免疫学技术综述
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第十讲 分子免疫学技术 内容摘要
1免疫学基本概况 2 分子免疫的基本理论 3 抗血清制备技术 4免疫检测技术 5 酶联免疫吸附检测法 6单克隆抗体技术
1免疫学基本概况
1.1什么是免疫反应？
广义的说，凡是研究抗原物质在体内发生排异现象，刺激
产生免疫答应产物的方法学称为免疫反应。刺激产生免疫
反应的物质称之为抗原，产生免疫答应产物称之为抗体， 产生免疫答应的过程称之为免疫周期。 1.2免疫学的范畴 在相当长的一段时期内，免疫学几乎是只是研究有关传染
(2)佐剂的配制 a 不完全福氏佐剂 (Freund’sadjuvant) ：由羊毛脂和液体石 蜡按一定比例混合而成，一般在夏季羊毛脂：液体石蜡=1
：2，冬季羊毛脂：液体石蜡=1：3
b完全福氏佐剂：由不完全福氏佐剂，抗原物质和卡介苗
组成，混合的比例是不完全福氏佐剂：抗原物质：卡介苗
=5：4：1
c 混合方式：取 5 份不完全福氏佐剂置于乳钵中，一边研
散和免疫电泳技术结合起来的一种检测方法，以此来提高
免疫检测的分辨率和灵敏度。
该方法是，首先将抗原通过琼脂糖凝胶电泳把抗原各个组
分分开，并沿抗原分离的边线开一个小槽，然后在槽内加
满抗体，抗体随琼脂糖凝胶介质的网状结构自由扩散，与
抗原的相应组分相遇出现白色沉淀线。
微量免疫电泳不仅可以用于抗原抗体的定性和纯度鉴定，而且可以
A 抗原、抗体的比例 4/16 1/4
B 8/12 1/1.5
C 8/4 2/1
当
抗原为单价时（如某些有机小分子，多肽，小分子蛋白
等）或抗体为单价，虽然抗原抗体能发生结合，但不会形 成大分子复合物，不出现沉淀反应，所以单价的抗原或抗
体不能用沉淀反应直接进行检测。
4.2检测方法 (1)双向免疫扩散 双向扩散法(double diffusion),又称琼脂扩散法。它是利用
快抗原抗体结合的速度。对流免疫电泳主要是利用血清抗
原在 pH8.6 巴比妥缓冲液的离子琼脂糖凝胶中，带负电荷
，在电场下向正极移动，而血清中的抗体在该溶液中处于
电中性，在场下不移动，但受电渗的影响向负极渗动。由 于抗原向正极移动，经过一段时间电泳，抗原就会与抗体 相遇，在抗原抗体的比例合适的情况下会出现白色沉淀。 采用此方法可以测定抗体效价或抗原效价。
1.4外源抗原物质 组织、器官 细菌、病毒 红细胞 蛋白质、多糖 抗生素类药物 二价重金属离子
1.5免疫动物
原则上说，行市对异体物质具有免疫反应的哺乳动物均
可作为免疫动物，但是常用与免疫实验的动物主要有： 马 羊 兔 鼠
2 分子免疫的基本理论
2.1基本原理
当抗原初次进入具有免疫答应能力的动物体内后，要经
过一段较长的潜伏期才出现抗体，又经过一段高峰期后抗 体量下降至消失。在这段时期内总抗体量较少，抗体的主 要成分是IgM，这次机体对抗原产生的答应反应为“初次 答应”。当抗原再次进入机体时，血液中抗体很快出现， 含量明显高于初次答应反应，抗体的主要成分是 IgG ，这 次机体对抗原产生的答应反应为“再次答应”。如此重复 科获得较高的答应产物。
原与相应的抗体之间的分子比例是不同的，只有在抗原-抗体比例合
适时才能见到沉淀线，所以抗原-抗体结合能否出现沉淀线，并不能 完全反应抗原-抗体是否存在和发生结合。
因为抗原可以结合多个抗体分子，所以称抗原是多价的；抗体只能
结合两个抗原分子的抗原决定簇，故称抗体是二价的。因此，只有
抗原抗体的结合价被饱和时，才能出现大量的抗原抗体复合物沉淀。
数和浓度等因素有关。当抗原抗体存在多种系统时，会出现多条沉
淀线。根据沉淀线的形状，数量和相对位置可以定性抗原，诊断某 些疾病。
此法的优点是：操作简单，数据可靠。
2.5cmm
7.5cm
(2)对流免疫电泳 对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis)是外加电场 以限制抗原，抗体的扩散，提高抗原抗体的局部浓度，加
磨一边滴加水溶性抗原和卡介苗，直到混合物完全乳化形
成油包水的注射用佐剂。外观是乳白色的胶体。
(3)动物的选择 根据不同实验目的和抗体的用途，选择不同的免疫动物 。如是用于大量制备抗体，可选用马或羊等大的哺乳动物 ，这些动物的免疫周期较长，通常要用 3-6 个月，如果是 少量制备或科研分析可选用兔或鼠，这些动物的免疫周期 较短，通常要用一个半月左右。选择年轻健康的动物。
＋ 8cm
8cm
－
(5)双向免疫电泳 双 向 免 疫 电 泳 也 称 之 为 交 叉 免 疫 电 泳 (crossed electrophoresis) 。首先在一块离子琼脂板上，像微量电泳 一样将抗原各组分分开，称之为第一相。然后将其转移到 玻璃板的一端并在另一侧铺上抗体琼脂板，正好与第一相 凝胶衔接。由于第一相已经将抗原的蛋白组分分开了，在 进行第二相时只有单一组分的各个抗原向前泳动。当各种 组分的抗原与抗体板中的相应抗体相遇时，就会出现各个
测定抗原的效价是：抗体为原浓度，抗原采用二倍稀释法，沉淀显
出在最稀的一个稀释倍数就是该抗原的效价。
此法的优点是：测定效价时间短，数据准确。
7.5cm
－
＋
2.5cm
抗 抗 原 体
抗 抗 原 体
抗 抗 原 体
(3)微量免疫电泳
微量免疫电泳 (micro-immunoelecrophoresis) 是将免疫双扩
(2)盐析法粗提：在血清中加入饱和度为75%的硫酸铵盐析
，放置24小时后，然后将沉淀物用生理盐水溶解，对蒸馏
水透析，获得抗体粗提液。
(3)离子交换分离：将抗体粗提液通过 DEAE-Sepharose-4B
阴离子交换柱层析分离，缓冲液：10mmol/L pH7.4磷酸缓
冲液，洗脱液： 0.5mol/L NaCl溶液，一般采用梯度洗脱
很大的进展。通过对合成抗原，人工抗原和天然抗原分子结构与免 疫源性的研究，表明只有蛋白质，结合蛋白，和多糖类生物大分子 诱导产生的免疫答应，在免疫学上称之为抗原。从抗原的化学结构 上分析，决定产生免疫答应的不是抗原的整个分子二十分子上的一 些特定的化学基团或结构，这些化学基团称为“抗原决定族”。它 们几十诱导机体产生抗体，有事抗原与抗体结合部位。因此，一个 复杂的蛋白质大分子可以有多个抗原决定族，如：甲状腺球蛋白有 个抗原决定族。具有多个抗原决定族的生物大分子可以诱导产生多 种特性的不同类别的抗体。
琼脂糖凝胶介质具有多孔的网状结构的特性，抗原抗体分
子在琼脂糖凝胶介质中可以自由扩散。当具有一定间隔距
离的抗原和相应的抗体，通过在琼脂糖凝胶介质中的扩散
作用二者相遇，形成抗原抗体复合物，在比例合适时就会
出现白色沉淀。由于琼脂糖凝胶是透明的，可以直接观察
到抗原抗体复合物的沉淀线。
沉淀线的特征和位置与抗原的相对分子量大小，分子结构，扩散系
0.2ml, 无需佐剂
(5)采血技术
心脏采血 耳沿静脉采血 尾静脉采血 眼窝采血 颈动脉采血
3.2抗体的纯化
(1) 血清制备，血清的制备有两种方法。一种方法是将加
入了抗凝剂的免疫动物血液，于 2500rpm/min 离心，除去
血球获得到血浆或将未加抗凝剂的免疫动物血液，待血液
凝聚后放置24小时，直接渗出血清。
组分的抗原抗体复合物沉定。
源自文库 ＋
第 二 向 电 泳
－
＋
第一向电泳
5 酶联免疫吸附检测法
酶联免疫吸附测定技术是在1971年由瑞典科学家Engvall等人提出
来的。它们采用纤维素和聚苯乙烯是管作为固定相载体来吸附抗原 或 抗 体 ， 并 建 立 了 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 法 (Enzyme Linked Immunoserbent Assay ，简称 ELISA) 。 1974 年，因 Voller 等人改用聚 苯乙烯微量反应板为固定相作为免疫吸附载体，才使酶联免疫吸附 法得到了广泛的应用。ELISA检测由于采用了酶标法，被标记酶的 酶促与相应的底物反应具有放大作用。它除了能保留抗原抗体的高 度特异性结合外，还提高了检测灵敏度，使检测量达到ng甚至pg级
颜色可判断抗原或抗体是否存在，作定性 ] 鉴定；根据反
(4)注射部位和注射量 a 注射部位：通常选择在免疫动物的活动部位为注射点， 如足掌，肩胛骨，髋骨等。 b 注射方式：每次采用多点注射。对于大的哺乳动物将佐 剂注射在皮下，小哺乳动物如鼠，可采用腹腔或肌肉注射 ,无需佐剂。 C 注射量：根据动物的不同，注射的量也有区别。以兔为 实 验 动 物 ， 总 注 射 量 为 2ml ， 0.5ml/ 注 射 点 。 静 脉 注 射
图1,动物机体的初次和再次免疫答应
由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同的的动物或同种不同品系
的动物，甚至同一品系不同个体的动物，产生特异性免疫答应的强
弱是不同的。对于动物个体的不同组织部位对抗原刺激的敏感性也 是有差异的。淋巴结，脾脏，足掌，眼睫膜等是反映的敏感部位。
近几十年来，在研究抗原抗体大分子的结构与功能关系方面取得了
病预防问题，但是随着人对疾病作斗争实践经验的积累，
随着免疫化学和免疫生物学的深入研究，免疫学的研究越 来越广泛，并与许多相关学科交织在一起，发展成了许多 分支学科。目前划分的主要学科主要有：
免疫生物学
免疫遗传学 免疫细胞学 免疫生理学 免疫药理学 血液免疫学 肿瘤免疫学
1.3肌体内的免疫系统 在高等动物体内存在着具有免疫功能的组织主要有： 淋巴组织 ( 中枢淋巴组织的胸腺，外周淋巴组织的淋巴 结，红骨髓，脾脏) 免疫活性细胞（T淋巴细胞,B淋巴细胞） 免疫活性介质（抗体，补体，淋巴因子）
方式。 (4) 亲和层析法：将纯化好的抗原偶联到琼脂糖凝胶层介 质(Sepharose 4B)上，制成免疫亲合柱，利用抗原抗体的互 补性进行分离。
4免疫检测技术
4.1检测的基本原理
将可溶性抗原与相应的抗体混合，如果二者比例合适，并有电解 质（如氯化钠）存在时，就会出现抗原-抗体沉淀反应。如果这免疫 检测是在琼脂糖凝胶介质中进行，则可看到白色沉淀的抗原抗体复 合物。根据沉淀线出现与否可以判断样品种抗原 -抗体的存在 根据 稀释都梯度可以测定样品种抗原-抗体的效价。 抗原-抗体的结合在沉淀反应中，呈现出一定的分子比例，不同抗
的水平，接近放射免疫测定。ELISA检测法在临床和生物学研究中
广泛应用，在抗原，半抗原和抗体的测定方面起到重要作用，尤其 在单克隆抗体的研究中，为杂交瘤细胞株的筛选，提供了简单快捷 ，灵敏，快速的测定方法。
免疫酶技术是将酶标记在抗体或抗原分子上，形成酶标抗 原或抗体，称之为酶结合物。该结合物中的酶分子，在免 疫反应后作用于相应的底物生成颜色。根据反应是否产生
用于临床诊断。
此法的优点是：检测灵敏度高，方法简便
－ ＋
2.5cm
7.5cm
(4)火箭免疫电泳
火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis)又称单向定量免疫电 泳。抗原抗体出现的沉淀线的形状类是于子弹头，故火箭电泳也因 此而得名。检测的方法是先在融化的琼脂糖凝胶中加入一定量的抗 体，混匀后铺成琼脂糖抗体板（也称抗体板），在抗体板的一端打 一排小孔，依次加入不同浓度的抗原。在电场作用下，不同浓度的 抗原向前泳动，当遇到琼脂板中的抗体时，就会形成抗原抗体复合 物，出现沉淀线。由于抗原的加样孔中的抗原不断的进入凝胶向前 移动，新增的抗原造成了抗原的过剩。使已形成的抗原抗体复合物 又被溶解。过剩的抗原在电场的作用下继续往前走，又遇到琼脂板 中未被结合的抗体，再次形成新的抗原抗体复合物，出现新的沉淀 线。因此，在电泳过程中抗原不断的发生沉淀—溶解—沉淀。只有 在加样孔内的抗原完全进入凝胶并与抗体形成复合物时，才出现稳 定的沉淀线。若抗原的浓度越大，形成火箭峰越高，浓度越小形成 峰越低。
2.2抗体的分类
抗血清是指含有某种特异抗体的动物血清，通过免疫学
检测抗原与抗体反应具有高度的特异性，无需纯化可以进
行直接检测。动物血清中的抗体有 5 类，即 IgG ， IgM ，
IgA，IgE和IgD。这些抗体中，IgG含量最高。
3 抗血清制备技术
3.1免疫动物的基本技术 (1)抗原选择 以生物大分子作抗原，主要是蛋白类或多糖，如果要想 得到多种混合抗体可以用多种蛋白同时免疫动物，如用血 清直接免疫动物。如果要想得到单一抗体可以用纯蛋白免 疫动物，如用牛血清青蛋白免疫
1免疫学基本概况 2 分子免疫的基本理论 3 抗血清制备技术 4免疫检测技术 5 酶联免疫吸附检测法 6单克隆抗体技术
1免疫学基本概况
1.1什么是免疫反应？
广义的说，凡是研究抗原物质在体内发生排异现象，刺激
产生免疫答应产物的方法学称为免疫反应。刺激产生免疫
反应的物质称之为抗原，产生免疫答应产物称之为抗体， 产生免疫答应的过程称之为免疫周期。 1.2免疫学的范畴 在相当长的一段时期内，免疫学几乎是只是研究有关传染
(2)佐剂的配制 a 不完全福氏佐剂 (Freund’sadjuvant) ：由羊毛脂和液体石 蜡按一定比例混合而成，一般在夏季羊毛脂：液体石蜡=1
：2，冬季羊毛脂：液体石蜡=1：3
b完全福氏佐剂：由不完全福氏佐剂，抗原物质和卡介苗
组成，混合的比例是不完全福氏佐剂：抗原物质：卡介苗
=5：4：1
c 混合方式：取 5 份不完全福氏佐剂置于乳钵中，一边研
散和免疫电泳技术结合起来的一种检测方法，以此来提高
免疫检测的分辨率和灵敏度。
该方法是，首先将抗原通过琼脂糖凝胶电泳把抗原各个组
分分开，并沿抗原分离的边线开一个小槽，然后在槽内加
满抗体，抗体随琼脂糖凝胶介质的网状结构自由扩散，与
抗原的相应组分相遇出现白色沉淀线。
微量免疫电泳不仅可以用于抗原抗体的定性和纯度鉴定，而且可以
A 抗原、抗体的比例 4/16 1/4
B 8/12 1/1.5
C 8/4 2/1
当
抗原为单价时（如某些有机小分子，多肽，小分子蛋白
等）或抗体为单价，虽然抗原抗体能发生结合，但不会形 成大分子复合物，不出现沉淀反应，所以单价的抗原或抗
体不能用沉淀反应直接进行检测。
4.2检测方法 (1)双向免疫扩散 双向扩散法(double diffusion),又称琼脂扩散法。它是利用
快抗原抗体结合的速度。对流免疫电泳主要是利用血清抗
原在 pH8.6 巴比妥缓冲液的离子琼脂糖凝胶中，带负电荷
，在电场下向正极移动，而血清中的抗体在该溶液中处于
电中性，在场下不移动，但受电渗的影响向负极渗动。由 于抗原向正极移动，经过一段时间电泳，抗原就会与抗体 相遇，在抗原抗体的比例合适的情况下会出现白色沉淀。 采用此方法可以测定抗体效价或抗原效价。
1.4外源抗原物质 组织、器官 细菌、病毒 红细胞 蛋白质、多糖 抗生素类药物 二价重金属离子
1.5免疫动物
原则上说，行市对异体物质具有免疫反应的哺乳动物均
可作为免疫动物，但是常用与免疫实验的动物主要有： 马 羊 兔 鼠
2 分子免疫的基本理论
2.1基本原理
当抗原初次进入具有免疫答应能力的动物体内后，要经
过一段较长的潜伏期才出现抗体，又经过一段高峰期后抗 体量下降至消失。在这段时期内总抗体量较少，抗体的主 要成分是IgM，这次机体对抗原产生的答应反应为“初次 答应”。当抗原再次进入机体时，血液中抗体很快出现， 含量明显高于初次答应反应，抗体的主要成分是 IgG ，这 次机体对抗原产生的答应反应为“再次答应”。如此重复 科获得较高的答应产物。
原与相应的抗体之间的分子比例是不同的，只有在抗原-抗体比例合
适时才能见到沉淀线，所以抗原-抗体结合能否出现沉淀线，并不能 完全反应抗原-抗体是否存在和发生结合。
因为抗原可以结合多个抗体分子，所以称抗原是多价的；抗体只能
结合两个抗原分子的抗原决定簇，故称抗体是二价的。因此，只有
抗原抗体的结合价被饱和时，才能出现大量的抗原抗体复合物沉淀。
数和浓度等因素有关。当抗原抗体存在多种系统时，会出现多条沉
淀线。根据沉淀线的形状，数量和相对位置可以定性抗原，诊断某 些疾病。
此法的优点是：操作简单，数据可靠。
2.5cmm
7.5cm
(2)对流免疫电泳 对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis)是外加电场 以限制抗原，抗体的扩散，提高抗原抗体的局部浓度，加
磨一边滴加水溶性抗原和卡介苗，直到混合物完全乳化形
成油包水的注射用佐剂。外观是乳白色的胶体。
(3)动物的选择 根据不同实验目的和抗体的用途，选择不同的免疫动物 。如是用于大量制备抗体，可选用马或羊等大的哺乳动物 ，这些动物的免疫周期较长，通常要用 3-6 个月，如果是 少量制备或科研分析可选用兔或鼠，这些动物的免疫周期 较短，通常要用一个半月左右。选择年轻健康的动物。
＋ 8cm
8cm
－
(5)双向免疫电泳 双 向 免 疫 电 泳 也 称 之 为 交 叉 免 疫 电 泳 (crossed electrophoresis) 。首先在一块离子琼脂板上，像微量电泳 一样将抗原各组分分开，称之为第一相。然后将其转移到 玻璃板的一端并在另一侧铺上抗体琼脂板，正好与第一相 凝胶衔接。由于第一相已经将抗原的蛋白组分分开了，在 进行第二相时只有单一组分的各个抗原向前泳动。当各种 组分的抗原与抗体板中的相应抗体相遇时，就会出现各个
测定抗原的效价是：抗体为原浓度，抗原采用二倍稀释法，沉淀显
出在最稀的一个稀释倍数就是该抗原的效价。
此法的优点是：测定效价时间短，数据准确。
7.5cm
－
＋
2.5cm
抗 抗 原 体
抗 抗 原 体
抗 抗 原 体
(3)微量免疫电泳
微量免疫电泳 (micro-immunoelecrophoresis) 是将免疫双扩
(2)盐析法粗提：在血清中加入饱和度为75%的硫酸铵盐析
，放置24小时后，然后将沉淀物用生理盐水溶解，对蒸馏
水透析，获得抗体粗提液。
(3)离子交换分离：将抗体粗提液通过 DEAE-Sepharose-4B
阴离子交换柱层析分离，缓冲液：10mmol/L pH7.4磷酸缓
冲液，洗脱液： 0.5mol/L NaCl溶液，一般采用梯度洗脱
很大的进展。通过对合成抗原，人工抗原和天然抗原分子结构与免 疫源性的研究，表明只有蛋白质，结合蛋白，和多糖类生物大分子 诱导产生的免疫答应，在免疫学上称之为抗原。从抗原的化学结构 上分析，决定产生免疫答应的不是抗原的整个分子二十分子上的一 些特定的化学基团或结构，这些化学基团称为“抗原决定族”。它 们几十诱导机体产生抗体，有事抗原与抗体结合部位。因此，一个 复杂的蛋白质大分子可以有多个抗原决定族，如：甲状腺球蛋白有 个抗原决定族。具有多个抗原决定族的生物大分子可以诱导产生多 种特性的不同类别的抗体。
琼脂糖凝胶介质具有多孔的网状结构的特性，抗原抗体分
子在琼脂糖凝胶介质中可以自由扩散。当具有一定间隔距
离的抗原和相应的抗体，通过在琼脂糖凝胶介质中的扩散
作用二者相遇，形成抗原抗体复合物，在比例合适时就会
出现白色沉淀。由于琼脂糖凝胶是透明的，可以直接观察
到抗原抗体复合物的沉淀线。
沉淀线的特征和位置与抗原的相对分子量大小，分子结构，扩散系
0.2ml, 无需佐剂
(5)采血技术
心脏采血 耳沿静脉采血 尾静脉采血 眼窝采血 颈动脉采血
3.2抗体的纯化
(1) 血清制备，血清的制备有两种方法。一种方法是将加
入了抗凝剂的免疫动物血液，于 2500rpm/min 离心，除去
血球获得到血浆或将未加抗凝剂的免疫动物血液，待血液
凝聚后放置24小时，直接渗出血清。
组分的抗原抗体复合物沉定。
源自文库 ＋
第 二 向 电 泳
－
＋
第一向电泳
5 酶联免疫吸附检测法
酶联免疫吸附测定技术是在1971年由瑞典科学家Engvall等人提出
来的。它们采用纤维素和聚苯乙烯是管作为固定相载体来吸附抗原 或 抗 体 ， 并 建 立 了 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 法 (Enzyme Linked Immunoserbent Assay ，简称 ELISA) 。 1974 年，因 Voller 等人改用聚 苯乙烯微量反应板为固定相作为免疫吸附载体，才使酶联免疫吸附 法得到了广泛的应用。ELISA检测由于采用了酶标法，被标记酶的 酶促与相应的底物反应具有放大作用。它除了能保留抗原抗体的高 度特异性结合外，还提高了检测灵敏度，使检测量达到ng甚至pg级
颜色可判断抗原或抗体是否存在，作定性 ] 鉴定；根据反
(4)注射部位和注射量 a 注射部位：通常选择在免疫动物的活动部位为注射点， 如足掌，肩胛骨，髋骨等。 b 注射方式：每次采用多点注射。对于大的哺乳动物将佐 剂注射在皮下，小哺乳动物如鼠，可采用腹腔或肌肉注射 ,无需佐剂。 C 注射量：根据动物的不同，注射的量也有区别。以兔为 实 验 动 物 ， 总 注 射 量 为 2ml ， 0.5ml/ 注 射 点 。 静 脉 注 射
图1,动物机体的初次和再次免疫答应
由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同的的动物或同种不同品系
的动物，甚至同一品系不同个体的动物，产生特异性免疫答应的强
弱是不同的。对于动物个体的不同组织部位对抗原刺激的敏感性也 是有差异的。淋巴结，脾脏，足掌，眼睫膜等是反映的敏感部位。
近几十年来，在研究抗原抗体大分子的结构与功能关系方面取得了
病预防问题，但是随着人对疾病作斗争实践经验的积累，
随着免疫化学和免疫生物学的深入研究，免疫学的研究越 来越广泛，并与许多相关学科交织在一起，发展成了许多 分支学科。目前划分的主要学科主要有：
免疫生物学
免疫遗传学 免疫细胞学 免疫生理学 免疫药理学 血液免疫学 肿瘤免疫学
1.3肌体内的免疫系统 在高等动物体内存在着具有免疫功能的组织主要有： 淋巴组织 ( 中枢淋巴组织的胸腺，外周淋巴组织的淋巴 结，红骨髓，脾脏) 免疫活性细胞（T淋巴细胞,B淋巴细胞） 免疫活性介质（抗体，补体，淋巴因子）
方式。 (4) 亲和层析法：将纯化好的抗原偶联到琼脂糖凝胶层介 质(Sepharose 4B)上，制成免疫亲合柱，利用抗原抗体的互 补性进行分离。
4免疫检测技术
4.1检测的基本原理
将可溶性抗原与相应的抗体混合，如果二者比例合适，并有电解 质（如氯化钠）存在时，就会出现抗原-抗体沉淀反应。如果这免疫 检测是在琼脂糖凝胶介质中进行，则可看到白色沉淀的抗原抗体复 合物。根据沉淀线出现与否可以判断样品种抗原 -抗体的存在 根据 稀释都梯度可以测定样品种抗原-抗体的效价。 抗原-抗体的结合在沉淀反应中，呈现出一定的分子比例，不同抗
的水平，接近放射免疫测定。ELISA检测法在临床和生物学研究中
广泛应用，在抗原，半抗原和抗体的测定方面起到重要作用，尤其 在单克隆抗体的研究中，为杂交瘤细胞株的筛选，提供了简单快捷 ，灵敏，快速的测定方法。
免疫酶技术是将酶标记在抗体或抗原分子上，形成酶标抗 原或抗体，称之为酶结合物。该结合物中的酶分子，在免 疫反应后作用于相应的底物生成颜色。根据反应是否产生
用于临床诊断。
此法的优点是：检测灵敏度高，方法简便
－ ＋
2.5cm
7.5cm
(4)火箭免疫电泳
火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis)又称单向定量免疫电 泳。抗原抗体出现的沉淀线的形状类是于子弹头，故火箭电泳也因 此而得名。检测的方法是先在融化的琼脂糖凝胶中加入一定量的抗 体，混匀后铺成琼脂糖抗体板（也称抗体板），在抗体板的一端打 一排小孔，依次加入不同浓度的抗原。在电场作用下，不同浓度的 抗原向前泳动，当遇到琼脂板中的抗体时，就会形成抗原抗体复合 物，出现沉淀线。由于抗原的加样孔中的抗原不断的进入凝胶向前 移动，新增的抗原造成了抗原的过剩。使已形成的抗原抗体复合物 又被溶解。过剩的抗原在电场的作用下继续往前走，又遇到琼脂板 中未被结合的抗体，再次形成新的抗原抗体复合物，出现新的沉淀 线。因此，在电泳过程中抗原不断的发生沉淀—溶解—沉淀。只有 在加样孔内的抗原完全进入凝胶并与抗体形成复合物时，才出现稳 定的沉淀线。若抗原的浓度越大，形成火箭峰越高，浓度越小形成 峰越低。
2.2抗体的分类
抗血清是指含有某种特异抗体的动物血清，通过免疫学
检测抗原与抗体反应具有高度的特异性，无需纯化可以进
行直接检测。动物血清中的抗体有 5 类，即 IgG ， IgM ，
IgA，IgE和IgD。这些抗体中，IgG含量最高。
3 抗血清制备技术
3.1免疫动物的基本技术 (1)抗原选择 以生物大分子作抗原，主要是蛋白类或多糖，如果要想 得到多种混合抗体可以用多种蛋白同时免疫动物，如用血 清直接免疫动物。如果要想得到单一抗体可以用纯蛋白免 疫动物，如用牛血清青蛋白免疫