大肠杆菌生产制备重组人胰岛素实用工艺

1.提取目的基因:
既从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离.
2.提取质粒:
使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状DNA.
3.基因重组:
取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒.
4.将质粒送回大肠杆菌:
再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒吸收.
5.胰岛素的产生:
再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素!
〖学习要求〗知道DNA的粗提取与鉴定的原理；掌握并能分析DNA粗提取的技术方法和要求；学会DNA分子的鉴定方法
【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并
初步巩固。

一、基础知识
【活动1】阅读教材P54“基础知识”，讨论并回答下列问题：
1．（记忆）提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。

2．（记忆）DNA的溶解性特点：
DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。

【思考1】据图5－1分析：
DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？在0.14mol/L时溶解度最小；
要使DNA溶解，需要使用什么浓度？较高浓度，可使DNA溶解；
要使DNA析出，又需要使用什么浓度？0.14mol/L可使DNA析出。

【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理，可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目的。

3．（记忆）DNA的耐受性特点：
蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA；在60～80℃时蛋白质变性沉淀而DNA 分子不变性。

洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。

4．（记忆）DNA的鉴定原理
当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用二苯胺（甲基绿）进行鉴定。

在沸水浴条件下，该试剂与DNA反应，呈现（浅）蓝色。

二、实验设计
【活动2】阅读教材P55“实验设计”，讨论并回答下列问题：
1．（记忆）实验材料的选取：选取材料时应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。

【思考3】你认为教材提供的材料中哺乳动物的血液不适合提取DNA。

2．（记忆）破碎细胞，获取含DNA的滤液：
鸡血：向鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并玻棒搅拌，用纱布过滤后，收集滤液。

洋葱：向研钵中加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，用纱布过滤后，收集滤液。

【思考4】在以上实验中，蒸馏水的作用是使血细胞大量吸水而胀裂，洗涤剂的作用是瓦解细胞膜，食盐的作用是溶解DNA物质。

3．（学会）去除滤液中的杂质：
方案一：30mL滤液→加NaCl使DNA溶解→过滤得滤液→加蒸馏水使DNA析出→过滤得过滤物→放到2mol/LNaCl溶液中溶解→DNA－NaCl溶解液方案二：30mL滤液→加嫩肉粉（木瓜蛋白酶）→静置10分钟→得DNA滤液方案三：30mL滤液→60～67℃处理→过滤得DNA滤液
【思考5】以上三个方案的原理分别是什么？
方案一原理：DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；
方案二原理：蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；
方案三原理：DNA耐高温而蛋白质不耐高温。

【思考6】方案一中：“加NaCl使DNA溶解→过滤得滤液”的目的是除去不溶（可溶、不溶）于NaCl溶液中的细胞杂质；“加蒸馏水使DNA析出→过滤得过滤物”的目的是除去可溶（可溶、不溶）于NaCl溶液中的细胞杂质。

4．（记忆）DNA的析出：
DNA滤液与等体积冷却酒精混合，静置一段时间后析出的白色丝状物就是DNA。

5．（记忆）DNA的鉴定：
取2支洁净的试管，编号甲、乙，各加入等量的2mol/L NaCl溶液。

甲中放入少量白色丝状物，使之溶解。

在甲、乙试管中各加4mL二苯胺，混合均匀。

沸水浴5min，观察颜色变化，甲试管呈现蓝色。

三、操作提示
【活动3】（记忆）阅读教材P56“操作提示”和P57“课题延伸”，关注下列注意事项：
1．在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心后除去血浆，以提高细胞悬液浓度。

2．实验中使用塑料烧杯和尼龙布，以免DNA被吸附。

3．玻棒沿同一方向缓慢搅拌（细胞破裂时快速搅拌），玻棒不要碰到烧杯壁。

4．二苯胺试剂要现用现配。

5．为提高DNA纯度，实验中通常使用的洗涤剂有CTAB、SDS等。

【活动4】观看视频：观看“DNA的粗提取与鉴定”视频，体会并学会相关技术方法。

〖课后学习〗
1．尝试从植物组织中提取DNA分子。

2．基础训练册：将基础知识整理到作业本上；完成该节训练题。

〖学习要求〗
尝试PCR技术的基本操作，体验PCR技术的分子生物学实验方法；理解PCR技术的原理；讨论PCR技术的应用
【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并初步巩固。

一、基础知识
【活动1】阅读教材P58“PCR原理”，讨论并回答下列问题：
1．（记忆）PCR技术扩增DNA的过程与细胞内的DNA复制过程类似。

【思考1】填写下表：（记忆）细胞内DNA复制条件分析
2．（理解）细胞内DNA的复制
（1）DNA的结构：脱氧核苷酸分子通过3,5－磷酸二酯键连接形成核苷酸长链，两条脱氧核苷酸长链反向平行排列并螺旋化，形成DNA双螺旋结构。

（2）DNA的复制：首先，在解旋酶的作用下，由ATP供能，DNA发生解旋形成两条DNA单链。

其次，在DNA单链的3’端，在RNA聚合酶在作用下，合成RNA 引物。

再次，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3’端开始合成DNA子链。

最后，DNA聚合酶将引物切去，并合成空缺处DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来。

3．（记忆）DNA分子复制的人工控制
解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。

恢复螺旋：在50～60℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。

复制条件：缓冲液，DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物。

控制仪器：PCR仪（温度周期性自动调节仪）。

【思考2】缓冲液相当细胞内的什么成分？核液。

【活动2】阅读教材P59“PCR的反应过程”，讨论并回答下列问题：
1．（记忆）填写PCR反应流程：
2．（理解）PCR反应过程是：在升温至90℃以上时DNA解旋；在降温至50℃左右时引物与DNA单链结合；在升温至72℃左右时合成DNA子链。

二、实验操作
【活动3】阅读教材P62“实验操作”，讨论并回答下列问题：
1．（记忆）在PCR反应体系的配方中，含有的成分有缓冲液、DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物、水。

2．（了解）实验操作步骤：按照PCR反应体系配方配制反应液；将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；将微量离心管放到PCR 仪中；设置PCR仪的工作参数；DNA在PCR仪中大量扩增。

3．（了解）水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃恒温水浴锅中循环处理。

三、操作提示
【活动4】阅读教材P62“操作提示”，讨论并回答下列问题：
1．（记忆）避免外源DNA污染，所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。

2．（记忆）将缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。

3．（记忆）每添加一种反应成分，更换一个移液器枪头。

4．（记忆）混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

四、结果分析与评价
【活动4】阅读教材P63“结果分析与评价”，讨论并回答下列问题：
1．（记忆）反应液稀释：取2?LPCR反应液，添加98?L蒸馏水。

2．（记忆）分光光度计调零：将100?L蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计读数调节为零。

3．（记忆）将100?L反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。

4．（记忆）DNA含量计算：DNA含量（?g）＝50×光吸收值×稀释倍数。

【活动4】观看视频：观看“多聚酶链式反应扩增DNA片段”视频，学会相关技术方法。

〖课后学习〗
1．尝试从植物组织中提取DNA分子。

2．基础训练册：将基础知识整理到作业本上；完成该节训练题。