营养缺陷型菌株的筛选方法
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营养缺陷型菌株的筛选方法
主讲人：张波 制作：张烨 许洋 材料收集：徐Fra Baidu bibliotek炀 车通 周浩
什么是营养缺陷型菌株？
经过人工诱变或自然突变失去 合成某种营养（氨基酸，维生 素，核酸等）的能力，只有在 基本培养基中补充所缺乏的营 养因子才能生长 的 野生型菌株 。
它是一种生化突变株，它的出 现是由基因突变引起的。遗传 信息的载体是一系列为酶蛋白 编码的核酸系列，如果核酸系 列中某碱基发生突变，由该基 因所控制的酶合成受阻，该菌 株也因此不能合成某种营养因 子，使正常代谢失去平衡。
二、淘汰野生菌株
在诱变后的存活菌体中营养缺陷型菌株的数量很少，一般仅占存活菌体的百分之几或千 分之几，而野生型细胞却大量存在，因而要采取一些措施，尽量淘汰野生型细胞，使缺 陷型菌株得以富集，以利于检出。
淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。
1、抗生素法：
细菌用青霉素法：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之 间的交链，阻止合成完整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而 被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处休止状态的细菌。将诱变处理后的菌悬液分离加有 抗生素的基本培养基上，培养后野生型细胞由于正常生长繁殖而被杀死，营养缺陷型细 胞因不能生长而被保留下来，达到富集目的。
营养缺陷型菌株的检出
营养缺陷型菌株的检出方法有：点植对照法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等
1、点植对照法：诱变后的孢子或菌体，经富集培养，涂布分离在完全培养基平 板进行培养，待菌落孢子成熟后，用灭菌的牙签或接种针把每个菌落上孢子或 菌体分别接到基本培养基和完全培养基平板上的相应位置，同时培养，然后观 察对比菌落生长情况。如果基本培养基上不生长而完全培养基相应位置上生长 的菌落，可能为营养缺陷型。挑取孢子或菌体分别移接到基本培养基和完全培 养基斜面上，进一步复证。该法可靠性强，但工作量大。
超阻遏突变体（表现为营养缺陷型）
营养缺陷型菌株的分离和筛选
4个步骤： 1、诱变培养 2、淘汰野生型 3、检出营养缺陷型 4、鉴别缺陷种类，确定生长谱
一、诱变培养
营养缺陷型的诱变方法和诱变因子 与普通诱变育种基本相同。用于诱 发营养缺陷型的诱变剂有亚硝基胍, 紫外线,亚硝酸等,其中亚硝基胍的 诱发突变率极高,一般可达10%以上 ,另外,随着诱变剂量的提高突变频 率也追加。
3、高温杀菌法
利用芽孢杆菌类的芽孢和营养 体对热敏感性的差异，让诱变 后的细菌形成芽孢，然后把处 在芽孢阶段的细菌移到基本培 养液中，振荡培养一定时间， 野生型芽孢萌发，而营养缺 陷 型芽孢不能萌发。此时将培养 物加热到80℃，维持一定时间 ，野生型细胞大部分被杀死， 缺陷型则得以保留，起到了浓 缩作用。
4、影印接种法
经富集后的孢子或菌体分离在完全培养 基培养至菌落成熟（母皿 ） ， 用灭菌后 的特制“丝绒印模”在母皿平板菌落上轻 轻一印，再转印到方位相同的另一基本 培养基和完全培养基的平板上。培养后 观察比较菌落生长情况，凡是在基本培 养基上不生长，而在完全培养基上生长 的菌落，分别移接到以上两种培养基斜 面上进一步复证。另外还可采用更简便 的方法，以上印模从母皿中沾上菌体细 胞后，仅影印在基本培养基平板上，培 养后，生长的菌落情况与存放于冰箱的 母皿菌落比较即可检出营养缺陷型。本 法适用于细菌、酵母菌，其次对小型菌 落的放线菌和霉菌也适用。
营养缺陷型的鉴定
1、缺陷类别的测定
通常分别用以下物质来代表氨基酸、维生素、核酸碱基：
①氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨，代表氨基酸类
②酵母浸出液，基中氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶均有
③维生素混合物，代表维生素类
④核酸碱基混合液，代表嘌呤、嘧啶类。
将待测微生物从斜面上用生理盐水或缓冲液乔洗下来，离心洗涤，制成浓度为 106~108ml-1菌悬液 ，取0.1ml加入到基本培养基中，混匀倒入平皿，制成平板。凝固后，用加圆滤纸分别浸湿沾取以上 四类代表物质，覆于平板标定的位置上。培养后，观察圆滤纸片周围菌株生长情况，如出现混浊的 生长圈，就可初步确定缺陷型所需的生长因子属于哪一类别，进一步复证。
2、缺陷型所需生长因子的测定
缺陷型菌株和基本培养基混合制成平板，把5组或6组生长因子直接加于同一琼脂平板上，或用滤纸 片沾取后覆于琼脂平板上，培养后，观察哪一组或哪两组区产生混浊生长圈，即可确定该菌株缺陷 的生长因子。如果要测定数十或上百个缺陷型菌株时，则可改成一个平皿中加入一种生长因子，制 成平板，在翻转平皿底部，几十个方格子，把每株缺陷型按编号移接到琼脂平板格子中。培养后， 根据混浊圈出现情况，则可确定哪些缺陷型菌株是缺这种生长因子的。
2、夹层平板法：先在培养皿上倒一薄层基本培养基，凝固后再倒一层经过诱变 处理的菌液，其上再浇一层基本培养基；经培养后，对首次出现的菌落用记号 笔在皿底标记，然后再倒一层完全培养基，再培养，出现的形态较小的新菌落 ，多为缺陷型。
夹层平板法
3、限量营养法：如果试验的目的仅是检出营养缺陷型菌株，则其该法是将富集培养后的 细胞接种到含有0.01%蛋白胨的基本培养基上，培养后，野生型细胞迅速地长成大菌落， 在平皿底部作好颜色标记，而生长缓慢的小菌落可能是缺陷型，此称限量培养。如果试 验的目的是要定向筛选某种特定的缺陷型，则可在基本培养基中加入某种单一的氨基酸 、维生素或碱基等物质，称为补充培养。
酵母菌用制霉素法：制霉素作用于真菌细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长 繁殖过程的真菌，起到富集营养缺陷型的作用。
2、菌丝过滤法
真菌和放线菌等丝状菌的野生 型孢子在基本培养基中能萌发 长成菌丝，而营养缺陷型的孢 子则不能萌发。把诱变处理后 的孢子移入到基本培养液中， 振荡培养10h左右，使野生型孢 子萌发的菌丝刚刚肉眼可见， 用灭菌的脱脂棉、滤纸或玻璃 漏斗除去菌丝。继续培养，每 隔3~4h过滤一次，重复3~4次 ，最大限度地除去野生型细胞 。然后稀释、涂皿分离。
主讲人：张波 制作：张烨 许洋 材料收集：徐Fra Baidu bibliotek炀 车通 周浩
什么是营养缺陷型菌株？
经过人工诱变或自然突变失去 合成某种营养（氨基酸，维生 素，核酸等）的能力，只有在 基本培养基中补充所缺乏的营 养因子才能生长 的 野生型菌株 。
它是一种生化突变株，它的出 现是由基因突变引起的。遗传 信息的载体是一系列为酶蛋白 编码的核酸系列，如果核酸系 列中某碱基发生突变，由该基 因所控制的酶合成受阻，该菌 株也因此不能合成某种营养因 子，使正常代谢失去平衡。
二、淘汰野生菌株
在诱变后的存活菌体中营养缺陷型菌株的数量很少，一般仅占存活菌体的百分之几或千 分之几，而野生型细胞却大量存在，因而要采取一些措施，尽量淘汰野生型细胞，使缺 陷型菌株得以富集，以利于检出。
淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。
1、抗生素法：
细菌用青霉素法：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之 间的交链，阻止合成完整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而 被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处休止状态的细菌。将诱变处理后的菌悬液分离加有 抗生素的基本培养基上，培养后野生型细胞由于正常生长繁殖而被杀死，营养缺陷型细 胞因不能生长而被保留下来，达到富集目的。
营养缺陷型菌株的检出
营养缺陷型菌株的检出方法有：点植对照法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等
1、点植对照法：诱变后的孢子或菌体，经富集培养，涂布分离在完全培养基平 板进行培养，待菌落孢子成熟后，用灭菌的牙签或接种针把每个菌落上孢子或 菌体分别接到基本培养基和完全培养基平板上的相应位置，同时培养，然后观 察对比菌落生长情况。如果基本培养基上不生长而完全培养基相应位置上生长 的菌落，可能为营养缺陷型。挑取孢子或菌体分别移接到基本培养基和完全培 养基斜面上，进一步复证。该法可靠性强，但工作量大。
超阻遏突变体（表现为营养缺陷型）
营养缺陷型菌株的分离和筛选
4个步骤： 1、诱变培养 2、淘汰野生型 3、检出营养缺陷型 4、鉴别缺陷种类，确定生长谱
一、诱变培养
营养缺陷型的诱变方法和诱变因子 与普通诱变育种基本相同。用于诱 发营养缺陷型的诱变剂有亚硝基胍, 紫外线,亚硝酸等,其中亚硝基胍的 诱发突变率极高,一般可达10%以上 ,另外,随着诱变剂量的提高突变频 率也追加。
3、高温杀菌法
利用芽孢杆菌类的芽孢和营养 体对热敏感性的差异，让诱变 后的细菌形成芽孢，然后把处 在芽孢阶段的细菌移到基本培 养液中，振荡培养一定时间， 野生型芽孢萌发，而营养缺 陷 型芽孢不能萌发。此时将培养 物加热到80℃，维持一定时间 ，野生型细胞大部分被杀死， 缺陷型则得以保留，起到了浓 缩作用。
4、影印接种法
经富集后的孢子或菌体分离在完全培养 基培养至菌落成熟（母皿 ） ， 用灭菌后 的特制“丝绒印模”在母皿平板菌落上轻 轻一印，再转印到方位相同的另一基本 培养基和完全培养基的平板上。培养后 观察比较菌落生长情况，凡是在基本培 养基上不生长，而在完全培养基上生长 的菌落，分别移接到以上两种培养基斜 面上进一步复证。另外还可采用更简便 的方法，以上印模从母皿中沾上菌体细 胞后，仅影印在基本培养基平板上，培 养后，生长的菌落情况与存放于冰箱的 母皿菌落比较即可检出营养缺陷型。本 法适用于细菌、酵母菌，其次对小型菌 落的放线菌和霉菌也适用。
营养缺陷型的鉴定
1、缺陷类别的测定
通常分别用以下物质来代表氨基酸、维生素、核酸碱基：
①氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨，代表氨基酸类
②酵母浸出液，基中氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶均有
③维生素混合物，代表维生素类
④核酸碱基混合液，代表嘌呤、嘧啶类。
将待测微生物从斜面上用生理盐水或缓冲液乔洗下来，离心洗涤，制成浓度为 106~108ml-1菌悬液 ，取0.1ml加入到基本培养基中，混匀倒入平皿，制成平板。凝固后，用加圆滤纸分别浸湿沾取以上 四类代表物质，覆于平板标定的位置上。培养后，观察圆滤纸片周围菌株生长情况，如出现混浊的 生长圈，就可初步确定缺陷型所需的生长因子属于哪一类别，进一步复证。
2、缺陷型所需生长因子的测定
缺陷型菌株和基本培养基混合制成平板，把5组或6组生长因子直接加于同一琼脂平板上，或用滤纸 片沾取后覆于琼脂平板上，培养后，观察哪一组或哪两组区产生混浊生长圈，即可确定该菌株缺陷 的生长因子。如果要测定数十或上百个缺陷型菌株时，则可改成一个平皿中加入一种生长因子，制 成平板，在翻转平皿底部，几十个方格子，把每株缺陷型按编号移接到琼脂平板格子中。培养后， 根据混浊圈出现情况，则可确定哪些缺陷型菌株是缺这种生长因子的。
2、夹层平板法：先在培养皿上倒一薄层基本培养基，凝固后再倒一层经过诱变 处理的菌液，其上再浇一层基本培养基；经培养后，对首次出现的菌落用记号 笔在皿底标记，然后再倒一层完全培养基，再培养，出现的形态较小的新菌落 ，多为缺陷型。
夹层平板法
3、限量营养法：如果试验的目的仅是检出营养缺陷型菌株，则其该法是将富集培养后的 细胞接种到含有0.01%蛋白胨的基本培养基上，培养后，野生型细胞迅速地长成大菌落， 在平皿底部作好颜色标记，而生长缓慢的小菌落可能是缺陷型，此称限量培养。如果试 验的目的是要定向筛选某种特定的缺陷型，则可在基本培养基中加入某种单一的氨基酸 、维生素或碱基等物质，称为补充培养。
酵母菌用制霉素法：制霉素作用于真菌细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长 繁殖过程的真菌，起到富集营养缺陷型的作用。
2、菌丝过滤法
真菌和放线菌等丝状菌的野生 型孢子在基本培养基中能萌发 长成菌丝，而营养缺陷型的孢 子则不能萌发。把诱变处理后 的孢子移入到基本培养液中， 振荡培养10h左右，使野生型孢 子萌发的菌丝刚刚肉眼可见， 用灭菌的脱脂棉、滤纸或玻璃 漏斗除去菌丝。继续培养，每 隔3~4h过滤一次，重复3~4次 ，最大限度地除去野生型细胞 。然后稀释、涂皿分离。