营养缺陷型菌株的筛选方法
分离、筛选、鉴定色氨酸营养缺陷型菌株
分离、筛选、鉴定色氨酸营养缺陷型菌株一、实验目的1、了解应用物理、化学因素对细菌进行诱变的方法2、初步掌握诱变产生营养缺陷型菌株的筛选与鉴定的方法技术，体会相应的科学理念。
二、实验原理1、诱变及诱变剂说明1.1利用化学、物理等诱变手段是微生物育种工作的常用手段主要有DNA碱基化学性质改变引起置换、插入移码、大片段畸变、碱基二聚体形成等，最终引起宜春啊信息复制之中的改变1.2本次试验利用紫外线进行诱变处理（主要是形成嘧啶二聚体，引起后续DNA复制错误，达到诱变的目的）1.3诱变后需要暗培养（防止光复活作用）1.4紫外线剂的控制---紫外灯的功率、照射距离、照射时间（需要前期试验确定，杀菌率在70%左右）2、营养缺陷型的培养生长情况营养缺陷型在完全培养基上生长良好，而在基本培养基上则不生长，未发生突变的野生型在两种培养基上都能生长（此为筛选的理论依据）三、实验材料菌种：大肠杆菌实验培养基：肉汤液体培养基（CM）；肉汤固体培养基（CMA）；2倍肉汤液体培养基（CM）；基本液体培养基（MM）；基本固体培养基（MM）；含色氨酸的基本培养基实验试剂：生理盐水，青霉素钠实验器材：10ML带盖离心管、10ml吸管、90mm培养皿、试管四、实验步骤1、菌种培养收集洗涤大肠杆菌接种于肉汤液体培养基，37℃静止培养18~24h无菌取10ml培养液放入无菌15ml离心管中，3500r/min 10min，弃上清液，留下菌体沉淀在上述沉淀中加入5ml无菌生理盐水，悬浮沉淀，备用2、诱变剂处理吸取上述洗涤悬液3ml，放至60mm培养皿中，摇晃成薄层。
将上述培养皿放在40w紫外灯下，距离30cm（处理前先开紫外灯稳定30min），灭菌1min，然后开盖处理5min。
照射完毕后，先盖上皿盖，再关紫外灯吸取3ml2倍肉汤培养液到上述处理后的培养皿中。
置于37℃恒温培养箱内，避光培养12h以上（此时是诱变后DNA复制形成纯合子过程）注意：紫外线防护，不要长时间暴露在其下3、淘汰野生型，浓缩缺陷型—基本培养基抗生素法：青霉素适用于细菌，制霉菌素适用于真菌菌丝过滤法：适用于丝状生长的真菌和放线菌4、鉴定色氨酸营养缺陷型持续观察，前后对照标记，在基本培养基上不生长，但是能在加了色氨酸的基本培养基上生长的便是色氨酸营养缺陷型菌株。
第2章 4 营养缺陷型菌株筛选
野生型菌株由于发生基因突变而丧失合 成一种或几种生长因子的能力,只有在基 本培养基中加入缺失的因子才能生长的 突变类型称为营养缺陷型.
几种基本培养基
• 基本培养基(MM):只能维持野生型菌株正 常生长的培养基. • 补充培养基(SM):在基本培养基中加入该 菌不能合成的生长因子后的培养基. • 完全培养基(CM):能满足各种营养缺陷型 生长的培养基.
试验物的配制 1 氨基酸混合物,酪素水解物或蛋白胨 2 酵母浸出液 3 维生素混合物 4 酵母核酸水解液
15种因子实验
组合编号 一 1 二 2 三 3 四 4 五 5 组合因子 2 3 4 6 7 8 7 10 11 8 11 13 9 12 14 5 9 12 14 15
21种因子实验设计
组合编号 组合营养因子 一 1 2 3 4 5 6 二 2 7 8 9 10 11 三 3 8 12 13 14 15 四 4 9 13 16 17 18 五 5 10 14 17 19 20 六 6 11 15 18 20 21
营养缺陷型菌株的分离和筛选
• • • • 诱发突变 淘汰野生型 检出缺陷型 鉴别缺陷种类
淘汰野生型(细菌 酵母菌等)
抗生素法:常用于细菌(青霉素)和酵母菌 (制霉菌素).其原理是青霉素能抑制细菌 细胞壁的合成,因而能杀死生长繁殖着的 细菌,但不能杀死处于休眠状态的细菌.制 霉菌素(与真菌细胞膜上的甾醇作用)适用 于真菌.
过滤法:适用于丝状菌.其原理是在基本培 养基中,野生型的孢子能发育成菌丝,而营 养缺陷型则不能.将诱变处理的孢子在基 本培养基中培养一段时间后,过滤掉菌丝 (可重复几次).剩下的孢子大部分为营养 缺陷型.
营养缺陷型的检出(点植对照法)
营养缺陷型菌株的筛选
CM
MM
３、夹层法
先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基， 凝固后涂上一层含菌的MM，凝固后再倒 一 薄 层 MM 琼 脂 培 养 基 ， 培 养 24h ， 将 出 现的菌落标记，然后倒上一层CM琼脂培养 基，再培养。这时第二批长出的菌落就可 能是缺陷型。
此法缺点是，结果有时不明确，而且将
（4）将CM和MM在恒温箱中培 养。
（5）二平皿相同方位进行比较， 即 可 发 现 在 MM 平 皿 上 长 出 的 菌落少于CM平板上的。MM上 未长而相应于CM上长出的那几 个菌落就可能是缺陷型。
此法要求平皿上菌落不能太多，
菌落之间应有一定间隔。
CM
MM
２、点种法
用接种针或牙签将CM上长出的菌 落在MM和CM两副平板上接种，依 次在相应位置点种，然后一起培养， 观察其生长情况。
MM
MM+F
无营养缺陷
CM
其他营养 缺陷
１、影印法
将一较平皿直 径小1cm的金 属圆筒蒙上一 层灭菌的丝绒， 用金属夹夹住， 灭菌。
完全培养基上 长出的全部菌 落在丝绒上轻 轻一压，使之 成为印模，标 记方位。
将基本培养基 平皿和完全培 养基平皿在标 记的同一方位 上先后轻轻一 压，此菌印模 即复印于上。
1、野生型菌株（wild type strain） 2、营养缺陷型（auxotroph）：
指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如 氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基 本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长 的变异株。 3、原养型（prototroph）：
营养缺陷型菌株经回复突变或重组变异后产生 的菌株，其营养要求在表型上相同。
与之有关的培养基有三类
芽孢杆菌营养缺陷型的筛选检出与鉴定
实验二、芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株的筛选、检出与鉴定一、实验目的掌握各种培养基的配制方法；理解选育营养缺陷突变株的选育原理；掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法；获得芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株并对其鉴定。
二、实验原理营养缺陷型是指野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源补加该营养物质,才能正常生长的一类突变菌株。
其本质是一种减低或消除末端产物浓度，以解除反馈控制的代谢调控中间产物或分支合成途径中末端产物得以积累。
营养缺陷型菌株广泛应用于氨基酸、核苷酸、维生素的生产中。
也广泛应用于基因定位、杂交及基因重组等研究中的遗传标记制作。
筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、淘汰野生型、营养缺陷型的检出、鉴定缺陷型[1]。
1.诱变处理基因突变可分为自发突变和诱发突变，许多物理、化学、生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂，对于氨基酸营养缺陷型的诱变常选用亚硝基胍。
亚硝基胍(NTG，N-甲基-N-硝基-亚硝基胍)为诱变剂，在低致死率的情况下又很强的诱变作用，有超诱变剂之称。
在碱性时NTG 能形成重氮甲烷(CH2N)、烷化DNA 而使基因突变：pH5-5.5 时，NTG 形成HNO2，本身也是诱变剂；pH 6.0 时，NTG 本身不变化，可作用于核蛋白而引起诱变效应。
它的主要作用是引起DNA链中GA向AT转变。
NTG 是—种超诱变剂，杀菌力较弱，诱变作用较强，其作用部位又往往在 DNA的复制叉处，易造成双突变。
一般选用NTG 处理时，诱变频率较高，可使百分之几十的细菌发生营养缺陷型突变。
NTG也是一种致癌因子，在操作时要特别注意，切勿直接与皮肤接触，凡有亚硝基胍的器皿都的要用1mol/LNaOH溶液浸泡，使残存的亚硝基胍分解破坏，然后清洗[2]。
2.淘汰野生型诱变处理后的个体，营养缺陷型的比例较低，可采用菌丝过滤法、抗生素法、高温杀菌法除去野生菌，从而达到浓缩营养缺陷型菌株的目的。
营养缺陷型菌株的筛选方法
营养缺陷型菌株的筛选方法
营养缺陷型菌株的筛选是一种重要的技术，主要应用于基因组学研究、菌种鉴定、病
原学研究及微生物资源保护。
营养缺陷型菌株是有针对性的，可作为正常菌株的突变体，
以提高实验在病原性、耐受性等方面的准确性。
因此，有效的筛选营养缺陷型菌株不容忽视。
营养缺陷型菌株的筛选包括实验法和非实验法两种。
实验法是采用固定条件，通过控
制外源营养物质完全缺乏或有限，使某一肽或多肽水平落到特定值，从而引起营养缺损型
菌株的筛选；非实验法则是依据基因数据库中发现的营养物质代谢路径分析，筛选出能够
诱导营养缺陷菌株的基因。
具体步骤如下：
1、构建营养培养基：根据需要，选择对营养缺陷型菌株的实验特异性的培养基，将
培养基进行稀释，以减少营养物质的含量。
2、处理营养缺陷型菌株：分离菌株，以营养缺陷型菌株为【测试菌】，无营养缺陷
的正常菌株为【对照菌株】。
3、培养对照菌株
将对照菌株接种于稀释的培养基中，摇匀，加热37℃翻转培养，室温培养12—18小时，待菌落出现，观察是否有正常菌落形成。
若有正常菌落出现，在16小时后再次观察，确定营养缺陷型菌株存在可能性。
5、数据分析：根据营养缺陷型菌株的表型分析结果，确定可能存在营养缺陷型菌株
的培养基形式，进行深入分析，以便更好地了解营养缺陷的突变机理。
营养缺陷型菌株的筛选是一项复杂的工作，仅依靠一种筛选方法是不够的，为了使筛
选更有效率和准确，应该综合使用上述多种筛选方法，全面分析各种可能的内因、外因对
营养缺陷型菌株发生的影响，以实现科学准确的筛选结果。
实验5-营养缺陷型菌株筛选及鉴定
实验五、营养缺陷型菌株筛选及鉴定1、实验名称营养缺陷型菌株筛选及鉴定2、实验操作人3、实验过程简述3.1 营养缺陷型菌株诱变3.1.1培养基的配制配置两种类型的培养基，营养丰富培养基（YPD）和基本培养基（SC），其中营养丰富的培养基在诱变的过程中用来培养菌株，在基本培养基中选择性的加入氨基酸来进行筛选，分别标记为：SC5 (SC+His+Trp+Leu+Lys+Ura)；SC5-Lys (SC+His+Trp+Leu+Ura) SC5-Leu (SC+His+Trp+Lys+Ura)；SC5-Trp (SC+His+Leu+Lys+Ura)；SC5-His (SC+Trp+Leu+Lys+Ura)；SC5-Ura(SC+His+Trp+Leu+Lys)。
3.1.2稀释涂布在超净台，取0.1 ml菌悬液转接到0.9 ml无菌水中，混匀后，取0.1 ml 稀释液转接到0. 9 ml无菌水中，混匀后，继续进行10倍的梯度稀释，稀释到10-6；取0.1 ml稀释度分别为10-4、10-5、10-6的菌悬液，加入到YPD固体平板上，用涂布棒涂布均匀，每个稀释度涂5块平板；3.1.3紫外诱变每个稀释度各取一块平板，培养皿底部标记好组号-稀释度-紫外处理时间，将平板适当垫高，防止诱变不充分，用紫外照射分别诱变处理0、30、45、60、120秒，黑布包好，置于30℃培养箱培养48h；记录各平板上的菌落数，计算不同处理的细胞致死率。
致死率（%）=1-（特定时间点平板上菌落数X稀释倍数）/（0时平板上菌落数X 稀释倍数）X100%3.2 营养缺陷型菌株初筛3.2.1选取单菌落小组内部四人分别标号为A/B/C/D（本人标号为A）,本次实验选用了两种敏感性不同的菌株，选取两种菌株内生长较好的平板，每个平板每人取3个单菌落（每人2菌×3个单菌落），用记号笔圈出标记为A1/A2/…A6防止重复挑取；取1.5ml离心管装入1ml无菌水，用接种环从YPD平板上挑取单菌落，转接到无菌水中，摇匀，室温静置2h；3.2.2点板在准备好的YPD、SC培养基平板底部做标记（培养基名称-组号）,将小组成员点菌位置画好格子；分别取一接种环菌悬液对应点于SC和YPD培养基平板上（每人1行，做好标记）；将培养皿倒置于30℃培养箱中，培养48h，注意无论涂板、还是点板，一定等菌液被培养基吸收后，再挪动或倒置；记录各单菌落在不同培养基上生长情况（生长记“+”，不生长记“-”），并拍照；根据生长情况，判断本实验各菌株是否为营养缺陷型菌株。
营养缺陷型菌株的筛选步骤和方法
营养缺陷型菌株的筛选步骤和方法
嘿，你知道营养缺陷型菌株是啥不？这玩意儿在科研和生产中可有着大用处呢！那怎么筛选营养缺陷型菌株呢？首先，咱得有个出发菌株，就像要找宝藏得先有个起点一样。
然后通过诱变处理，这就好比给菌株来个大变身，让它可能产生新的特性。
接着进行淘汰野生型，把那些不需要的家伙踢出去。
再进行检出缺陷型，这就像在一堆沙子里找金子，得仔细着呢！注意啊，整个过程中可不能马虎，每一步都得精准操作。
要是弄错了，那可就白忙活啦！
说到安全性，只要操作规范，那基本没啥问题。
稳定性嘛，筛选出来的菌株如果保存得当，那还是挺稳定的。
就像你把宝贝放在一个安全的地方，它就不会轻易丢啦！
那营养缺陷型菌株有啥应用场景呢？在生物制药、食品工业等领域都能大显身手。
它的优势可不少呢！比如可以用来研究代谢途径，就像侦探破案一样，通过它能找到生命的奥秘。
还可以作为遗传标记，帮助我们更好地了解生物的遗传特性。
举个实际案例吧！有个实验室在研究某种抗生素的生产，通过筛选营养缺陷型菌株，大大提高了抗生素的产量。
哇塞，这效果简直太棒了！
所以啊，营养缺陷型菌株的筛选真的很重要。
咱可得好好利用这个强大的工具，为科研和生产做出更大的贡献。
大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选
大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选生命科学学院09级生物技术1班余振洋200900140156指导老师：林建群同组者：潘红芳摘要营养缺陷型菌株是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段，在发酵工业上有广泛用途。
本实验以大肠杆菌原养型菌株为材料，计划通过诱变得到并筛选出营养缺陷型，从而了解细菌营养缺陷性的获得步骤并掌握氨基酸营养缺陷型的筛选方法和鉴别过程。
关键词营养缺陷，诱变，生长谱测定，大肠杆菌（E.coli）1．引言1.1 营养缺陷型营养缺陷型是指缺乏合成某种对自身生长繁殖所必须的营养物质（氨基酸、维生素、碱基等）的能力的突变型，只能从周围环境或培养基中获得这些物质或其前体物才能正常生长。
由于营养缺陷型不能合成某种末端产物，解除了合成代谢的反馈抑制作用，限量添加所需生长因子克服生长障碍后，可选择性大量合成积累所需的中间代谢产物。
因此，营养缺陷型在工业上有重要的应用价值。
营养缺陷型是由野生型突变产生，营养缺陷型经回复突变恢复野生表型得原养型。
1.2 紫外线诱变紫外线是一种短波光，波长介于100-400nm之间。
紫外线是一种非电离辐射诱变剂，照射物体时可使原子的内层电子能级提高，但不能使原子失去电子。
紫外线是微生物育种中最常用的诱变剂之一。
由于碱基间电子的相互作用，DNA分子在260nm处有最大的紫外吸收峰，因此决定了紫外线诱导细胞发生突变的有效波长为260nm。
15W紫外灯产生的紫外线中，80%集中在260nm左右，诱变效应良好。
低剂量紫外线可诱变获得较多的正突变，高剂量紫外线则易产生大量负突变，但可获得特性明显改变的突变菌株。
紫外线诱发突变的原理是使DNA同一链上的两相邻胸腺嘧啶之间发生交联，形成胸腺嘧啶二聚体。
在DNA复制时，相应核苷酸无法与胸腺嘧啶二聚体配对形成碱基对，DNA复制中断，引起突变。
当细胞中的DNA分子含有大量胸腺嘧啶二聚体时，SOS修复机制被激活，DNA被修复，但包含大量错配的碱基对，从而导致基因突变。
营养缺陷型突变株的筛选
营养缺陷型突变株的筛选一、与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体①营养缺陷型：原菌株由于发生基因突变,致使合成途径中某一步骤发生缺陷，失了合成某种代谢产物的能力，必须在培养基中外源补加该物质才能生长，这类突变菌株，叫营养缺陷型突变株，简称营养缺陷型。
②野生型：变异前的原始菌株。
③原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产性的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同，表示方法亦同野生型。
二、与筛选营养缺陷型有关的三类培养基①基本培养基：能满足某一菌种的野生型或原养型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。
②补充培养基：在基本培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长需要(其他营养缺陷型仍不能生长)的培养基。
③完全培养基：可满足该菌种各种营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基。
三、筛选营养缺陷型菌株的一般步骤和方法①诱变：变常用紫外线诱变形成大量营养缺陷型菌株。
②淘汰野生型a)抗生素法某些抗生素能杀死生长繁殖着的微生物，而对处于休止状态的微生物无杀伤作用。
如青霉素能抑制细菌细胞壁肽聚糖的生物合成。
b)菌丝过滤法适用于放线菌、霉菌等丝状微生物。
在基本培养基中野生型孢子能萌发长成菌丝体，而营养缺陷型孢子则不生长。
将经诱变处理的孢子接种于液态基本培养基中，振荡培养10h-12h, 使原养型萌发(以肉眼刚能看见菌丝为度)，然后以滤纸、棉花或玻璃过滤漏斗过滤，菌丝被滤除,未萌发的缺陷型孢子能顺利通过,从而达到富集营养缺陷型的目的。
③检出缺陷型的常用方法a)逐个测定法(点种法)：把经诱变处理并淘汰野生型后的菌液在完全培养基上涂布分离,将培养后长出的每一个菌落分别点种在基本培养基和另一个完全培养基上,凡在基本培养基上不能生长而在完全培养基的相应位置上能生长的菌落，表明其为营养缺陷型。
b)夹层培养法：经诱变处理后的菌液，稀释后与基本培养基混匀并倾入平板中，待凝固后，再加上一层不含菌的基本培养基。
营养缺陷型菌株筛选
营养缺陷型菌株的筛选采用辐射，化学试剂等因素处理细菌，以提高其变异几率，关键步骤是进行营养缺陷型微生物的筛选工作，营养缺陷型是指通过诱变产生的，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变株。
营养缺陷型的筛选与鉴定涉及下列几种培养基：基本培养基（MM，符号为[-]）是指仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。
完全培养基(CM，符号为[+])是指可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要的天然或半合成培养基。
补充培养基（SM，符号为[A]或[B]等）是指在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的合成或半合成培养基。
营养缺陷型菌株不仅在生产中可直接作发酵生产核苷酸、氨基酸等中间产物的生产菌，而且在科学实验中也是研究代谢途径的好材料和研究杂交、转化、转导、原生质融合等遗传规律必不可少的遗传标记菌种。
营养缺陷型的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节。
现分述如下：第一步，诱变剂处理：与上述一般诱变处理相同。
第二步，淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低。
通过以下的抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株即浓缩了营养缺陷型。
抗生素法有青霉素法和制霉菌素法等数种。
青霉素法适用于细菌，青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，杀死正在繁殖的野生型细菌，但无法杀死正处于休止状态的营养缺陷型细菌。
制霉菌素法则适合于真菌，制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。
在基本培养基中加入抗生素，野生型生长被杀死，营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来。
菌丝过滤法适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。
其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。
通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型。
第三步，检出缺陷型：具体方法很多。
营养缺陷型菌株的检出方法
营养缺陷型菌株的检出方法
营养缺陷型菌株是指由于缺乏一定的营养物质而在培养基上无法生长的微生物菌株。
营养缺陷型菌株通常需要添加特定的营养物质才能够在培养基上生长，因此对这类菌株的检出是非常重要的。
下面将介绍一些常见的营养缺陷型菌株的检出方法。
1.培养基筛选法
培养基筛选法是最常用的检出营养缺陷型菌株的方法之一。
该方法通过设计特定的培养基，只有符合特定营养要求的菌株才能够生长。
例如，对于缺乏特定氨基酸的菌株，可以设计一种缺乏该氨基酸的培养基，只有含有相应营养物质的菌株才能在该培养基上生长。
2.生化特性检测法
生化特性检测法是通过检测菌株的生化特性来区分不同类型的菌株。
对于营养缺陷型菌株，可以通过检测其在缺乏特定营养物质的条件下的代谢特性来确定其是否为营养缺陷型菌株。
例如，缺乏一种氨基酸的菌株在培养基上生长会产生特定的代谢产物，通过检测这些产物就可以确定该菌株是否为营养缺陷型菌株。
3.分子生物学方法
分子生物学方法在检出营养缺陷型菌株方面也具有重要的应用价值。
通过对菌株的基因组进行测序分析，可以发现其缺乏特定代谢途径的基因或者具有特定缺陷型基因的特征。
通过分析这些基因的表达情况可以确定菌株是否为营养缺陷型菌株。
总的来说，对于营养缺陷型菌株的检出需要综合运用培养基筛选法、生化特性检测法和分子生物学方法的手段。
通过综合应用这些方法可以快速、准确地检出营养缺陷型菌株，为菌株的鉴定和分类提供重要的帮助。
同时，对于一些工业应用、食品安全和环境监测等领域也有重要的意义。
营养缺陷型菌株的筛选方法课件
• 2、菌丝过滤法
• 真菌和放线菌等丝 状菌的野生型孢子 在基本培养基中能 萌发长成菌丝，而 营养缺陷型的孢子 则不能萌发。把诱 变处理后的孢子移 入到基本培养液中 ，振荡培养10h左右 ，使野生型孢子萌 发的菌丝刚刚肉眼 可见，用灭菌的脱
、限量营养法和影印接种法等
• 1、点植对照法：诱变后的孢子或菌体，经富集培 养，涂布分离在完全培养基平板进行培养，待菌落 孢子成熟后，用灭菌的牙签或接种针把每个菌落上 孢子或菌体分别接到基本培养基和完全培养基平板 上的相应位置，同时培养，然后观察对比菌落生长 情况。如果基本培养基上不生长而完全培养基相应 位置上生长的菌落，可能为营养缺陷型。挑取孢子 或菌体分别移接到基本培养基和完全培养基斜面上 ，进一步复证。该法可夹靠层性平板强法，但工作量大。
• 1、诱变培养
• 营养缺陷型的诱变方
• 2、淘汰野生型
• 3、检出营养缺陷型
• 4、鉴别缺陷种类，确 定生长谱
法和诱变因子与普通
诱变育种基本相同。
用于诱发营养缺陷型 的诱变剂有亚硝基胍, 紫外线,亚硝酸等,其中
亚硝基胍的诱发突变 率极高,一般可达10% 以上,另外,随着诱变剂
量的提高突变频率也 追加。
什么是营养缺陷ห้องสมุดไป่ตู้菌株？
• 经过人工诱变或自 然突变失去合成某 种营养（氨基酸， 维生素，核酸等） 的能力，只有在基 本培养基中补充所 缺乏的营养因子才 能生长的野生型菌 株。
大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选
大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选一、实验原理在以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理细菌，使基因发生突变，丧失合成某一物质(如氨基酸、维生素、核苷酸等)的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。
这样从野生型经诱变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。
筛选营养缺陷型菌株必须经过以下几个步骤:诱变处理、淘汰野生型、检出缺陷型、鉴定缺陷型。
由于本实验是以大肠杆菌为材料，所以根据细菌的特性分别说明筛选的步骤。
诱变剂的作用主要是提高突变频率，它分为物理和化学的二类。
物理诱变剂常用的有X射线、紫外线、快中子、γ射线等诱变处理首先是选择诱变剂，微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫外线。
诱变剂所处理的微生物，一般要求呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分布均匀，这样可以避免出现不纯的菌落。
用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应最灵敏。
2诱变处理必须选择合适的剂量，剂量的表示有二种，绝对剂量和相对剂量。
绝对剂量的单位以尔格/cm表示，一般用相对剂量。
相对剂量与三个因素有关，这三个因素是:诱变源和处理微生物的距离，诱变源(紫外灯)的功率，以及处理的时间。
前二个因素是固定的，所以通过处理时间控制诱变剂量。
各种微生物的处理最适剂量是不同的，须经预备实验确定。
经处理以后的细菌，缺陷型还是相当少的，必须设法淘汰野生型细胞，提高营养缺陷型细胞所占比例，以达到浓缩缺陷型的目的。
细菌中常用的浓缩法是青霉素法。
青霉素是杀菌剂，它只杀死生长的细胞，对不生长的细胞没有致死作用。
所以在含有青霉素的基本培养基中野生型能长而被杀死，缺陷型不能长被保存得以浓缩。
检出缺陷型的方法有逐个测定法、夹层培养法、限量补给法、影印培养法。
这里主要以逐个测定法为例进行说明。
把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上。
凡是在基本培养基上不能生长而在完全培养基上能长的菌落就是营养缺陷型。
筛选营养缺陷型菌株的方法
工业微生物菌种的选育——营养缺陷型菌株的筛选来源：青岛海博关于菌株的几个概念：野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。
营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。
原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同。
关于培养基：基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用[－]来表示。
完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。
用[＋]来表示。
补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。
（一）、营养缺陷型菌株的分离和筛选一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。
1、营养缺陷型的诱发营养缺陷型的诱变方法和诱变因子与普通诱变育种基本相同。
2、淘汰野生型在诱变后的存活菌体中营养缺陷型菌株的数量很少，一般仅占存活菌体的百分之几或千分之几，而野生型细胞却大量存在，因而要采取一些措施，尽量淘汰野生型细胞，使缺陷型菌株得以富集，以利于检出。
淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。
（1）抗生素法：细菌用青霉素法：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。
处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处休止状态的细菌。
将诱变处理后的菌悬液分离加有抗生素的基本培养基上，培养后野生型细胞由于正常生长繁殖而被杀死，营养缺陷型细胞因不能生长而被保留下来，达到富集目的。
酵母菌用制霉素法：制霉素作用于真菌细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集营养缺陷型的作用。
营养缺陷型菌株筛选课件
在环境保护领域的应用
环境保护领域中，营养缺陷型菌株可用于污染物的降解和 治理。通过基因工程技术，将污染物降解酶编码基因导入 营养缺陷型菌株中，使其在缺乏特定营养物质的情况下仍 能降解污染物，从而实现对环境污染的治理和修复。
例如，在生产乙醇、丁醇等生物燃料时，可以通过营养缺陷型菌株的筛选，找到 在缺乏某种特定营养物质的情况下仍能高效发酵的菌株，从而提高生产效率和降 低成本。
在生物制药领域的应用
生物制药领域中，营养缺陷型菌株可用于药物的筛选和优化。 通过基因工程技术，将药物合成酶编码基因导入营养缺陷型 菌株中，使其在缺乏特定营养物质的情况下仍能合成药物， 从而实现对药物合成的精确调控。
营养缺陷型菌株的保存与扩增
保存方法
选择适当的保存方法，如冷冻干燥法、液氮冷冻法等，确保营养缺陷型菌株长 期保存不失活。
扩增培养
对筛选得到的营养缺陷型菌株进行扩增培养，获得大量用于后续实验的菌体。
03 实验操作与注意事项
实验材料准备
培养基
选择适当的培养基配方，以满足 营养缺陷型菌株的生长需求。
菌种
此外，随着合成生物学和进化工程等领域的不断发展，未来对营养缺陷型菌株的应用将更加广泛和深入。通过合成生物学技 术，可以设计和构建具有特定功能的微生物细胞工厂；通过进化工程技术，可以定向进化菌株的适应性和代谢能力，从而为 解决能源、环境、医疗等领域的问题提供更多可能。
THANKS
化学诱变
使用化学诱变剂如硫酸二 乙酯、甲基磺酸乙酯等处 理菌株，促使基因突变。Fra bibliotek生物诱变
适用表解法概括一下营养缺陷型菌株的主要步骤和方法
适用表解法概括一下营养缺陷型菌株的主要步骤和方法以下是营养缺陷型菌株筛选的主要步骤和方法：
1. 诱变处理：使用诱变剂处理细菌，使其发生基因突变。
这一步通常与一般的诱变处理相同。
2. 淘汰野生型：通过特定的方法淘汰野生型菌株，如抗生素法和菌丝过滤法。
抗生素法能够杀死野生型菌株，达到浓缩营养缺陷型菌株的目的。
菌丝过滤法则利用野生型菌株和营养缺陷型菌株在孢子发芽成菌丝方面的差异，通过滤孔较大的檫镜纸过滤，除去大部分野生型菌株，从而达到浓缩营养缺陷型菌株的目的。
3. 检出缺陷型：通过特定的方法检出营养缺陷型菌株，如夹层培养法、限量补充培养法和逐个检出法等。
4. 鉴定缺陷型：利用生长谱法对检出的缺陷型进行鉴定，确认其营养缺陷性。
这些步骤和方法仅供参考，请注意在实际操作时还需要考虑各种因素。
同时建议阅读微生物学相关书籍或请教专业人士，获取更准确的信息。
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夹层平板法
3、限量营养法：如果试验的目的仅是检出营养缺陷型菌株，则其该法是将富集培养后的 细胞接种到含有0.01%蛋白胨的基本培养基上，培养后，野生型细胞迅速地长成大菌落， 在平皿底部作好颜色标记，而生长缓慢的小菌落可能是缺陷型，此称限量培养。如果试 验的目的是要定向筛选某种特定的缺陷型，则可在基本培养基中加入某种单一的氨基酸 、维生素或碱基等物质，称为补充培养。
超阻遏突变体（表现为营养缺陷型）
营养缺陷型菌株的分离和筛选
4个步骤： 1、诱变培养 2、淘汰野生型 3、检出营养缺陷型 4、鉴别缺陷种类，确定生长谱
一、诱变培养
营养缺陷型的诱变方法和诱变因子 与普通诱变育种基本相同。用于诱 发营养缺陷型的诱变剂有亚硝基胍, 紫外线,亚硝酸等,其中亚硝基胍的 诱发突变率极高,一般可达10%以上 ,另外,随着诱变剂量的提高突变频 率也追加。
3、高温杀菌法
利用芽孢杆菌类的芽孢和营养 体对热敏感性的差异，让诱变 后的细菌形成芽孢，然后把处 在芽孢阶段的细菌移到基本培 养液中，振荡培养一定时间， 野生型芽孢萌发，而营养缺 陷 型芽孢不能萌发。此时将培养 物加热到80℃，维持一定时间 ，野生型细胞大部分被杀死， 缺陷型则得以保留，起到了浓 缩作用。
营养缺陷型的鉴定
1、缺陷类别的测定
通常分别用以下物质来代表氨基酸、维生素、核酸碱基：
①氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨，代表氨基酸类
②酵母浸出液，基中氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶均有
③维生素混合物，代表维生素类
④核酸碱基混合液，代表嘌呤、嘧啶类。
将待测微生物从斜面上用生理盐水或缓冲液乔洗下来，离心洗涤，制成浓度为 106~108ml-1菌悬液 ，取0.1ml加入到基本培养基中，混匀倒入平皿，制成平板。凝固后，用加圆滤纸分别浸湿沾取以上 四类代表物质，覆于平板标定的位置上。培养后，观察圆滤纸片周围菌株生长情况，如出现混浊的 生长圈，就可初步确定缺陷型所需的生长因子属于哪一类别，进一步复证。
二、淘汰野生菌株
在诱变后的存活菌体中营养缺陷型菌株的数量很少，一般仅占存活菌体的百分之几或千 分之几，而野生型细胞却大量存在，因而要采取一些措施，尽量淘汰野生型细胞，使缺 陷型菌株得以富集，以利于检出。
淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。
1、抗生素法：
细菌用青霉素法：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之 间的交链，阻止合成完整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而 被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处休止状态的细菌。将诱变处理后的菌悬液分离加有 抗生素的基本培养基上，培养后野生型细胞由于正常生长繁殖而被杀死，营养缺陷型细 胞因不能生长而被保留下来，达到富集目的。
2、缺陷型所需生长因子的测定
缺陷型菌株和基本培养基混合制成平板，把5组或6组生长因子直接加于同一琼脂平板上，或用滤纸 片沾取后覆于琼脂平板上，培养后，观察哪一组或哪两组区产生混浊生长圈，即可确定该菌株缺陷 的生长因子。如果要测定数十或上百个缺陷型菌株时，则可改成一个平皿中加入一种生长因子，制 成平板，在翻转平皿底部，几十个方格子，把每株缺陷型按编号移接到琼脂平板格子中。培养后， 根据混浊圈出现情况，则可确定哪些缺陷型菌株是缺这种生长因子的。
营养缺陷型菌株的筛选方法
主讲人：张波 制作：张烨 许洋 材料收集：徐正炀 车通 周浩
什么是营养缺陷型菌株？
经过人工诱变或自然突变失去 合成某种营养（氨基酸，维生 素，核酸等）的能力，只有在 基本培养基中补充所缺乏的营 养因子才能生长 的 野生型菌株 。
它是一种生化突变株，它的出 现是由基因突变引起的。遗传 信息的载体是一系列为酶蛋白 编码的核酸系列，如果核酸系 列中某碱基发生突变，由该基 因所控制的酶合成受阻，该菌 株也因此不能合成某种营养因 子，使正常代谢失去平衡。
Байду номын сангаас
营养缺陷型菌株的检出
营养缺陷型菌株的检出方法有：点植对照法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等
1、点植对照法：诱变后的孢子或菌体，经富集培养，涂布分离在完全培养基平 板进行培养，待菌落孢子成熟后，用灭菌的牙签或接种针把每个菌落上孢子或 菌体分别接到基本培养基和完全培养基平板上的相应位置，同时培养，然后观 察对比菌落生长情况。如果基本培养基上不生长而完全培养基相应位置上生长 的菌落，可能为营养缺陷型。挑取孢子或菌体分别移接到基本培养基和完全培 养基斜面上，进一步复证。该法可靠性强，但工作量大。
4、影印接种法
经富集后的孢子或菌体分离在完全培养 基培养至菌落成熟（母皿 ） ， 用灭菌后 的特制“丝绒印模”在母皿平板菌落上轻 轻一印，再转印到方位相同的另一基本 培养基和完全培养基的平板上。培养后 观察比较菌落生长情况，凡是在基本培 养基上不生长，而在完全培养基上生长 的菌落，分别移接到以上两种培养基斜 面上进一步复证。另外还可采用更简便 的方法，以上印模从母皿中沾上菌体细 胞后，仅影印在基本培养基平板上，培 养后，生长的菌落情况与存放于冰箱的 母皿菌落比较即可检出营养缺陷型。本 法适用于细菌、酵母菌，其次对小型菌 落的放线菌和霉菌也适用。
酵母菌用制霉素法：制霉素作用于真菌细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长 繁殖过程的真菌，起到富集营养缺陷型的作用。
2、菌丝过滤法
真菌和放线菌等丝状菌的野生 型孢子在基本培养基中能萌发 长成菌丝，而营养缺陷型的孢 子则不能萌发。把诱变处理后 的孢子移入到基本培养液中， 振荡培养10h左右，使野生型孢 子萌发的菌丝刚刚肉眼可见， 用灭菌的脱脂棉、滤纸或玻璃 漏斗除去菌丝。继续培养，每 隔3~4h过滤一次，重复3~4次 ，最大限度地除去野生型细胞 。然后稀释、涂皿分离。