PCR技术的原理及方法

94℃
55℃
37℃
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
(%)
100
酶 80 活 性 60
40
20
40 50 60 70 80 90
Leabharlann Baidu
100
温度(℃)
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72℃
PCR循环
Kary B. Mullis（穆利斯（美））
• 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重 大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis 荣获1993年度诺贝尔化学奖。
主要内容
✓ 1 PCR技术简史 ✓ 2 PCR的原理 ✓ 3 PCR实验设计方法 ✓ 4 几种重要的PCR衍生技术 ✓ 5 PCR技术的应用
1. PCR的发展历史（PCR history）
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR) 是20世纪80年代中期发 展起来的快速体外DNA 复制方法。 是基因工程技术的重大突破，是分子生 物学发展的里程碑。
发展分三个阶段：设想、实现、改进与完善。
PCR技术简史
• PCR的最早设想 • PCR的实现 • PCR的改进与完善
• 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与 合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物， 并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。
• 但由于测序和引物合成的困难，以及70年 代限制性内切酶的发现使基因重组成为可 能 ， 所 以 ， Khorana 的 设 想 被 人 们 遗 忘 了……
• PCR反应条件 • PCR过程
• PC第R的3轮特点扩增
理想拷贝数=2n
重n 循复环次数30轮后
第4轮扩增第5轮2扩3增0=1,0第763轮,扩增741,824 实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数
• 30 Cycles,即可把DNA分子的数量放大百万倍
经典循环参数（500bp以内）
PCR技术简史
PCR的最早设想 PCR的实现 PCR的改进与完善
• 1985年,美国PE-Cetus公司（ ABI 前身） 人类遗传研究室的Mullis等发明了PCR技术, 使Khorana的设想得到实现。
• 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复 制
• 最初采用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow 片段进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过 程耗时，费力，且易出错。
Kary B. Mullis（1944－）
主要内容
✓ 1 PCR的发展历史 ✓ 2 PCR的原理 ✓ 3 PCR实验设计方法 ✓ 4 几种重要的PCR衍生技术 ✓ 5 PCR技术的应用
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
标准的PCR反应体系（五要素）
4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+
• •
PPCCRR反过应程条件7925℃
• PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始
PCR的基本原理
•
Taq•
PPCCRR反过应程条件957502℃
• PCR的特点
Taq
Taq
Taq
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件72℃
• PCR的特点
第2轮结束
模板DPNACR的基本原理
第1轮扩增
第2轮扩增
等组织的粗提DNA
主要内容
✓ 1 PCR的发展历史 ✓ 2 PCR的原理 ✓ 3 PCR实验设计方法 ✓ 4 几种重要的PCR衍生技术 ✓ 5 PCR技术的应用
３PCR实验设计方法(How to do PCR)
——PCR五要素的选择
• 1）PCR的模板要求
a. 来源及种类：PCR模板可以来源于任何生物，单、双链 DNA均可
94℃
94℃ 55 ℃ 72 ℃ 72℃
10℃
5min
30s 45s 1min 7min
×30次
forever
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
灵敏度高 1. 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水
平 2. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 3. 病毒检测的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位) 4. 细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 1. 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 2. 扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织
各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
✓ (1)引物序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 ✓ (2)长度15-30bp为宜，过短降低特异性，过长会导致其延
伸温度大于7２℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应； ✓ (3)碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶堆积现
象,G+C含量控制在45-55%左右； ✓ (4)引物内部避免形成二级结构 ✓ (5)两引物间避免有互补序列 ✓ (6)引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的基本原理 • PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
高温变性：94oC 20-30秒，使双链DNA解链 为单链
引物
• 低温退火：使引物与模板 DNA 结合
• 适温延伸：72℃，延伸时间由扩增片段 长度决定
PCR的基本原理
PCR技术简史
PCR的最早设想 PCR的实现 PCR的改进与完善
1988年，日本Saiki等从温泉中分离的 一株水生嗜热杆菌（Thermus aquaticus） 中提取到一种耐热DNA聚合酶，并将此酶 命名为Taq DNA聚合酶.
耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率 的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台 PCR自动化热循环仪，使PCR真正得到广泛 应用
b. 纯度：要求不高，样品中存在一定量的蛋白质或其他有机 物对实验结果影响不大。甚至可以将细胞裂解物直接用于 扩增。有时样品中含有抑制DNA聚合酶活性的物质，可通 过稀释淡化对酶的影响。
c. 用量： 一般100ng DNA模板/100L，模板浓度过高会 导致反应的非特异性增加。
•２）PCR引物设计