位表达载体的构建方法包括以下步骤：（1）TA载体中获得ccdB毒性蛋白，同时利用PCR在Gateway载体p2FGW7中扩增得到eGFP 片段，在pCambia载体中获得多克隆位点以及载体的骨架，获得P35s∷ccdB -eGFP片段；（2）用多克隆位点进行酶切后，所获得的线性片段中不再含有ccdB蛋白，同时获得黏性末端，利用连接酶将含有相应黏性末端的目的片段插入到载体中；（3）利用任意一种限制性内切酶消化后，然后利用连接酶将片段进行连接，获得P35s∷eGFP载体，该载体产生的蛋白质进入细胞的任意结构，用于阳性对照。
一种植物质体表达载体的构建方法及应用与流程技术
一种植物质体表达载体的构建方法及应用与流程技术植物质体表达载体是一种用于将外源基因转化至植物质体中进行表达的工具，具有许多应用于农业、医药和工业领域的潜力。
本文将介绍一种常用的植物质体表达载体构建方法以及其在相关领域的应用和流程技术。
植物质体是细胞中的一种特殊器官，其中包含了丰富的DNA、RNA 和蛋白质。
通过将外源基因导入质体中进行表达，可以使植物细胞产生特定的蛋白质，从而实现对目标基因功能的研究和生产特定蛋白质的目的。
一种常用的植物质体表达载体构建方法是利用嵌合质粒。
嵌合质粒是由质体和细菌染色体DNA片段组合而成的具有双重起源和选择标记的质粒。
该方法的具体步骤如下：步骤一：选择合适的细菌质粒作为载体。
常用的载体包括Agrobacterium、E. coli等。
首先根据需要选择合适的细菌质粒，该质粒需要能够稳定复制并在植物中高效表达外源基因。
步骤二：选择合适的启动子和终止子。
启动子是控制基因转录起始的区域，终止子是控制转录终止的区域。
通过选择适合的启动子和终止子，可以调控外源基因在植物细胞中的表达水平。
步骤三：克隆外源基因。
将目标基因克隆到载体上，通常使用限制酶切和DNA连接技术。
可以选择不同的限制酶来线性化质粒和选择目标基因以适应不同的表达需求。
步骤四：转化植物细胞。
通过植物转基因技术将构建好的载体导入植物细胞中。
常用的方法包括农杆菌介导的转化和基因枪法。
步骤五：筛选转化成功的植物。
使用适当的选择标记基因，如抗生素抗性基因，来标记成功转化的植物细胞。
通过诱导植物细胞分化和培养，最终得到转化植株。
植物质体表达载体在农业、医药和工业领域有广泛的应用。
在农业领域，该技术可以用于改良作物，使其具备抗病虫害、耐逆性、提高产量等特点。
在医药领域，植物质体表达载体可以用于生产重要的药物和疫苗，如疫苗蛋白、抗体等。
在工业领域，该技术可以用于生产生物材料和生物燃料等高附加值产品。
总结起来，植物质体表达载体构建方法主要包括选择合适的载体、启动子和终止子，克隆外源基因，转化植物细胞，筛选转化成功的植物等步骤。
枣ZjWRKY22_基因克隆、亚细胞定位及表达载体构建
山西农业科学 2023，51（8）：839-845Journal of Shanxi Agricultural Sciences枣ZjWRKY22基因克隆、亚细胞定位及表达载体构建张雪慧 1，2，张鹏飞 1，2，刘亚令 3，梁晋军 1，2，温鹏飞1，2（1.山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 030801；2.山西石楼红枣科技小院，山西 石楼 032500；3.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801）摘要：WRKY 是植物特有的锌指型转录调控因子，参与调控植物抗逆、生长发育和新陈代谢。
为探索易裂品种壶瓶枣WRKY 转录因子ZjWRKY22的生物学功能，同时为揭示枣WRKY 响应非生物胁迫的分子机制提供理论基础，对克隆ZjWRKY22基因编码区序列进行生物信息学预测，并对枣吊、茎、叶、花、果实进行差异表达分析。
结果表明，从壶瓶枣中克隆得到ZjWRKY22基因CDS 序列长1 068 bp ，共编码335个氨基酸，分子质量约为38.9 ku ，等电点为5.92，分子式为C 1682H 2582N 472O 568S 13；该蛋白中丝氨酸最多，占18%，为亲水不稳定蛋白质，无信号肽和跨膜结构域，含有76个磷酸化位点；二级结构类型以无规则卷曲为主，该基因具有典型的WRKY 结构域，三级结构预测主要由4个β-折叠组成，分别为WRKYGQK 、RGYYR 、RKQVER 、FIVTYT ；属于WRKY 家族Ⅱe 组。
同源序列比对显示，枣与杨梅、桃、扁桃、梅的同源性分别为75.86%、74.88%、74.41%和74.88%，系统进化树表明，枣ZjWRKY22与酸枣亲缘关系最近；实时荧光定量显示，ZjWRKY22在果实中表达量最高，具有组织特异性。
进一步构建融合表达载体pCAMBIA1300-GFP -ZjWRKY22，通过农杆菌瞬时注射本氏烟草进行亚细胞定位，结果确定了ZjWRKY22蛋白位于细胞核中，同时成功构建了植物超表达载体pCAMBIA -1300-ZjWRKY22。
植物蛋白质的亚细胞定位研究进展
质特异的抗体检测目标蛋白质在细胞中的位置的方
法。一般是将抗体进行标记后识别植物细胞切片中
的目标蛋白质, 然后借助光学显微镜或电子显微镜 观察其所在位置, 根据抗原抗体的结合部位确定目 标蛋白的位置。这种亚细胞定位方法是把免疫反应 的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来, 可以 在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质, 如多肽、酶、
关键词: 蛋白质; 亚细胞定位; 细胞分区; 蛋白质组学; 高通量 中图分类号: Q- 1 文献标识码: A 文章编号: 1000- 7091( 2006) 增刊- 0001- 06
Advancement of Protein Subcellular Localization in Plants
XING Hao_ran, LIU Li_juan, LIU Guo_zhen
GFP 能自我催化形成发色结构并在蓝光激发下 发出绿色荧光, 所以可以与目标蛋白融合, 作为荧光
标记 分 子, 特 异 性地 进 行 蛋白 质 的 亚细 胞 定 位。 GFP 能在蛋白质的 N 端或 C 端融合而 保持其天然 蛋白的特性, 而且灵敏度高、对活细胞无毒害作用, 所以广泛应用[ 4, 5] ; 此外, GFP 可以人工改造成具有 更高的荧光 强度和 灵敏性 的突 变体, 例如 增强 型 GFP( EGFP) 是将 Ser65 用 Thr 替代, Phe64 用 Leu 替 代, 其荧光强度提高了 35 倍[ 6] ; 另外, GFP 还改建成 了能发射其它颜色荧光的突变体, 例如, 红色荧光蛋 白( RFP ) 、黄 色荧 光 蛋 白 ( YFP ) 和 蓝色 荧 光 蛋 白 ( BFP) 以及它们的增强型 ERFP、EYFP、EBFP 等[ 7, 8] , 这些改造使荧光蛋白的应用更为广泛。
分枝杆菌膜锚定表达载体的构建与亚细胞定位分析
分枝杆菌膜锚定表达载体的构建与亚细胞定位分析王鑫;范小勇;马辉;曲勍;朱越雄【期刊名称】《中华微生物学和免疫学杂志》【年(卷),期】2011(031)006【摘要】Objective To construct mycobacterial membrane-anchored expression vector and to analyze expression level and sub-cellualr localization of exogenous target protein. Methods Based on the mycobacterial intracellular expression vector pMFA42 which contained a strong promoter of pfurAma mutant, the signal sequence of Mycobacterium tuberculosis(Mtb) 19×103 lipoprotein (19SS) was synthesized and was then cloned into the downstream of pfurAma mutant to generate the mycobacterial membrane-anchored expression vector pMFA42M. The coding gene of enhanced green fluorescent protein(EGFP) was amplified by PCR, and then sub-cloned into these two vectors described above to construct recombinant EGFP fused and membrane-anchored strains, respectively. The coding genes of Mtb immuno-dominant antigens Ag85A and its chimera Ag856A2 were then sub-cloned intothe membrane-anchored construct pMFA42MG to produce recombinant Mtb antigen EGFP fused-expression strains. After that, expression levels and sub-cellualr localization of exogenous target protein were further analyzed by Western blot and flow cytometry sorting(FCS), and the fluorescence intensities of recombinant EGFP- expressed strainswere observed in vitro directly and after transfection of murine macrophage cell line RAW264.7. Results The novel mycobacterial membrane-anchored expression vector was constructed successfully by introduction of signal sequence of Mtb 19×103 lipoprotein. Usin g of EGFP as model antigen, exogenous target protein was demonstrated to be expressed with high level and could be anchored into cell membrane of recombinant mycobaterial strains. Conclusion A novel mycobacterial membrane-anchored expression vector was constructed successfully to research recombinant BCG and functions of mycobacterial membrane proteins, and the constructed EGFP-expressed recombinant strains could also be used to research cytophagy in cell model and mycobacterial colony and translocation in animal immunization as model indicator bacteria.%目的构建分枝杆菌膜锚定表达载体,并分析外源目标蛋白的表达情况及其亚细胞定位.方法在分枝杆菌胞内表达载体pMFA42的基础上进行改造,人工合成结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)相对分子质量(Mr)为19×103的脂蛋白膜分泌信号序列,将其插入高效的突变型 furA基因启动子(pfurAma)下游构建新型的分枝杆菌膜锚定表达载体pMFA42M.PCR扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码基因,亚克隆至上述两种载体中并电转化耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Ms),分别获得重组EGFP融合表达菌株和膜锚定表达菌株;接着将Mtb 主要保护性抗原Ag85A及其嵌合抗原Ag856A2的编码基因亚克隆入膜锚定表达载体pMFA42M中构建Mtb抗原-EGFP融合表达菌株;通过Western blot和流式细胞表面标记技术来分析目标抗原的表达水平及其亚细胞定位,并进一步通过荧光显微镜直接观察重组EGFP融合表达菌株在体外和感染巨噬细胞后的荧光强度.结果通过引入Mtb 19×103脂蛋白膜分泌信号,在高效pfurAma启动子的驱动下,成功地构建了分枝杆菌膜锚定表达载体.利用EGFP作为标签抗原,通过Western blot、荧光显微观察和流式细胞表面标记等技术均证实了外源目标抗原可在分枝杆菌中高水平表达并定位至细胞膜上.结论本研究为重组BCG和分枝杆菌膜蛋白功能研究提供了一种新型的膜锚定表达载体,所构建的EGFP重组表达菌株亦可作为一种模式示踪菌为细胞吞噬和动物免疫中的细菌定植和移位分析提供新思路.【总页数】7页(P537-543)【作者】王鑫;范小勇;马辉;曲勍;朱越雄【作者单位】215123,苏州大学医学部基础医学与生命科学学院;201508,上海,复旦大学附属上海市公共卫生临床中心;201508,上海,复旦大学附属上海市公共卫生临床中心;201508,上海,复旦大学附属上海市公共卫生临床中心;215123,苏州大学医学部基础医学与生命科学学院【正文语种】中文【相关文献】1.苹果MdAFS基因亚细胞定位表达载体的构建及分析2.伪狂犬病毒VP22蛋白C-端系列缺失突变体的构建及亚细胞定位分析3.hβ-NGF基因真核表达载体构建及亚细胞定位4.版纳微型猪近交系B4GALNT2基因真核表达载体构建及亚细胞定位分析5.嗜热内切葡聚糖酶(E1)植物亚细胞定位表达载体的构建及验证因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
植物蛋白质的亚细胞定位研究进展
植物蛋白质的亚细胞定位研究进展一、本文概述植物蛋白质在细胞中的亚细胞定位对于理解其生物功能及在植物生命活动中的作用至关重要。
近年来，随着生物技术的飞速发展，尤其是分子生物学、遗传学和蛋白质组学等领域的突破，植物蛋白质亚细胞定位的研究取得了显著进展。
本文旨在综述当前植物蛋白质亚细胞定位的研究现状，探讨其方法和技术，分析面临的挑战，并展望未来的发展趋势。
文章首先简要介绍了植物蛋白质亚细胞定位的基本概念和研究意义，随后综述了目前常用的定位方法和技术，包括生物信息学预测、荧光标记、免疫电镜等。
接着，文章重点分析了近年来在植物蛋白质亚细胞定位研究方面取得的重要成果，包括新发现的定位模式、定位机制以及定位与功能关系的研究等。
文章对当前研究中存在的问题和挑战进行了讨论，并提出了未来研究的方向和建议。
通过本文的综述，希望能够为植物蛋白质亚细胞定位领域的研究者提供有价值的参考和启示。
二、植物蛋白质亚细胞定位方法随着分子生物学和生物技术的快速发展，植物蛋白质的亚细胞定位研究取得了显著的进步。
亚细胞定位是理解蛋白质功能的关键环节，它有助于我们揭示蛋白质在细胞内的确切位置，从而推测其可能参与的生物过程。
目前，植物蛋白质亚细胞定位的方法主要包括生物信息学预测、荧光标记显微观察以及细胞分馏技术等。
生物信息学预测：这是一种基于计算机算法的方法，通过分析蛋白质的氨基酸序列，预测其可能的亚细胞定位。
这种方法具有快速、高效的特点，可以在蛋白质表达之前提供初步的定位信息。
目前，已有多个在线工具和数据库可供使用，如TargetP、WoLF PSORT等。
荧光标记显微观察：这种方法通过将荧光基团与特定的蛋白质标记结合，然后利用显微镜观察荧光信号在细胞内的分布，从而确定蛋白质的亚细胞位置。
常用的荧光标记技术包括绿色荧光蛋白（GFP）标记、免疫荧光标记等。
这种方法直观、准确，是目前研究蛋白质亚细胞定位的主要手段之一。
细胞分馏技术：这是一种基于生物化学原理的方法，通过利用不同细胞组分在物理和化学性质上的差异，将细胞内的各种组分进行分离和纯化，从而得到特定的亚细胞组分。
穿心莲转录因子ApNAC1的克隆、亚细胞定位及原核表达
穿心莲转录因子ApNAC1的克隆、亚细胞定位及原核表达从穿心莲叶片中克隆了1个NAC家族的转录因子，命名为ApNAC1，GenBank注册号为KY196416。
生物信息学分析表明该基因的完整编码区包含972 bp，编码1个323个氨基酸的多肽，预测蛋白相对分子质量为35.9 kDa，等电点为6.14。
原生质体瞬时表达研究证实了ApNAC1-GFP融合蛋白特异定位在穿心莲叶肉细胞的细胞核中，是一个核定位蛋白。
实时定量PCR结果表明ApNAC1基因表达与穿心莲内酯的积累模式一致：主要在穿心莲的叶片里表达，而且茉莉酸甲酯处理能急剧上调其表达水平。
ApNAC1基因在大肠杆菌中进行异源表达，并且被成功纯化。
该研究为进一步探索ApNAC1蛋白参与穿心莲内酯生物合成的研究奠定了基础。
标签：穿心莲；NAC转录因子；亚细胞定位；表达模式；原核表达[Abstract] Andrographis paniculata is widely used as medicinal herb in China for a long time and andrographolide is its main medicinal constituent. To investigate the underlying andrographolide biosynthesis mechanisms，RNA-seq for A. paniculata leaves with MeJA treatment was performed. In A. paniculata transcriptomic data，the expression pattern of one member of NAC transcription factor family （ApNAC1）matched with andrographolide accumulation. The coding sequence of ApNAC1 was cloned by RT-PCR，and GenBank accession number was KY196416. The analysis of bioinformatics showed that the gene encodes a peptide of 323 amino acids，with a predicted relative molecular weight of 35.9 kDa and isoelectric point of 6.14. To confirm the subcellular localization，ApNAC1-GFP was transiently expressed in A. paniculata protoplast. The results indicated that ApNAC1 is a nucleus-localized protein. The analysis of real-time quantitative PCR revealed that ApNAC1 gene predominantly expresses in leaves. Compared with control sample，its expression abundance sharply increased with methyl jasmonate treatment. Based on its expression pattern，ApNAC1 gene might involve in andrographolide biosynthesis. ApNAC1 was heterologously expressed in Escherichia coli and recombinant protein was purified by Ni-NTA agarose. Further study will help us to understand the function of ApNAC1 in andrographolide biosynthesis.[Key words] Andrographis paniculata；NAC transcription factor；subcellular localization；expression pattern；heterologous expression穿心莲为爵床科Acanthaceae植物穿心莲Andrographis paniculata的干燥地上部分，味苦、性寒，具有清热解毒、消肿止痛、抗菌及抗癌作用[1-3]，临床应用于心血管系统疾病、呼吸系统疾病、胃肠道系统疾病等[4]。
植物亚细胞定位（范文2篇）
植物亚细胞定位（范文2篇）以下是网友分享的关于植物亚细胞定位的资料2篇，希望对您有所帮助，就爱阅读感谢您的支持。
植物亚细胞定位（1）第42卷第4期东北农业大学学报42(4):83~87植物亚细胞定位载体卡盒pCEG的构建及验证朱丹，王希，朱延明*，陈超，李勇，柏锡，才华，纪（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030）巍摘要：GFP基因被广泛地应用于植物转基因以及基因功能验证研究，然而构建与GFP融合的植物表达载体，常会因酶切位点难以选择，而使得载体构建过程复杂，周期长。
以含GFP的质粒pCAMBIA-1302为基础，消除此质粒本身的多克隆位点（MCS），并在此质粒GFP基因序列前插入原核表达载体pET-32b的多克隆位点，构建了植物GFP亚细胞定位载体卡盒pCEG；采用农杆菌介导的转化方法，将此载体卡盒pCEG导入模式植物烟草叶片中进行瞬时表达，用激光共聚焦显微镜观察GFP蛋白的亚细胞定位情况，发现GFP蛋白均匀的在细胞质和细胞核中表达，证明此载体卡盒可用于植物基因的亚细胞定位分析，并为构建目的基因与GFP融合的植物表达载体提供了很多可用的酶切位点，对植物基因功能验证提供了分子操作简便的植物表达载体卡盒，具有重要的利用价值。
关键词：载体卡盒构建；亚细胞定位；GFP；烟草中图分类号：Q782文献标志码：A文章编号：1005-9369（2011）04-0083-05 Constructionandapplicationofaplantsubcellularlocalization vectorboxofpCEG/ZHUDan,WANGXi,ZHUYanming,CHEN Chao,LIYong,BAIXi,CAIHua,JIWei(CollegeofLifeSciences,NortheastAgriculturalUniversit y,Harbin150030,China)Abstract:GFPgenewaswidelyappliedinthetransgenicplants andgenesfunction’sprovingstudy.However,theconstructionofGFPfusedplantexpressionvector swasalwayscomplicatedandtimeconsumingduetothehardchoo eplasmidpCAMBIA-130 2whichincludedGFPgeneasaoriginalvector,andeliminateditso wnmultipleclonesite(MCS),andtheninsertedpET-32b’smultip leclonesiteinfrontofGFPgenesequences,namedtheeventualpla ntGFPsubcellularlocalizationvectorboxpCEG.ByAgrobacteri um-mediatedtransformationmethod,pCEGinstantaneousexp ressedintobaccoleaves,andGFPproteinsubcellularlocalization wasobservedbylaserconfocalmicroscope.Theresultdisplayedt hattheGFPproteinsexpressedinbothcytoplasmandnucleus,thi smeansthepCEGboxcanbeusedconvenientlyforplantgenessub cellularlocalizationanalysisandprovidealotofusablerestrictio nenzymecuttingsiteforplantgenesfusionedwithGFP,andthepC EGboxisconvenientforplantgenesfunctionanalysisandhasgre atusevalue.Keywords:constructionofvectorbox;subcellularlocalization ;GFP;tobacco在基因的功能研究过程中，外源重组基因表达产物的功能与其在宿主细胞中的定位有重要的关系，特别是对于真核细胞，蛋白质位于不同的细胞部位所行使的功能也不同，所以研究其在宿主细胞收稿日期：2011-01-12基金项目：国家高科技发展计划（863计划）（2008AA10Z153）；国家自然科学基金资助项目（30570990）；黑龙江省科技厅重大攻关项目（GA06B10）；黑龙江省教育厅科技项目（11521024）；黑龙江省教育厅科技项目（11521021）作者简介：朱丹（1986-），女，硕士研究生，研究方向为植物基因工程与分子生物学。
多基因真核表达载体的构建及其产物的亚细胞定位
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许多疾病的发生和发展与基因异常相关，包括遗 传性疾病、某些神经、内分泌和代谢性疾病以及肿瘤等 均是由于某种或某些基因的缺失、突变、异位或重排等 导致相关基因的表达异常 （ 无表达、低表达或过度表 达） 所引起。这些疾病往往缺乏有效的治疗手段，基 因治疗为治愈这些疾病带来新希望。基因治疗研究 中，不仅要考虑目的基因的表达效率和表达水平，有时 还需要考虑基因的细胞定位，对于多基因异常疾病如 肿瘤，还需要考虑采用多个基因联合治疗的手段。本 研究利用单一载体在同一启动子的调控下实现多个基 因的同时表达以及不同的亚细胞定位，为基因治疗的 多基因联合表达以及不同的亚细胞定位需求奠定实验 基础。
1． 1． 2 细 胞
人 肾 胚 293 细 胞 和 鼠 胚 胎 成 纤 维 细 胞
NIH3T3 细胞由本科室保存，用 1640 培养基加 10% 胎牛血清培
养。
1． 2 方法
1． 2． 1 2A 肽开放读码框序列和 PCR 引物设计 分别以口蹄
疫病毒（ foot-and-mouth disease virus，FMDV） 和马鼻炎 A 病毒
［Abstract ］ Objective To construct a multi-gene eukaryote expression vector in which co-expression of multiple genes was achieved and their products were located in different organelles in a single cell under control of the same promoter． Methods Sequences of polypeptide including two different‘2A’peptides and several restriction sites were synthesized to form a single open reading frame using the presence of different ‘2A’peptide sequences and inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3． 1 （ － ） Myc / His （ B） ． ERFP with membrane location signal，EGFP with nuclear location signal and cytoplasmic EYFP were respectively inserted into the sites between the ‘2A’peptides for the construction of eukaryotic expression vector pcDNA3． 1 RGY． The vector was transfected to NIH3T3 cells or 293 cells by Liposome，and expression levels of the fluorescent proteins were measured and their sub-cellular locations were detected by flow cytometry， fluorescence and confocal microscopy，respectively． Results The expression levels of ERFP and EGFP were measured by flow cytometry in 24 h after the transfection，and the expression rates of the two proteins were quite similar． The green and red fluorescences were observed under fluorescence microscope and green，red and yellow fluorescences in a single cell were observed under confocal fluorescence microscope． ERFP，EGFP and EYFP were located on the cytomembrane，in the nuclei and the cytoplasm，respectively． Conclusion Expression of multiple genes can be achieved under control of the single promoter by inserting several 2A peptides and multiple genes into the same open reading frame． In addition，different sub-cellular locations can be observed in a single cell by adding signal peptide into the gene that makes it target the corresponding organelles．
XA21蛋白质的亚细胞定位及其定位决定结构域的鉴定
ｘＡ２ｌ蛋白质的亚细胞定位及其定位决定结构域的鉴定１．４试验目的图１．ｐＧＦＰ舯５７的物理图谱Ｆ逗．２ｐ时ｓＥａＩｒｎａｐｏｆｐＧＦＰｓ６”本试验是利用融合绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）报告基因定位技术，预实现的目标如下：（１）克隆全长ｘａ２１ｃＤＮＡ｝，称之为勘２』儿，构建溉ｚ２』凡．曲融合基因的表达载体后转化洋葱表皮细胞表达，在激光共聚焦显微镜下，通过检测融合蛋白绿色荧光在细胞中的分布来进行ｘＡ２１激酶蛋白的亚细胞定位；（２）根据ｘＡ２ｌ蛋白质结构分区的特点和参考其它蛋白质定位的研究结果，分析推断某些被认为重要的结构域：丝氨酸，苏氨酸激酶区、跨膜区、富亮氨酸重复区和Ｎ＿端信号肽可能对亚细胞定位产生关键作用，尤其是跨膜区可能是定位的决定结构域。
基于这些分析，试验另外克隆４个非全长的渤２』目的片段，它们是以ｘａ２ｌｃＤＮＡ＋序列为蓝本，５’端序列完全一致、３ｉ端逐次缺失被认为是重要的结构域编码序列。
同样方法获得激光共聚焦定位结果，通过与（１）的定位结果差异比较分析，来找出ｘＡ２１的定位决定结构域。
依据这些研究结果，分析总结ｘＡ２ｌ蛋白质亚细胞定位相关的问题。
１．５研究展望本试验采用绿色荧光蛋白标记技术转基因于洋葱表皮细胞中进行体外定位，这样的方法目前已发展成熟并且应用广泛，在定位方法中具有～定的代表性。
关于蛋白质亚细胞定位已经建立了多种技术方法，如：免疫组织化学定位法、蛋白质组学定位技术以及共分离标记酶辅助定位法，还有可以结合生物信息学预测蛋白亚细胞定位。
这些方法有些比较容易进行体内定位，有些只能依赖于体外定位的方法。
体内定位最接近于真实的蛋白质动态特征和功能本质。
参考１．２中的分析，如果能够采用免疫组织化学定位法将在水稻本体内表达的ｘＡ２１蛋白质（含ｃ．Ｍｙｃ抗原决定簇，见７ｘＡ２ｌ蛋白质的亚细胞定位及其定位决定结构域的鉴定２．３制各ｘ以Ｊ的五个目的片段２．３．１ｘＡ２１蛋白质的结构域分析和目的片段克隆策略ＸＡ２１（不含ｃ．Ｍｙｃ抗原决定簇）是一个由１０２５个氨基酸构成的类受体蛋白激酶，为了研究的需要，研究者们在妇２Ｊ的开放式阅读框中用ＤｒａⅢ插入了４８ｂｐ的ｃ—Ｍｙｃ抗原决定簇标签编码序列及衔接头序列”。
一种植物质体表达载体的构建方法及应用[发明专利]
![一种植物质体表达载体的构建方法及应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/b377de58ae1ffc4ffe4733687e21af45b307fed2.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710436614.8(22)申请日 2017.06.12(71)申请人 湖北大学地址 430062 湖北省武汉市友谊大道368号(72)发明人 张江 武玉永 李圣纯 有利利 吴梦婷 常玲 (74)专利代理机构 北京金智普华知识产权代理有限公司 11401代理人 杨采良(51)Int.Cl.C12N 15/66(2006.01)C12N 15/82(2006.01)(54)发明名称一种植物质体表达载体的构建方法及应用(57)摘要本发明公开了一种植物质体表达载体的构建方法及应用，构建了gfp表达盒和aadA表达盒，把去除多克隆位点的质粒pBluescript II sk(+)载体片段、gfp表达盒、aadA表达盒、与质体基因组同源的左同源片段和右同源片段这5个片段通过无酶克隆技术一步转入大肠杆菌中，验证正确的载体命名为pYY12。
利用金粉包裹pYY12质粒DNA导入质体基因组中，Southern blot证实目的基因导入质体基因组中，Northern bolt显示了GFP基因的转录水平，激光共聚焦显微镜证实了GFP的存在位置，SDS-PAGE法分析了GFP蛋白的高水平的积累量，达到总可溶性蛋白的9％左右。
权利要求书1页 说明书5页序列表5页 附图6页CN 107267538 A 2017.10.20C N 107267538A1.一种植物质体表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、gfp表达盒组装：gfp表达盒是由来源于烟草rRNA操纵子的启动子Prrn和来源于T7噬菌体的T7G10序列组成的强启动子、来源于水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色荧光蛋白的变异GFP基因和来源于大肠杆菌rrnB终止子序列组成，利用利用计算机辅助设计把这3个片段设计组合在一起通过基因合成gfp表达盒，gfp表达盒序列见序列表，如SEQ:ID:NO:1所示；步骤2、aadA表达盒组装：aadA表达盒是由来源于莱茵衣藻的psbA基因的启动子PpsbA、来源于细菌的aadA基因和来源于莱茵衣藻的rbcL基因终止子序列和两端同向的loxp序列组成，如SEQ:ID:NO:2所示；步骤3、质体同源片段克隆：由质体基因组psaB基因的部分序列、rps14基因序列和trnfM基因序列组成的质体左同源片段，由质体基因组psbZ基因序列trnfM基因序列组成的质体右同源片段，质体转化的插入位点为trnfM和trnG之间的非编码区，左同源序列和右同源序列见序列表，如SEQ:ID:NO:3、SEQ:ID:NO:4所示；步骤4、大肠杆菌表达载体骨架的克隆：为去多克隆位点MCS的质粒pBluescript II sk (+)序列，大肠杆菌表达载体骨架序列见序列表，如SEQ:ID:NO:5；步骤5、构建植物质体表达载体：把合成的gfp表达盒、合成生物学合成的aadA表达盒、质体左同源片段、质体右同源片段和大肠杆菌转化载体骨架这5个片段通过利用计算机辅助设计一步法克隆到大肠杆菌Xl10-gold宿主菌中，在感受态细胞效率在2*108个/μg时，能到19个的阳性克隆，经测序验证后均正确。
月季RhD14基因克隆、亚细胞定位及表达分析
54卷收稿日期：2022-08-08基金项目：云南省基础研究计划项目（202201AT070256）；云南省科技人才与平台计划（202005AF150035）；云南省教育厅科学研究基金项目（2021J0112）通讯作者：孟静（1981-），https:///0000-0003-3667-6419，博士，副教授，主要从事园林植物资源收集、评价与创新研究工作，E-mail ：********************第一作者：杜高齐（1996-），https:///0000-0002-4292-6798，研究方向为园林植物资源收集与评价，E-mail ：1245846646@qq.com月季RhD14基因克隆、亚细胞定位及表达分析杜高齐，李雪娇，许彬，关文灵，孟静*（云南农业大学园林园艺学院，云南昆明650201）摘要：【目的】克隆月季独脚金内酯（SLs ）信号应答底物受体即α/β折叠水解蛋白基因Dwarf 14（D14），对其进行亚细胞定位及表达分析，为探究该基因的生物学功能及其在SLs 调控月季侧枝发生中的转导机制提供理论支持。
【方法】以月季品种滇红为材料，克隆RhD14基因并进行生物信息学分析，同时采用实时荧光定量PCR （qRT-PCR ）检测其在不同组织中的表达情况，利用烟草瞬时转化系统对RhD14基因编码蛋白进行亚细胞定位。
【结果】克隆RhD14基因（GenBank 登录号OP009358）cDNA 序列1094bp ，包含完整的开放阅读框（ORF ），长度为1045bp ，编码347个氨基酸残基，蛋白分子式为C 1738H 2703N 441O 510S 15，相对分子量为38.41kD ，理论等电点（pI ）为5.71，二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主，且RhD14为无跨膜结构和信号肽的稳定蛋白，属于α/β水解酶家族，亚细胞定位于细胞质和细胞膜上。
同源序列比对和系统发育进化树分析结果显示，RhD14蛋白的氨基酸序列与同属的古老月季品种月月粉RcD14（XP_024283944.1）的相似性最高为98.05％，其次是同亚科的草莓FvD14（XP_004287076.1），相似性为89.75％，三者亲缘关系较近。
广藿香PcGA2ox1基因克隆、VIGS载体构建和表达分析
广藿香PcGA2ox1基因克隆、VIGS载体构建和表达分析作者：严雅玲曾晴严寒静何梦玲张宏意来源：《山东农业科学》2024年第05期關键词：广藿香；赤霉素2-氧化酶（GA2ox）；基因克隆：病毒诱导基因沉默（VIGS）；表达分析广藿香[Pogostemon cablin（Blanco）Benth.]为唇形科刺蕊草属植物，以干燥地上部分人药，原产于东南亚菲律宾、马来西亚等热带地区，宋朝时期传人我国并在南方广泛种植，道地产区主要分布在两广、岭南等，故而有广藿香之称。
广藿香少有开花，很难结果，因而主要采用扦插方式繁殖，但扦插繁殖慢且易引起种质退化，难以培育出优质品种。
因此，通过促进侧枝发育增加地上部分的比重，从而提高广藿香产量，对选育品质优良的广藿香意义重大。
赤霉素（gibberellins，GAs）是一种重要的植物内源激素，调控植物生命周期的各个阶段，在根茎叶伸长、侧枝发育、花期调控、种子休眠等方面发挥作用。
植物体内的GAs分为有活性和无活性两类，其中GA1和GA4为有活性类。
GA20x（gibberellin 2-oxidases）作为赤霉素代谢途径中的一个关键酶，可以将活性赤霉素（GAI和GA4）降解为无活性状态，限制有生物活性GAs的含量，从而调节植物发育，如在拟南芥中阻止种子萌发、延迟无性繁殖、改变花期、限制主茎和侧芽的伸长等。
一般而言，植物体内GA2ox过表达会使活性GAs含量降低，从而使植株表现为矮化，而将其沉默，则会促进茎的伸长和植株生长。
目前已有众多植物GA2ox基因被成功克隆并进行了相关研究，如GA2ox基因在油菜籽、早熟禾、油茶等植物中过表达呈现出矮化表征，生物量减少、开花延迟、叶片颜色呈深绿色等：相反，在烟草中沉默GA2ox可以显著促进烟草生长和提高纤维产量。
目前GA2ox基因在烟草、拟南芥、番茄等植物中已有研究，但未见广藿香GA2ox基因的相关研究报道，为此，本研究基于本课题组前期获得的广藿香转录组数据，对其GA2oxl基因进行克隆和生物信息学分析，以探寻GA2ox基因在广藿香中的作用，为后续研究矮化广藿香、促进侧枝发育和增加产量等提供有力依据。
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在基因的功能研究过程中，外源重组基因表达 产物的功能与其在宿主细胞中的定位有重要的关 系，特别是对于真核细胞，蛋白质位于不同的细胞 部位所行使的功能也不同，所以研究其在宿主细胞
头，与切成线性的 pCAMBIA-1302 连接，构建成中 间表达载体，命名为 pCEbT。将 pCEbT 转化大肠杆 菌 DH5α，在含有 Km 的 LB 培养基平板上筛选转化 菌落，提取转化子质粒，并用 SalⅠ和 BglⅡ进行 双酶切鉴定，酶切电泳图结果显示不能切下约 700 bp 大小的条带，证明 SalⅠ酶切位点已被消 除，即证明质粒 pCAMBIA-1302 中的 MCS 已被消 除（见图 1）。
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东北农业大学学报
第 42 卷
GFP）。绿色荧光蛋白是细胞生物学和分子生物学 研究中的一个重要的工具，绿色荧光蛋白相对分 子质量很小，能与多种不同的蛋白质 N 端或 C 端 融合而保持其天然蛋白的特性，因此是一种直观 性很强的遗传标记物 。 [1-3] 通过与某单一序列的融 合，可特异地进行细胞核、线粒体、质体、内质 网等细胞器的定位。由于 GFP 基因其产物可以自 身发光，不需要任何底物和辅助因子参与就能检 测其活性，所以用 GFP 进行亚细胞定位，避免了 提纯蛋白、标记异硫氰酸荧光素等荧光染料、经 显微注射或其他方式导入细胞的复杂方法，从而 使研究蛋白在活细胞的准确定位变得简单易 行 。 [4-6] 但在研究基因在植物细胞中的定位时，必 须构建与基因融合的 GFP 亚细胞定位载体，常常 会因酶切位点的难以选择使得构建周期长，操作 复杂，如果能构建出具有多个可用酶切位点的植 物表达载体卡盒，将大大缩短载体构建周期，节 省大量人力物力[7-8]。
第4期
朱 丹等：植物亚细胞定位载体卡盒 pCEG 的构建及验证
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2 结果与分析
2.1 植物 GFP 亚细胞定位载体 pCAMBIA-1302 中 MCS 的消除
用 Eco R Ⅰ 和 Pst Ⅰ 双 酶 切 质 粒 pCAMBIA1302，消除其多酶切位点（MCS），同样用 Eco RⅠ 和 PstⅠ双酶切质粒 pEbTIP 并回收切下的大小约 280 bp 不含有常用酶切位点的基因片段作为小接
（ 东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030 ）
摘 要：GFP 基因被广泛地应用于植物转基因以及基因功能验证研究，然而构建与 GFP 融合的植物表达载
体，常会因酶切位点难以选择，而使得载体构建过程复杂，周期长。以含 GFP 的质粒 pCAMBIA-1302 为基础，消
除此质粒本身的多克隆位点（MCS），并在此质粒 GFP 基因序列前插入原核表达载体 pET-32b 的多克隆位点，构建
1 材料与方法
1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒
大 肠 杆 菌 菌 株 DH5α， 根 癌 农 杆 菌 菌 株 EHA105。
植物 GFP 亚细胞定位载体 pCAMBIA-1302，植 物表达载体 pEbTIP，原核表达载体 pET-32b 均由 东北农业大学植物生物工程研究室保存；中间表 达 载 体 pCEbT 和 植 物 GFP 亚 细 胞 定 位 载 体 卡 盒
trxA pEbTIP 6 108 bp
烟草品种为本氏烟。 1.2 方法 1.2.1 质粒 DNA 提取、电泳、酶切、大肠杆菌及 农杆菌感受态制备、转化、菌落 PCR
均采用常规分子生物学操作技术，具体操作步 骤参照文献[9]。 1.2.2 琼脂糖凝胶中 DNA 片段的回收
按照试剂盒操作说明进行。 1.2.3 连接反应方法
具体操作步骤参照文献[10]。 1.2.4 引物设计
BEaHcSmXKSSoiSmPnpbpaaHRsdhaancltⅢⅠⅠⅠⅠⅠⅠⅠⅠⅠ
NcoⅠ Bgl Ⅱ
P35S GCAMBIA-1302 hpt11 10 549 bp
T34S
His Tag Eco RⅠ PstⅠ Bgl Ⅱ
fl origin Gs TIP
Ampr
了植物 GFP 亚细胞定位载体卡盒 pCEG；采用农杆菌介导的转化方法，将此载体卡盒 pCEG 导入模式植物烟草叶片
中进行瞬时表达，用激光共聚焦显微镜观察 GFP 蛋白的亚细胞定位情况，发现 GFP 蛋白均匀的在细胞质和细胞核
中表达，证明此载体卡盒可用于植物基因的亚细胞定位分析，并为构建目的基因与 GFP 融合的植物表达载体提供
pCEG 由 本 研 究 室 构 建 ； 测 序 载 体 pGEM-T 购 自 Promega 公司。质粒图谱见结果与分析。 1.1.2 常用试剂及酶类
LA TaqDNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、限制性 内 切 酶 及 DNA 胶 回 收 试 剂 盒 均 购 自 大 连 宝 (TaKaRa)生物工程公司。卡那霉素、氨苄青霉素等 其他试剂均为进口或国产分析纯。引物合成、 DNA 测序由上海生物工程公司完成。 1.1.3 植物材料
了很多可用的酶切位点，对植物基因功能验证提供了分子操作简便的植物表达载体卡盒，具有重要的利用价值。
关键词：载体卡盒构建；亚细胞定位；GFP；烟草
中图分类号：Q782
文献标志码：A
文章编号：1005-9369（2011）04-0083-05
Construction and application of a plant subcellular localization vector box of pCEG/ZHU Dan, WANG Xi, ZHU Yanming, CHEN Chao, LI Yong, BAI Xi, CAI Hua, JI
Wei (College of Life Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)
Abstract: GFP gene was widely applied in the transgenic plants and genes function's proving study.
本研究通过酶切连接手段消除 pCAMBIA-1302 载体本身的多克隆位点（Multip cloning site，MCS）， 同 时 通 过 高 保 真 PCR 扩 增 克 隆 了 原 核 表 达 载 体 pET-32b 的多克隆位点，并将此多克隆位点插入已 消除本身多克隆位点的载体 pCAMBIA-1302 的 GFP 基因序列前，构建成植物 GFP 亚细胞定位载体卡 盒 pCEG；通过农杆菌介导的转化方法，将此载体 卡盒 pCEG 于烟草叶片中进行瞬时表达，用激光共 聚焦显微镜观察 GFP 蛋白的亚细胞定位情况，发 现 GFP 蛋白在细胞质和细胞核都有表达，证明此 载体卡盒可用于植物基因的亚细胞定位分析；本 研究所构建的载体卡盒为目的基因的植物亚细胞 定位载体的构建带来了很大的便利，也为目的基 因在宿主细胞中的亚细胞定位研究奠定基础。
However, the construction of GFP fused plant expression vectors was always complicated and time consuming due to the hard choose of restriction enzyme cutting sites. Use plasmid pCAMBIA-1302 which included GFP gene as a original vector, and eliminated its own multiple clone site (MCS), and then inserted pET-32b's multiple clone site in front of GFP gene sequences, named the eventual plant GFP subcellular localization vector box pCEG. By Agrobacterium-mediated transformation method, pCEG instantaneous expressed in tobacco leaves, and GFP protein subcellular localization was observed by laser confocal microscope.The result displayed that the GFP proteins expressed in both cytoplasm and nucleus, this means the pCEG box can be used conveniently for plant genes subcellular localization analysis and provide a lot of usable restriction enzyme cutting site for plant genes fusioned with GFP, and the pCEG box is convenient for plant genes function analysis and has great use value.
根据原核表达载体 pET-32b 上 MCS 区附近的 序列，应用 Primer Premier 5.0 软件分析其内部酶切 位点，设计一对 MCS 的克隆引物，为方便后续载 体构建，上游引物端从 NcoⅠ位点开始设计，并在 下游端加入了 BglⅡ位点。最终确定引物序列如下：
上游引物: 5' GTACCGACGACGACGACAAGGC 3' 下游引物: 5' AGATCTACCATTTTAGCAGCCGG ATCTAAG 3' 根据载体 pCEG 上新插入的 MCS 上游区的碱基 序列，应用 Primer Premier 5.0 软件设计了一条引物 用于载体卡盒 pCEG 中新插入的 MCS 的测序，其引 物序列如下： 5' AGTGGATTGATGTGATATCTCC 3' 1.2.5 农杆菌介导的亚细胞定位载体卡盒 pCEG 对 烟草的转化 将质粒 pCEG 转入农杆菌 EHA105，通过 PCR 鉴定阳性转化子，将转入质粒 pCEG 的农杆菌注射 培养 4 周大小的烟草叶片。 1.2.6 GFP 亚细胞定位观察 取侵染后 3 d 的烟草叶片，在激光共聚焦显微 镜 488 nm 检测波长下，观察 GFP 蛋白的表达情况 以及亚细胞定位情况。