第二十一单元--第七章微生物遗传学(三)
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第七章微生物遗传复旦大学普通微生物学课件
（二）噬菌体的感染实验
1953年美国人Hershey和Chase用放射性同位素方法，提 供了DNA是噬菌体遗传物质的直接证据。
用含32P和35S的培养基培养大肠杆菌H，再用被标记的大肠 杆菌Ｈ培养Ｔ2噬菌体，直至完全标记上32P和35S的T2噬菌体为 止。用标记的T2噬菌体侵染没有标记的大肠杆菌Ｈ，结果表 明，Ｔ2噬菌体外壳蛋白中有35S放射性并与细菌的细胞壁连接， 而DNA部分则有32P放射性并进如细菌的细胞质中。这一事实说 明，在噬菌体侵染细菌过程中蛋白质外壳留在细菌细胞外， 只有DNA进入了细胞，又一次证明遗传物质是DNA，而不是蛋 白质。
降解质粒以其所分解的底物命名，例如， CAM（樟脑）质粒， OCT（辛烷）质粒， XYL（二甲苯）质粒， SAL（水杨酸）质粒， MDL（扁桃酸）质粒， NAP（萘）质粒， TOL（甲苯）质粒等
“超级菌”
通过遗传工程手段构建 具有数种降解质粒的菌 株，具有广谱降解能力 的工程菌。
（一）转化实验 最早进行转化（transformation）实验的是F. Griffith（
真核生物的基因一般无操纵子结构。
大肠杆菌基因组
4100个基因，4.7×106bp 遗传信息的连续性,共价、闭合、环状 功能相关的结构基因组成操纵子 结构基因单拷贝及rRNA多拷贝 基因的重复序列少而短
质粒——原核生物遗传物质存在的一种方式
质粒：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞
质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。
（2）R质粒（R plasmid）
称R因子（R factor）、抗性因子（ resisitrance plasmid ），包括抗 药性和抗重金属二大类
R质粒一般由两个相连的DNA片段组成
《微生物学》教学课件：07 微生物的遗传变异和育种
4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝；
5）基因组的重复序列少而短；
注：古生菌的基因组在结构上类似于细菌。但是信息 传递系统(复制、转录和翻译)则与细菌不同而类 似于真核生物。
四、微生物的基因组结构
第二节 遗传的物质基础
3. 真核微生物的基因组（啤酒酵母）
1）典型的真核染色体结构；
啤酒酵母基因组大小为13.5×106bp，分布在16条染色体中。
有关内容在讲细菌的接合作用 （conjugation）时具体介绍
五、质粒
第二节 遗传的物质基础
3. 质粒的主要类型——抗性因抗子性质粒在细菌间的传递 抗性因子（Resistance factor是，细R因菌子产）生抗药性的重要 包括抗药性和抗重金属二大原类因之一。
R100质粒(89kb)可使宿主对 下列药物及重金属具有抗性：
编码细菌素的结构基因及相关的基因一般位 一般无直接的结构基因，相关酶的基因多在
于质粒或转座子上
染色体上
细菌素结构基因、 涉及细菌素运输及发挥作用（processing） 的蛋白质基因、赋予宿主对该细菌素具有“免疫力”的相关产 物的基因
一般都位于质粒或转座子上，因此，细菌素可以杀死 同种但不携带该质粒的菌株。
长发育所表现出来的形态等生物学特征的总和。
表型由遗传型决定，但也和环境有关
一、遗传变异是微生物的基本第特一征节 微生物遗传变异概述
表型饰变：
即外表的修饰性改变，是发生在转录、转译水平上 的变化，不涉及遗传物质结构改变的表型变化。
特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为
橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳。
第二节 遗传的物质基础
• 通常以共价闭合环状(covalently closed circle，简 称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；
微生物遗传学课件
基因组学定义
基因组学是研究生物体基因组的学科，包括基因的发现、基因组结构、基因表达调 控以及基因组进化的研究。
基因组学研究旨在揭示生物体的遗传信息，以及这些信息如何影响生物体的表型和 功能。
基因组学研究对于理解生命的本质、疾病的发生和发展机制以及新药的研发等方面 具有重要意义。
基因组学研究方法
基因组测序
生物修复
生物修复
利用微生物对环境污染进行治理和修复的 技术，具有处理效果好、成本低等优点。
生物修复的应用
在土壤、水体、空气等污染治理领域广泛 应用，有效解决了许多环境问题，改善了
人类生存环境。
生物修复的原理
通过微生物对污染物的降解、转化和富集 等作用，将污染物转化为无害或低毒性的 物质，降低其对环境和人体健康的危害。
程，涉及到多种酶的参与。
转座重组
指DNA分子内部的转座元件在不 同位置之间移动的重组过程。转 座重组需要转座酶的催化，实现 DNA片段在不同位置的复制和移
动。
Hale Waihona Puke 突变与重组在微生物遗传学中的应用
基因工程
通过突变和重组技术，可以对微 生物进行基因敲除、敲入和基因 修饰，实现基因表达的调控和代
谢途径的改造。
微生物遗传学课件
目 录
• 微生物遗传学概述 • 微生物基因组学 • 微生物突变与重组 • 微生物基因表达调控 • 微生物进化与系统发育 • 微生物遗传学应用
01 微生物遗传学概述
微生物遗传学定义
微生物遗传学定义
微生物遗传学是一门研究微生物遗传、变异和演化的科学，主要关注微生物的基因组结构 、基因表达调控、基因突变与进化等基本问题。
通过调节翻译起始和翻译过程 来控制蛋白质的合成，如核糖 体结合位点的选择和mRNA的 稳定性等。
微生物学：第七章微生物的遗传和变异
第二节、微生物的突变
基因突变
染色体畸变
DNA损伤的修复
概念
突变：指遗传物质发生数量或结构变化的现象。 变异：突变导致性状的改变叫变异。 基因突变：指一个基因内部遗传物质结构或 DNA序列的任何变化，包括一对或少数几对的 缺失、插入或置换，导致遗传性状的变化。 基因型：指贮藏在遗传物质中的信息，即DNA 碱基序列。 表型：指可观察或检测到的个体性状或特征，是 特定的基因型在一定环境条件下的表现。
实验室里通过提取获得 双链ＤＮＡ有转化能力，单链没有.
感受态
受体细胞能接受转化的生理状态称为感受态， 只有处于感受态的细菌才能接受转化因子， 从出现到消失约为４０分钟(对数期的中期)
感觉态出现原因
细菌失去部分细胞壁的结果 细菌在细胞表面产生某种Ｅ引起
感受态的决定决定因素
细胞遗传性决定 和菌龄有关 环腺苷酸CAMP可提高1000 倍 Ca2+能促使细胞进入感受态
原理 步骤
DNA只含P不含S
Pr 只含S不含P
1：用含同位素Ｓ35, P32的培养基培养大肠杆菌 2：让T2感染上述大肠杆菌使其打是S35P32标记
3： 吸附
10分钟后 搅动
离心
上清液 沉淀
结果：上清液中含15%放射击性；沉淀中含85%放射性
植物病毒的重建实验
植物病毒蛋白质和RNA可以人为地分开, 同时又可把它们重新组合成具感染性的病毒.
喷入T1保温
6个平板共353个菌落
6个平板共28个菌落
影印培养试验
原始敏 感菌种
无药 培养基
含药 培养基
基因突变机制
碱基的置换 移码突变
染色体畸变
1 诱变的机制
(1)碱基的置换
【生物课件】第七章微生物遗传
• 将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能 将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后 的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感 染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还 能分离出正常病毒粒子。
2020/12/18
选用TMV和霍氏车前花叶病毒（ HRV ） ， 分 别 拆 分 取 得 各 自 的 RNA 和 蛋 白 质 ， 将 两 种 RNA 分 别 与 对 方 的 蛋 白 质 外
三、微生物基因组结构的特点
（参见 P197-200）
1、原核生物（细菌、古生菌）的基因组
1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；
例外：布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的染色体是线状的
链环状的染色体在细胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式 存在于细胞中，该小体称为拟核(nucliod)，其上结合有类组蛋白蛋 白质和2020少/12/量18 RNA分子，使其压缩成一种手脚架形的致密结构。
后基因组时代（Postgenome Era）
2020/12/18
二、微生物与人类基因组计划
第二节 微生物的基因组结构
（参见 P197）
微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的， 最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学 的最有力的手段。
/tdb/mdb/mdb.html
•
分离
活的SIII菌
2020/12/18
Griffith 转化试验
示意
RII型活菌
SIII型活菌
健康 健康
健康 病死
SIII型热死菌
健康 健康
健康 病死
RII型活菌
健康
病死
2020/12/18
混合培养 SIII型活菌
2020/12/18
选用TMV和霍氏车前花叶病毒（ HRV ） ， 分 别 拆 分 取 得 各 自 的 RNA 和 蛋 白 质 ， 将 两 种 RNA 分 别 与 对 方 的 蛋 白 质 外
三、微生物基因组结构的特点
（参见 P197-200）
1、原核生物（细菌、古生菌）的基因组
1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；
例外：布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的染色体是线状的
链环状的染色体在细胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式 存在于细胞中，该小体称为拟核(nucliod)，其上结合有类组蛋白蛋 白质和2020少/12/量18 RNA分子，使其压缩成一种手脚架形的致密结构。
后基因组时代（Postgenome Era）
2020/12/18
二、微生物与人类基因组计划
第二节 微生物的基因组结构
（参见 P197）
微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的， 最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学 的最有力的手段。
/tdb/mdb/mdb.html
•
分离
活的SIII菌
2020/12/18
Griffith 转化试验
示意
RII型活菌
SIII型活菌
健康 健康
健康 病死
SIII型热死菌
健康 健康
健康 病死
RII型活菌
健康
病死
2020/12/18
混合培养 SIII型活菌
微生物遗传与育种(精美课件)
第七章
微生物遗传与育种
第一节 微生物遗传的物质基础
h
2
一、遗传物质化学本质的确证
1、DNA（或RNA）是遗传信息的携带者 三个经典实验
细菌转化实验 噬菌体感染实验 病毒重建实验
h
3
细菌转化(transformation)试验
1928年，英国F. Griffith发现 研究对象
Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌） S型（光滑型）菌株：有致病性，菌落表面 光滑，有荚膜 R型（粗糙型）菌株：无致病性，菌落表面 粗糙，无荚膜
h
36
特殊病毒（Mu噬菌体）
与其他温和性噬菌体的差别：其基因组不论在 进入裂解周期或处于溶源状态都可随机整合到 宿主染色体的任何位置，且游离的和已整合的 基因次序是相同的。
没有固定的整合位置
h
37
转座子的遗传 效应
遗传效应
插入突变 DNA重排 极性效应
第四节 基因突变与遗传育种
h
21
真核生物基因的结构
一般无操纵子结构 存在大量不编码序列和重复序列 转录和转译在细胞中有空间间隔 基因被许多无编码功能的内含子阻隔，使编码
序列变成了不连续的外显子。
h
22
二、基因组
基因组（genome）
单倍体细胞中所含的全套遗传物质
大多数细菌和噬菌体基因组是指单个染色体 上所含的全部基因
IS与Tn主要区别
Tn携带有与转座无关的抗性基因或其它特性基因
h
34
细菌抗药性转座子的两种类型
复合转座子 基因组成的复合因子。
h
35
复杂转座子
两端具有IR或DR，而不是IS，中部的编码区不仅编 码抗性标记，还编码转座酶和解离酶。
微生物遗传与育种
第一节 微生物遗传的物质基础
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2
一、遗传物质化学本质的确证
1、DNA（或RNA）是遗传信息的携带者 三个经典实验
细菌转化实验 噬菌体感染实验 病毒重建实验
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3
细菌转化(transformation)试验
1928年，英国F. Griffith发现 研究对象
Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌） S型（光滑型）菌株：有致病性，菌落表面 光滑，有荚膜 R型（粗糙型）菌株：无致病性，菌落表面 粗糙，无荚膜
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36
特殊病毒（Mu噬菌体）
与其他温和性噬菌体的差别：其基因组不论在 进入裂解周期或处于溶源状态都可随机整合到 宿主染色体的任何位置，且游离的和已整合的 基因次序是相同的。
没有固定的整合位置
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37
转座子的遗传 效应
遗传效应
插入突变 DNA重排 极性效应
第四节 基因突变与遗传育种
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21
真核生物基因的结构
一般无操纵子结构 存在大量不编码序列和重复序列 转录和转译在细胞中有空间间隔 基因被许多无编码功能的内含子阻隔，使编码
序列变成了不连续的外显子。
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22
二、基因组
基因组（genome）
单倍体细胞中所含的全套遗传物质
大多数细菌和噬菌体基因组是指单个染色体 上所含的全部基因
IS与Tn主要区别
Tn携带有与转座无关的抗性基因或其它特性基因
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34
细菌抗药性转座子的两种类型
复合转座子 基因组成的复合因子。
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35
复杂转座子
两端具有IR或DR，而不是IS，中部的编码区不仅编 码抗性标记，还编码转座酶和解离酶。
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1. 从生产中选育 2. 定向培育优良品种 一般指用特定因素长期处理微生物群体，同时不断地 对它们进行移种传代，以达到积累并选择相应的自发突变 株的目的。 例：卡介苗（牛型结核分枝杆菌的减毒活菌苗）
第六节 原核生物的基因重组
基因重组（gene recombination）： 将两个不同性状个体的基因通过一定的方式转移到一 起，并发生重新组合，产生新的遗传性状的过程，称 为基因重组(gene recombination)或遗传重组。 重组：遗传物质在分子水平上发生的交换； 杂交：在细胞水平上遗传物质的交换. 杂交必然包含着重组，但重组不仅限于杂交这一形式。
2.诱变及化学致癌物质的检测——Ames实验 3.DNA损伤的修复
第五节 微生物的诱变育种
一、诱变育种中的几个原则
指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变 率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。
2个主要环节： 诱变（随机） 选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀 、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞 致死的同时，使存活个体中的突变频率大大 提高。
（五）突变株的筛选
1. 初筛（以量为主） 方法需简便、快速
2步
初筛 复筛
（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性 （2）根据平板颜色反应直接挑选 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）； 抑菌圈法（抗生素）； 变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）； 沉淀圈法（外毒素） 透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标） 2. 复筛（以质为主，定量测定） 摇瓶培养，直接检测所需产物
感受态细胞（competent cell） ：具有摄取外源
受细菌自身的基因控制 DNA能力的细胞
（如肺炎链球菌的感受态出现在对数生长期）
人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有
自然遗传转化（natural genetic transformation）
人工转化（ artificial transformation ） 摄取DNA 的能力，或人为地将 DNA导入细胞内。
化合物代号 1 2 3 4 5 5 6 7 8 9 6 10 10 11 12 13 7 11 14 14 15 16 8 12 15 17 17 18 9 13 16 18
5
（3）营养缺陷型的用途 • 生产菌 (氨基酸、核苷酸、维生素等高产菌需求)； • 研究代谢途径和杂交、转化等遗传规律的遗传标记。
加抗生素(或菌丝过滤)，培养过夜
③ 营养缺陷型的检出
夹层培养法 限量补充培养法 逐个检出法 影印平板法
方法
④ 营养缺陷型的鉴定
生长谱法： 分两步：
快速，直观
a.三大类营养要求（氨基酸、维生素、核苷酸）的鉴定 b.具体到某一种营养要求的鉴定(哪一种氨基酸,哪一种 维生素,或哪一种碱基)
具体操作:一般采用“滤纸片法”
筛选（定向）
设计有效的筛选方法，将少量正变株中的 优良菌株挑选出来。
（一） 出发菌株（original strain）
出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。 出发菌株的选择标准： • 具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、 标记明显等）； • 对诱变剂敏感 出发菌株的来源： •野生型菌株； •从生产中选育的自发突变菌株； •诱变获得的高产菌株
• (2) 转化过程
ds DNA 供体(strR) 感受态受体(strS) 酶解与吸收单链
转化因 子进入 细胞 转化因 子单链 配对与 整合
同源区段配对
单链整合
复制与分离
复制
分离
பைடு நூலகம்非转化子(strS)
感受态因子： 调节感受态的一类特异蛋白，它包括三种主要 （该过程与细菌自身的遗传控制无关！）
成分：膜相关DNA结合蛋白、细胞壁自溶素和几种核酸酶。
进行自然转化，需要二方面必要的条件：
（1）建立了感受态的受体细胞 （2）外源游离DNA分子
感受态的机理研究： 局部原生质体化假说：
处于感受态的细胞局部失去了细胞壁，使外源DNA能顺利经膜 进入菌体。
三大类营养要求的鉴定： a. 不含维生素的酪素水解液或氨基酸混合液或蛋白胨 b. 水溶性维生素混合液 c. 0.1%碱水解酵母核酸液
a
b
c
单一营养物质要求的鉴定：
组 以氨基酸缺陷为例进行说明 别 将18种氨基酸按右表分为6组 1 2 特点：每2组只有一种共同物质 3 1 4 5 6 2 6
3 4
（二） 菌悬液的制备
1. 选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散） 目的：①使每个细胞能均匀接触诱变剂； ②减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象） 2. 同步培养（生理状态一致） 3. 菌龄：对诱变剂最敏感时期 4.菌悬液的制备方法 营养细胞：对数期 孢子或芽孢：萌发前期
物理诱变：生理盐水配制 化学诱变：缓冲液配制 酵母菌，霉菌的孢子：106个/mL 细菌，放线菌孢子：108个/mL
如：异烟肼（“雷米封”）是吡哆醇的结构类似物 ，利用含异烟肼梯度平板筛选异烟肼抗性突变株， 可达到定向培育吡哆醇高产突变株的目的。 加入不含异烟肼的底层 敏感
菌苔
为什么在筛选突变株时 ,不能直接用代谢产物, 抗性 菌落 而必须用其结构类似物 ? 加入含异烟肼的上层
2. 营养缺陷型突变株的筛选
（1）几个概念： 三类培养基： 基本培养基（MM, minimal medium）[-]： 某野生型能生长的最低成分的组合培养基。 完全培养基（CM,complete medium）[+]： 各种营养缺陷型能生长的天然或半组合培养基 补充培养基（SM, supplemental medium）[A]:[-]+A [B]:[-]+B 相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基
酶受体假说：
受体细胞表面出现了一种能结合DNA并使之进入细胞的酶。
2. 转化模型
（1）转化因子 本质是离体的 DNA片断或质粒 DNA 。转化因子进入细胞前 还会被酶解成更小的片段，约8kb。在不同的微生物中，转化因 子的形式不同，dsDNA,ssDNA. 革兰氏阴性的嗜血杆菌中，细胞只吸收dsDNA形式的转化因 子，但进入细胞后需经酶解为ssDNA，才能与受体菌的基因组整 合； 革兰氏阳性的链球菌和芽孢杆菌中，dsDNA的一条链必须在 胞外降解，只有ssDNA形式的转化因子才能进入细胞。 但不管何种情况，最易与细胞表面结合的仍是dsDNA。 由于每个细胞表面能与转化因子相结合的位点有限（如肺 炎链球菌约10个），因此，从外界加入无关的dsDNA就可竞争并 干扰转化作用。 质粒 DNA也是良好的转化因子，但它们通常并不能与核染 色体组发生重组。 转化的频率通常为0.1％～1％，最高为20％。
在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为70~75%, 甚至 30~70%的剂量。
UV的剂量: 固定UV功率和照射距离,以照射时间长短来 确定剂量多少。
3. 诱变处理方法
单因素处理或多因素的复合处理： ①同一诱变剂的重复使用； ②两种或多种诱变剂的先后使用； ③两种或多种诱变剂的同时使用.
（四） 中间培养（CM，培养过夜）
诱变育种的程序：实验讲义p174
出发菌株（纯化） 前培养（ CM ，培养至对数期） 菌悬液制备 活菌计数
诱变预备实验（剂量存活率曲线） 诱变处理（相对杀菌率为70-75%，30-70%） 活菌计数 中间培养（CM，培养过夜，克服表型延迟） 突变株分离 初筛 复筛 生产性能试验 菌种（鉴定与）保藏
三、自发突变与育种
目前已知有二十多个种的G+和G-细菌具有自然转化的能力 此过程可以发生在土壤和海洋环境中，可能是自然界遗传交 换的重要方式。
1. 感受态 自然感受态与人工感受态的不同？
自然感受态
感受态：是指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化 的一种生理状态。一个细菌能否出现感受态是由其遗传性决 的出现是细胞一定生长阶段的生理特性 定的，但受环境条件的影响也很大，因而表现差别很大。
（2）筛选步骤（5步）
诱变处理 中间培养 淘汰野生型 检出缺陷型
鉴定缺陷型
①中间培养
CM或SM培养基，培养过夜。克服表型延迟。
②淘汰野生型 方法
即浓缩缺陷型，以提高检出率
抗生素法（G+细菌：青霉素；酵母菌和霉菌：制霉菌素） 菌丝过滤法（丝状真菌、放线菌） 饥饿培养（无N）MM 6~12 h 2N培养(2N)MM 1~2 h
目的：克服表型延迟 表型延迟（phenotypic lag）：表型的改变落后于基因型改变的 现象. 分离性延迟： 突变的基因经 DNA复制和细胞分裂后变成纯 分离性延迟的原因 : 对数生长期中，单核细胞常出现双核 现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突 合状态，表型才能表现出来。 变通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过 生理性延迟: 由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能 生理性延迟的原因 生理性延迟： : 当变异细胞由杂合状态变为纯合状态 一代或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现 时,由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用 ,必 表现出来。 象称为分离延迟现象。 须经过细胞多代分离后,才能将这些非变异的酶稀释掉,最终 达到变异后应该表现的形态,如营养缺陷型突变株的筛选过 程。
第一节 遗传变异的物质基础 第二节 质粒 第三节 基因突变的规律及类型
1. 突变的定义 2.基因突变的特点(规律) 自发性\不对应性\独立性\稀有性\可诱变性\稳定性\可逆性 3.证明基因突变自发性和不对应性的实验证据 4.基因突变的类型
第四节 基因突变的机制
1.基因突变的分子基础
自发突变 诱发突变(化学诱变/物理诱变/生物诱变)
5. 菌悬液的浓度
（三）诱变剂的选择及处理方法
1. 诱变剂的选择（高效，简便） 物理诱变剂：频度低，大损伤，难修复，且操作简便； 化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。 ( NTG——超诱变剂）
第六节 原核生物的基因重组
基因重组（gene recombination）： 将两个不同性状个体的基因通过一定的方式转移到一 起，并发生重新组合，产生新的遗传性状的过程，称 为基因重组(gene recombination)或遗传重组。 重组：遗传物质在分子水平上发生的交换； 杂交：在细胞水平上遗传物质的交换. 杂交必然包含着重组，但重组不仅限于杂交这一形式。
2.诱变及化学致癌物质的检测——Ames实验 3.DNA损伤的修复
第五节 微生物的诱变育种
一、诱变育种中的几个原则
指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变 率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。
2个主要环节： 诱变（随机） 选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀 、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞 致死的同时，使存活个体中的突变频率大大 提高。
（五）突变株的筛选
1. 初筛（以量为主） 方法需简便、快速
2步
初筛 复筛
（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性 （2）根据平板颜色反应直接挑选 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）； 抑菌圈法（抗生素）； 变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）； 沉淀圈法（外毒素） 透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标） 2. 复筛（以质为主，定量测定） 摇瓶培养，直接检测所需产物
感受态细胞（competent cell） ：具有摄取外源
受细菌自身的基因控制 DNA能力的细胞
（如肺炎链球菌的感受态出现在对数生长期）
人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有
自然遗传转化（natural genetic transformation）
人工转化（ artificial transformation ） 摄取DNA 的能力，或人为地将 DNA导入细胞内。
化合物代号 1 2 3 4 5 5 6 7 8 9 6 10 10 11 12 13 7 11 14 14 15 16 8 12 15 17 17 18 9 13 16 18
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（3）营养缺陷型的用途 • 生产菌 (氨基酸、核苷酸、维生素等高产菌需求)； • 研究代谢途径和杂交、转化等遗传规律的遗传标记。
加抗生素(或菌丝过滤)，培养过夜
③ 营养缺陷型的检出
夹层培养法 限量补充培养法 逐个检出法 影印平板法
方法
④ 营养缺陷型的鉴定
生长谱法： 分两步：
快速，直观
a.三大类营养要求（氨基酸、维生素、核苷酸）的鉴定 b.具体到某一种营养要求的鉴定(哪一种氨基酸,哪一种 维生素,或哪一种碱基)
具体操作:一般采用“滤纸片法”
筛选（定向）
设计有效的筛选方法，将少量正变株中的 优良菌株挑选出来。
（一） 出发菌株（original strain）
出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。 出发菌株的选择标准： • 具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、 标记明显等）； • 对诱变剂敏感 出发菌株的来源： •野生型菌株； •从生产中选育的自发突变菌株； •诱变获得的高产菌株
• (2) 转化过程
ds DNA 供体(strR) 感受态受体(strS) 酶解与吸收单链
转化因 子进入 细胞 转化因 子单链 配对与 整合
同源区段配对
单链整合
复制与分离
复制
分离
பைடு நூலகம்非转化子(strS)
感受态因子： 调节感受态的一类特异蛋白，它包括三种主要 （该过程与细菌自身的遗传控制无关！）
成分：膜相关DNA结合蛋白、细胞壁自溶素和几种核酸酶。
进行自然转化，需要二方面必要的条件：
（1）建立了感受态的受体细胞 （2）外源游离DNA分子
感受态的机理研究： 局部原生质体化假说：
处于感受态的细胞局部失去了细胞壁，使外源DNA能顺利经膜 进入菌体。
三大类营养要求的鉴定： a. 不含维生素的酪素水解液或氨基酸混合液或蛋白胨 b. 水溶性维生素混合液 c. 0.1%碱水解酵母核酸液
a
b
c
单一营养物质要求的鉴定：
组 以氨基酸缺陷为例进行说明 别 将18种氨基酸按右表分为6组 1 2 特点：每2组只有一种共同物质 3 1 4 5 6 2 6
3 4
（二） 菌悬液的制备
1. 选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散） 目的：①使每个细胞能均匀接触诱变剂； ②减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象） 2. 同步培养（生理状态一致） 3. 菌龄：对诱变剂最敏感时期 4.菌悬液的制备方法 营养细胞：对数期 孢子或芽孢：萌发前期
物理诱变：生理盐水配制 化学诱变：缓冲液配制 酵母菌，霉菌的孢子：106个/mL 细菌，放线菌孢子：108个/mL
如：异烟肼（“雷米封”）是吡哆醇的结构类似物 ，利用含异烟肼梯度平板筛选异烟肼抗性突变株， 可达到定向培育吡哆醇高产突变株的目的。 加入不含异烟肼的底层 敏感
菌苔
为什么在筛选突变株时 ,不能直接用代谢产物, 抗性 菌落 而必须用其结构类似物 ? 加入含异烟肼的上层
2. 营养缺陷型突变株的筛选
（1）几个概念： 三类培养基： 基本培养基（MM, minimal medium）[-]： 某野生型能生长的最低成分的组合培养基。 完全培养基（CM,complete medium）[+]： 各种营养缺陷型能生长的天然或半组合培养基 补充培养基（SM, supplemental medium）[A]:[-]+A [B]:[-]+B 相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基
酶受体假说：
受体细胞表面出现了一种能结合DNA并使之进入细胞的酶。
2. 转化模型
（1）转化因子 本质是离体的 DNA片断或质粒 DNA 。转化因子进入细胞前 还会被酶解成更小的片段，约8kb。在不同的微生物中，转化因 子的形式不同，dsDNA,ssDNA. 革兰氏阴性的嗜血杆菌中，细胞只吸收dsDNA形式的转化因 子，但进入细胞后需经酶解为ssDNA，才能与受体菌的基因组整 合； 革兰氏阳性的链球菌和芽孢杆菌中，dsDNA的一条链必须在 胞外降解，只有ssDNA形式的转化因子才能进入细胞。 但不管何种情况，最易与细胞表面结合的仍是dsDNA。 由于每个细胞表面能与转化因子相结合的位点有限（如肺 炎链球菌约10个），因此，从外界加入无关的dsDNA就可竞争并 干扰转化作用。 质粒 DNA也是良好的转化因子，但它们通常并不能与核染 色体组发生重组。 转化的频率通常为0.1％～1％，最高为20％。
在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为70~75%, 甚至 30~70%的剂量。
UV的剂量: 固定UV功率和照射距离,以照射时间长短来 确定剂量多少。
3. 诱变处理方法
单因素处理或多因素的复合处理： ①同一诱变剂的重复使用； ②两种或多种诱变剂的先后使用； ③两种或多种诱变剂的同时使用.
（四） 中间培养（CM，培养过夜）
诱变育种的程序：实验讲义p174
出发菌株（纯化） 前培养（ CM ，培养至对数期） 菌悬液制备 活菌计数
诱变预备实验（剂量存活率曲线） 诱变处理（相对杀菌率为70-75%，30-70%） 活菌计数 中间培养（CM，培养过夜，克服表型延迟） 突变株分离 初筛 复筛 生产性能试验 菌种（鉴定与）保藏
三、自发突变与育种
目前已知有二十多个种的G+和G-细菌具有自然转化的能力 此过程可以发生在土壤和海洋环境中，可能是自然界遗传交 换的重要方式。
1. 感受态 自然感受态与人工感受态的不同？
自然感受态
感受态：是指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化 的一种生理状态。一个细菌能否出现感受态是由其遗传性决 的出现是细胞一定生长阶段的生理特性 定的，但受环境条件的影响也很大，因而表现差别很大。
（2）筛选步骤（5步）
诱变处理 中间培养 淘汰野生型 检出缺陷型
鉴定缺陷型
①中间培养
CM或SM培养基，培养过夜。克服表型延迟。
②淘汰野生型 方法
即浓缩缺陷型，以提高检出率
抗生素法（G+细菌：青霉素；酵母菌和霉菌：制霉菌素） 菌丝过滤法（丝状真菌、放线菌） 饥饿培养（无N）MM 6~12 h 2N培养(2N)MM 1~2 h
目的：克服表型延迟 表型延迟（phenotypic lag）：表型的改变落后于基因型改变的 现象. 分离性延迟： 突变的基因经 DNA复制和细胞分裂后变成纯 分离性延迟的原因 : 对数生长期中，单核细胞常出现双核 现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突 合状态，表型才能表现出来。 变通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过 生理性延迟: 由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能 生理性延迟的原因 生理性延迟： : 当变异细胞由杂合状态变为纯合状态 一代或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现 时,由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用 ,必 表现出来。 象称为分离延迟现象。 须经过细胞多代分离后,才能将这些非变异的酶稀释掉,最终 达到变异后应该表现的形态,如营养缺陷型突变株的筛选过 程。
第一节 遗传变异的物质基础 第二节 质粒 第三节 基因突变的规律及类型
1. 突变的定义 2.基因突变的特点(规律) 自发性\不对应性\独立性\稀有性\可诱变性\稳定性\可逆性 3.证明基因突变自发性和不对应性的实验证据 4.基因突变的类型
第四节 基因突变的机制
1.基因突变的分子基础
自发突变 诱发突变(化学诱变/物理诱变/生物诱变)
5. 菌悬液的浓度
（三）诱变剂的选择及处理方法
1. 诱变剂的选择（高效，简便） 物理诱变剂：频度低，大损伤，难修复，且操作简便； 化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。 ( NTG——超诱变剂）