慢病毒包装操作说明
慢病毒包装简要步骤
慢病毒包装简要步骤：
以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1×10∧6个293FT细胞。
1、取1.5ml灭菌EP管，加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清Opti MEM。
轻柔混匀，室温孵育5min。
2、取1.5ml灭菌EP管，取9μl 脂质体2000l溶于250μl无血清Opti-MEM I培养基中。
轻柔混匀，室温孵育5min。
3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。
室温孵育20min
4、用胰酶消化并记数293FT细胞。
用含血清的DMEM培养基重悬细胞。
5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。
6、将1ml重悬的293FT细胞（1×10∧6个细胞/ml）加入到平板中。
37℃CO2孵箱中孵育过夜。
7、移除含有DNA-脂质体复合物的培养基移除，代之以DMEM（含丙酮酸钠和非必须氨基酸）。
7、转染后48-72h收获含病毒的上清。
3000 rpm 离心20min，去除沉淀。
8、病毒上清-80°C贮存。
包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。
慢病毒包装实验步骤及注意事项
慢病毒包装实验步骤及注意事项当下，基因编辑技术越来越火热，带动慢病毒包装实验越发普遍，但是大家通常在潜意识会觉得病毒载体包装过程太复杂而不敢尝试，确实，除去实验过程本身繁杂之外，做慢病毒包装实还经常容易出现各种状况，比如稳定性很差、滴度低，或者就是根本不出毒等等。
但是，热点可不等人，该来的迟早还是会来的，下面小编就为大家详细介绍一下慢病毒包装实验的基本步骤以及注意事项，希望大家能自己学会，掌握“核心”技术!慢病毒(Lentivirus)是一种逆转录病毒。
慢病毒在感染细胞时，首先会将宿主RNA逆转录为DNA，并将逆转录基因插入到宿主基因中表达。
慢病毒的基因表达系统是目前广泛使用的基因编辑操作工具。
以最常做的质粒共转染293T细胞为例，为了得到高滴度的慢病毒，慢病毒包装方法是利用表达载体与包装质粒共同转染细胞，在细胞中进行包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染。
实验流程示意实验材料1)含有目的基因的病毒载体：一个包装质粒混合物(Mix=pMDL:VSVG:REV=5:3:2)和一个慢病毒载体质粒(LentiviralVector)组成;2)指数生长的293T细胞;(培养条件：DMEM+10%PBS，37℃，5%CO2)3) 试剂：胎牛血清、Opti-MEM、转染试剂实验步骤第一步：细胞分盘转染前一天,通过胰消化传代于35mm培养皿上,使细胞贴壁后所古面积达到培养皿总面积的80%以上)。
将细胞置于含5%CO2的37℃温箱中孵育8-24h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。
第二步：病毒转染1) 转染前1h换液(用1.5mL完全培养基换掉旧的培养基)。
2) 制备包装质粒和目的质粒与转染试剂的混合物：取无菌1.5mL EP管，加入400µl 无血清Opti-MEM，加入1.5µg 核心质粒和1.5µg 病毒包装质粒，及6µl 转染试剂 (转染试剂：质粒=2:1)，充分混匀，静置15-20min。
慢病毒包装手册
慢病毒载体构建及包装操作手册目录慢病毒收到后的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、慢病毒包装和浓缩四、感染目的细胞附1. 汉恒生物慢病毒质粒列表附2. 慢病毒滴度测定方法简介附3. 慢病毒MOI感染参数附4. 汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较附5. 实验室病毒操作应急预案慢病毒安全使用和注意事项➢慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3)操作病毒时特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。
接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。
4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。
5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。
6)实验完毕用香皂清洗双手。
➢慢病毒收到后的注意事项1)慢病毒的储存用户收到病毒液后如在短期内使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。
注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。
b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。
2)慢病毒的稀释用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。
一、整体实验流程二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附表1）2、细胞株：我们采用293T作为慢病毒的包装细胞。
慢病毒包装实验技术方法
慢病毒包装实验技术方法1、实验试剂DMEM、超牛血清、G418、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、Lipofectamine TM 20002、实验仪器细胞培养板，37℃细胞培养箱，离心机，Amicon Ultra-15离心过滤器3、293FT细胞的培养用于包装病毒的293FT细胞必须处于生长旺盛期，细胞状态良好，细胞边缘清晰，传代次数较低。
293FT细胞培养：使用含10%超级新生牛血清的DMEM高糖培养基（并添加0.1mM的非必需氨基酸，2mM的L-谷氨酰胺，2mM的丙酮酸钠，500µg/ml的G418和1%的青霉素或链霉素），置于37℃、5% CO2 细胞培养箱中常规培养，保证细胞生长状态良好。
4、转染质粒细胞铺板：用含有10%FBS的无抗生素DMEM将生长旺盛的293FT细胞以一定密度铺到培养板中，使次日密融合度达到60%左右。
分别用脂质体作为转染试剂实现包装质粒和核心质粒的共转，PAX 2、pMD和核心穿梭质粒以3：1：4的比例用Lipofectamine TM 2000共转293 FT细胞。
转染6h后，移去细胞培养液，更换为新鲜的DMEM 培养基。
转染后24 h和48h分别于倒置荧光显微镜下观察转染效率并拍照，效率应达到85%以上。
5、收集病毒转染48小时后收集含慢病毒的上清液于无菌的离心管中，3000 rpm，4 ℃离心10 min，取离心后的上清分装到新的无菌的离心管中，-80℃冰箱保存。
将包装病毒的细胞培养板中加上新鲜的培养基，72h 后再次收获慢病毒上清液并离心处理后于-80℃保存。
6、慢病毒滴度测定慢病毒滴度测定：滴度测定前1天接种HeLa细胞，12孔板中细胞密度为2×105个细胞/孔，含10% FBS的DMEM为1ml/孔，第2天将500µl病毒液及含10% FBS的DMEM 500µl加入到1.5ml的离心管中混匀，并将其加入到预先种好的细胞中，37℃、5%CO2培养箱培养，48h后用流式细胞仪检测阳性率。
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行冻存。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7.将细胞离心，1000rpm，2min。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6. 第二天观察细胞存活率。
倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。
二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems，cat. no. 4304437)3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems，cat. no. 401970)4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems，cat. no. 4316844)用于包装的293T细胞的培养用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。
慢病毒包装操作说明
慢病毒包装操作说明Clontech-Lenti-X? Lentiviral Expression Systems User Manual Protocol No. PT5135-1慢病毒包装操作说明A.用Lenti-X HTX Packaging System生产慢病毒悬浮物为了获得最高效价的病毒悬液，用Lenti-X 293T细胞系，严格尊守以下说明，尤其尊守（1）培养体系和培养量（2）DNA的量和转染质量（3）无四环素血清（4）孵育时间。
所有的Xfect?转染成份，量和条件最好用Lenti-X Vectors，Lenti-X HTX 包装混合物，Lenti-X 293T细胞。
用10cm组织培养板并确保血清无四环素，四环素污染的血清对表达包装成份是有害的。
所有的实验步骤均在无菌组织培养器血中完成。
包装病毒需要有微生物安全等级2的生物安全柜中进行，注意重组的假性慢病毒包装颗粒能够感染人。
1.转染24小时前，在10cm培养板接种4-5×106个293T细胞，添加10ml的生长培养基。
在37℃，5%CO2℃条件下过夜。
在进行第7步前确保培养血有80-90%的覆盖率。
2.充分混均Xfect Polymer。
3.每个转染样品需准备两个离心管，按顺序添加如下试剂Tube 1(Plasmid DNA) Tube 2(Polymer)557μl Xfect Reaction Buffer 592.5μl Xfect Reaction Buffer 36μl Lenti-X HTX Packaging Mix 7.5μl Xfect Polymer7μl Lenti-X Vector DNA(1μg/μl)600μl 总量600μl 总量注意：Xfect Polymer 不要在室温下搁置长于30min4.充分混均每个管5.把Tube2添加到Tube1中，中速涡旋10秒。
6.在室混下孵育DNA-Xfect混合物10min，这时可形成纳米复合物。
慢病毒(过表达)包装步骤
(WORD)-生产企业质量管理制度范本760慢病毒（过表达）包装步骤秦超1.转染复苏293T细胞，传2-3代进行转染，转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。
转染步骤：（以10cm培养皿为例）⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染，控制转染前细胞密度70%-90%，保证细胞处于良好的状态，转染前一小时把一半培养基（约5ml）换成新的（含血清，因为此转染试剂不需换液）。
⑵加psin 10ug，pspax2 10ug，pmd2.g 5ug于800ul opti-mem，混匀⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ul opti-mem，混匀，室温静置5min⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中，边加边轻轻混匀，室温放置20min⑸取出细胞培养皿，将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中，前后轻轻推摇使混合均匀，放回培养箱。
2.收毒(36-48h)收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率，一般达到60%即可。
⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中，然后2000rpm离心10min，以沉淀细胞碎片。
⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管（用蛋白质浓缩管即可）中。
4000rpm离心至所需体积。
⑶浓缩完毕后，吸出浓缩后的病毒液，按每次的接毒量分装，-80℃冻存。
由于反复冻融会降低慢病毒滴度，因此避免反复冻融。
3.接毒接毒前12-20h铺细胞，使接毒时细胞密度约为40%-50%，务必使用生长状态良好的细胞。
将分装好的慢病毒滴加到细胞中，加polybrene使其终浓度为8ug/ml 细胞密度60%-70%时可以再接毒一次。
4.检测及培养细胞系(48h)如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率，如需用药杀用puromycin杀三天（对照组完全杀死），剩下的即为基因整合进去的细胞。
如需培养成细胞系，可继续培养。
如果剩下的细胞较少可用高浓度血清，待细胞聚团时用胰酶消化一下，使细胞铺匀。
Lenti-X HTX 慢病毒包装系统操作流程(clontech)
Lenti-X™ HTX 高效慢病毒包装系统操作一览PT5135-2目录重要 (1)存储&处理 (1)转染操作 (2)重要：以下操作是针对Lenti-X 载体，Lenti-X HTX 高效包装系统和Lenti-X 293T 细胞系(Cat. No. 632180)的优化操作。
转染操作需在100 mm 培养板中进行，转染培养基和收集病毒的培养基中需使用Tet System Approved FBS (无四环素污染)。
以下所有操作需在无菌环境下进行，需要使用生物安全等级为2的仪器设备进行病毒操作并做好自身的防护措施。
存储&处理：●使用前，室温解冻Xfect™ Polymer (100 μg/μl)。
解冻后，将Xfect Polymer 置于4°C保存，最多12 months。
●使用前，室温解冻Xfect Reaction Buffe。
解冻后摇匀，将Xfect Polymer 置于4°C保存，最多12 months。
●使用完Xfect Polymer后，盖紧管盖，放回带有干燥剂的锡箔袋。
Figure 1. Lenti-X 293T细胞最优转染密度（左图）和转染后细胞检测时间（右图），转染筛选标记是ZsGreen 绿色荧光蛋白。
转染操作（100 mm板）：1.转染前约24 hr，以4–5 x 10e6Lenti-X 293T细胞/100 mm板的密度接种10 ml细胞，37°C、5% CO2 培养过夜。
转染时的细胞融合度应该为80–90%。
2. 漩涡混匀fect Polymer。
3. 对于每个转染样本，准备2个离心管，按照以下顺序混匀试剂：注意 Xfect Polymer预混液室温放置不要超过30min。
4. 漩涡混匀各管混合物。
5. 将Xfect Polymer预混液和DNA预混液以适中的速度漩涡10sec。
6. 室温孵育10 min，以形成便Xfect/DNA复合物。
慢病毒包装操作方案
慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培养试剂试剂名称终浓度试剂品牌DMEM/High glucose基础培养基90%Invitrogen胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mM Invitrogen2 慢病毒包装试剂试剂名称浓度试剂品牌Lipofectamine 2000InvitrogenPEG6000溶液50%WakoHBSS溶液Invitrogen3 耗材50 mL离心管15 mL离心管10 cm细胞培养皿μm过滤器2 mL EP管二、操作流程1细胞培养1.1293T/293FT细胞的复苏1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。
在超净台内，用吸管吸取6~7mL完全培养液至15 mL离心管中；2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C 水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化；3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用）。
4)在室温条件下，250 g离心4分钟。
5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。
（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培养容器。
）6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。
1.2293T/293FT细胞传代1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。
将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。
慢病毒包装SOP
慢病毒包装标准操作细则1. 目的：规范慢病毒包装标准操作程序2. 范围：适用于慢病毒包装操作工序3. 操作程序3.1器材准备无菌10ml玻璃吸管、电动移液枪、，移液枪（量程1000μL）、10cm培养皿、各种枪头，1.5mL EP管、试管架，酒精灯、振荡混匀仪、荧光显微镜、CO2培养箱、生物安全柜3.2溶液准备1640培养基，Opti-MEM，Lipo转染试剂，293T细胞，重组慢病毒穿梭质粒，重组慢病毒骨架质粒(H1，H2)。
3.3操作步骤3.3.1转染前一天，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为6x 106细胞，重新接种于10 cm细胞培养皿，37 ℃、5% CO2培养箱内培养。
24 h待细胞密度达～80%时即可用于转染。
细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。
3.3.2第二天转染前用电动移液器将细胞培养基更换为无血清的1640培养基或是opti-MEM培养基。
3.3.3准备两个灭菌EP管，依次向一灭菌的EP管中加入10ug目的载体质粒，12ug pHelper 1.0质粒， 10ug pHelper 2.0质粒、相应体积的Opti-MEM培养基，总体积调整为500ul，轻轻混匀。
3.3.4在另一灭菌EP管中，加入460ul的Opti-MEM培养基和40ul Lipo转染试剂轻轻混匀，室温孵育5分钟。
3.3.5把两管含有载体的溶液与转染试剂的溶液进行混合，轻轻颠倒混匀，总体积为1ml，室温孵育20分钟。
将混合液滴加入细胞培养皿中，37 ℃, 5% CO2细胞培养箱中孵育6h～8 h。
3.3.6培养6-8 h后换液，弃去含有转染混和物的培养基，每盘细胞加入10 ml的10% FBS的1640培养基，于37 ℃, 5% CO2细胞培养箱中培养。
3.3.7转染24h后观察转染效率并拍照。
3.4清场3.4.1物品集中在废液桶中灭菌后清洗。
慢病毒包装体系使用说明
慢病毒包装体系使用说明本说明书适用于以下产品：名称货号慢病毒包装体系KLV3501慢病毒包装体系（含293V细胞）KLV3502慢病毒包装体系（含转染试剂）KLV3503慢病毒包装体系（含293V细胞、转染试剂）KLV3504北京英茂盛业生物科技有限公司Web site：1北京英茂盛业生物科技有限公司/产品内容KLV3501KLV3502KLV3503KLV3504慢病毒载体（过表达或RNA 干扰载体任选一种） 3333辅助载体pH1 3 3 3 3 辅助载体pH2 3 3 3 3 HEK293V 细胞 3 3 Polyfect-V 转染试剂33载体采用质粒形式发货，请在收到质粒后放-20℃冻存，也可以直接转化大肠杆菌感受态进行质粒扩增。
HEK293V 细胞采用干冰或培养瓶发货。
请在收到细胞后根据附带说明书进行复苏或传代。
慢病毒载体慢病毒载体中含有病毒整合和表达所需原件及表达外源目的基因的元件。
外源基因通过载体中的多克隆位点插入慢病毒载体中进行表达。
pLV-EGFP-C 的载体图谱见下，本公司的其它慢病毒载体结构与之基本相似。
其它载体信息见本公司网站 或本说明书后面的附表。
慢病毒包装载体慢病毒包装载体包括pH1和pH2，表达生产病毒颗粒所需的病毒蛋白。
载体图谱见下：HEK293V细胞包装细胞的状态对病毒包装效果有直接影响。
我公司保存的293V细胞为低次代293V细胞，细胞性状稳定。
在高密度下生长3天仍可保持贴壁状态，持续产生病毒颗粒，因此可多次收获病毒，降低病毒包装实验成本。
Polyfect‐V转染试剂Polyfect-V转染试剂专为293V细胞转染及慢病毒包装研制,可以在细胞铺板同时进行转染，缩短病毒包装时间；无需要求细胞处于生长对数期，细胞转染时密度可以很高；细胞毒性极低；质粒和转染试剂用量是普通转染试剂的1/3到1/2等显著优点；包装病毒时转染效率接近100%，能提高病毒产量3-5倍。
3北京英茂盛业生物科技有限公司/慢病毒包装概述：病毒包装前需制备转染级慢病毒载体及两种包装载体。
慢病毒包装protocal
慢病毒包装用于侵染Hela细胞和A549细胞用24孔板进行培养293FT细胞，每孔500μl培养液，用于包装慢病毒实验。
用6孔板培养Hela细胞和A549细胞，每孔2ml培养液，用于侵染实验。
包装对照质粒：表达GFP和RFP的PTK643空载体；包装样品质粒：PTk643-cc1各片段和PTk643-cc2各片段。
具体操作流程如下：（1）对用去内毒素试剂盒提过的质粒进行浓度测定，用于统一之后慢病毒包装中质粒的量。
（2）准备293FT细胞，按1：5接种于0.5ml DMEM（含10%FBS）的24孔板中，过夜培养到60%-80%细胞密度。
（3）准备DNA mixture。
按1ug PTK643-cc +0.7 ugΔNRF +0.5 ugVSVG计算相应的质粒体积。
将上述混合物加入50ulopti-MEM中，振荡并稍离心。
（4）准备PEI mixture。
融化PEI并稍离心，按60：500的比例将PEI加入到opti-MEM中，立即振荡并稍离心，静置5min。
（5）准备DNA/PEI混合液，将56ul的PEI混合物一滴滴加入到（3）中的DNA混合液中，振荡并稍离心。
室温孵育20-30min。
（6）从细胞培养皿中移去100ul培养液，之后加入上述DNA/PEI 混合液，同时左右摇摆盘子。
（7）37ºC培养过夜。
12小时后，换培养液（加入500ul DMEM （含10%FBS））。
（8）回收病毒上清。
转染分别在48和72小时后，回收病毒上清。
（可用0.45μm syringe filter millipore过滤回收病毒上清，本次不用）（9）将病毒上清分为300ul和200ul两份，立即进行侵染实验或于-80ºC保存。
（一份300ul侵染Hela细胞，用于后面的流式分析；另一份200ul用于跟踪观察细胞的形态。
）（10）侵染12小时后，换一次培养液。
培养48小时后，观察细胞，弱培养液变黄，则换培养液。
慢病毒包装实验流程介绍
慢病毒包装实验流程介绍
慢病毒包装流程：
1、载体质粒与系统质粒共转染293T细胞。
2、收集48~72h的细胞上清液。
3、超速离心纯化浓缩。
4、纯化分装。
5、滴度检测。
慢病毒包装具体实验步骤如下：
一、质粒转染
1、转染前，依次准备好转染试剂、Opti-MEM培养基、目的质粒、骨架质粒、EP管。
2、然后，配置质粒和OMEM的混合液。
3、配置转染试剂和OMEM的混合液。
4、轻轻混匀，静置5min。
5、将配好的质粒与转染试剂混合后形成转染体系。
6、轻轻混匀，静置20min。
7、从培养箱中取出10cm培养皿，弃去培养液，更换为OMEM 培养液。
8、转染，轻轻混匀。
9、在培养皿盖上做好标记，放回培养箱继续培养。
10、转染后6-8h，更换为新鲜的DMEM培养基。
11、转染后次日，显微镜下观察转染效率。
12、转染后48h，收集上清液于干净的50ml离心管中。
13、加入新鲜的DMEM培养基，继续培养。
14、转染后72h，再次收集上清液。
二、浓缩纯化
1、将收集好的上清液离心，弃去细胞碎片。
2、用0.22μm滤膜过滤，分装到超速离心管中。
3、超速离心。
4、离心结束后，将所收获的病毒颗粒重新悬浮，于4℃冰箱中溶解，过夜。
5、次日，再次将溶解后的病毒过滤、分装、入库。
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行冻存。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7.将细胞离心，1000rpm，2min。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6. 第二天观察细胞存活率。
倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。
二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems，cat. no. 4304437)3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems，cat. no. 401970)4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems，cat. no. 4316844)用于包装的293T细胞的培养用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。
慢病毒包装试剂盒说明书(5个10cm皿)-精简版
YRGene慢病毒包装试剂盒（精简版）说明书产品编号：产品规格： 个 皿产品简介：赢润生物的慢病毒包装试剂盒包括如下成分：（ ）优化配比的慢病毒包装辅助质粒混合物，可兼容大多数慢病毒表达载体。
（ ）高效率的慢病毒浓缩液，无需超速离心，也不需要价格昂贵的过滤柱，快速富集病毒粒子，其优势在于操作安全简单，对设备要求低，产毒效率高，能够快速、高效地收获高滴度病毒。
产品组成：慢病毒包装步骤：转染前，传代 细胞于 培养皿中（例如，接种 × 细胞于 培养皿中，使用完全培养基 培养），当细胞密度能够达到 即可进行转染。
：培养基里面不要添加抗生素。
转染前 小时，更换培养基，加入 新鲜的完全培养基（ ），注意不要添加抗生素。
准备转染。
在 离心管中，分别配制 管与 管试剂（ ）配好后，放置 ，然后将 管缓慢加入 管，混合均匀。
室温放置 ，使得脂质体 混合物形成。
：混合后可能会出现淡淡的乳白状，不会影响转染。
然后将混合液逐滴均匀加入 培养皿，轻微混匀。
置于 ， 培养箱中培养过夜。
第三天，更换培养基，加入 的完全培养基，同样注意不要加抗生素。
转染后 后收取上清，转移至 离心管。
：上清里面含有病毒，请小心操作。
在 ℃离心 ，去除沉淀。
上清液用 μ 滤器过滤后转移到新的离心管中。
慢病毒浓缩：每 过滤后的病毒初始液，加入 ，每 混合一次，共进行 次。
℃放置过夜。
℃， ，离心 。
去掉上清，静置管子 ，吸走残余液体。
加入无血清 充分溶解慢病毒沉淀。
病毒悬液分装成 μ 每份 保存在离心管中，速冻后储存在 ℃。
慢病毒滴度测定：进行慢病毒感染实验之前，我们强烈建议您进行慢病毒滴度检测。
在滴定测定的前一天取 孔板，每孔接种 × 细胞。
加 到新鲜的完全培养基中，使其终浓度为 μ 。
加含有 的完全培养基 倍稀释病毒。
具体操作如下：取一个 离心管（或 孔板），加入 μ 培养基和 μ 待测病毒原液，混合均与后吸取 μ 病毒混合液至第二个离心管（或 孔板第二个孔），混合时尽量不要产生气泡，如此稀释至第八个孔（即稀释 倍）。
Lenti-Pac HIV 慢病毒包装试剂盒 使用手册说明书
Lenti-Pac™HIV慢病毒包装试剂盒使用手册目录1产品概述2试剂盒组成3包装慢病毒颗粒所需的实验材料4慢病毒颗粒转导靶细胞所需的实验材料5实验前的准备6慢病毒颗粒的包装制备原理7制备慢病毒8慢病毒滴度检验9慢病毒感染目的细胞10使用许可与质量保证GeneCopoeia,Inc.广州易锦生物技术有限公司广州高新技术产业开发区广州科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器F区8楼邮编：510663电话：4006-020-200邮箱：******************英文网址：中文网址：©2022GeneCopoeia,Inc.HIV（人类免疫缺陷病毒）骨架的慢病毒载体是目前最常用的慢病毒表达载体，它能在体外或体内实验有效介导外源基因转导多种分化或非分化哺乳动物细胞，使外源基因稳定整合靶细胞的基因组，并进行稳定的高水平表达。
GeneCopoeia Lenti-Pac™HIV慢病毒包装系统是安全性较高的第三代慢病毒包装系统，表达载体自身失活，不产生额外的慢病毒复制。
该系统包括：混合包装质粒、EndoFectin™-Lenti转染试剂、可进一步提高滴度的TiterBoost™滴度增强剂、以及eGFP阳性对照质粒。
Lenti-Pac™HIV慢病毒包装系统可将HIV载体的慢病毒表达克隆包装成为具有转导效果的慢病毒颗粒，包装所得的慢病毒颗粒可立即使用，介导目的基因在哺乳动物细胞进行高效表达。
GeneCopoeia提供40000多种人源及小鼠源的慢病毒载体ORF表达克隆，以及针对人源、小鼠源、大鼠源及其他哺乳类动物染色体组靶基因的慢病毒载体shRNA克隆。
除此以外，GeneCopoeia同时提供20000多种人源慢病毒载体miRNA前体表达克隆、miRNA抑制剂表达克隆以及启动子报告克隆，18000种小鼠的慢病毒载体启动子报告克隆。
以上所有克隆均应用HIV骨架，可随时应用于慢病毒包装。
根据疾病控制中心制定的标准，GeneCopoeia第三代HIV慢病毒包装系统满足生物安全第二级别（BSL-2）的要求。
慢病毒载体的包装基本步骤
慢病毒载体的包装基本步骤一、简介慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
二、实验流程（大致的简单过程）慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体(自己构建)和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T细胞(购入)中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
«大致的实验流程：1. 根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存）2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T 细胞[1]，进行病毒包装和生产，收集病毒液；4. 浓缩、纯化病毒液；5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T细胞)；6. 通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果；7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。
病毒液足够用于一般的动物活体实验。
三、重组质粒构建流程1.基因的获得: shRNA寡核苷酸序列的设计和合成(将正确序列克隆入载体中，退火形成双链，PCR扩增)2.回收A．酶切产物的胶回收：一般做50-100ul 体系，然后跑电泳回收，回收量一般为30ul。
慢病毒包装的方法、步骤详细教程分享
慢病毒包装的⽅法、步骤详细教程分享本⽂梳理了慢病毒包装的全部流程，并结合具体实例介绍了慢病毒包装的⽅法、步骤，并对包装过程中的关键点进⾏了细致的分析。
使初学者也能握毫⽆障碍地⾃主完成病毒包装、纯化、滴度测定等实验。
以293T细胞为例：慢病毒感染293T细胞 - 合肥知恩⽣物慢病毒感染293T细胞1.293T细胞分盘转染前⼀天，将已经长好的细胞以合适的⽐例传代到10cm培养⽫中，当细胞长到80%时准备转染，步骤如下：1）弃去培养液，加⼊5 mL 灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞⽣长⾯，然后弃去 PBS 溶液。
2）⽤2 mL 胰蛋⽩酶消化对数⽣长期的293T细胞。
3）以含10%⾎清的培养基调整细胞密度为5 ×106个/10 mL，重新接种于10cm细胞培养⽫中，37 ℃，5% CO2 培养箱继续培养，转染前细胞密度80%左右。
注意：293T细胞的状态⾮常重要，⼀般建议购买新的细胞株后分批多次冻存，以保证每次包装病毒时细胞的代数不会超过10代。
同时尽量不要使⽤国产⾎清。
复苏后的细胞需要传2代后才能进⾏病毒的包装，并且传达后18-24h 需要密度达到80%左右。
2.转染前换液转染前1~2h 将需要转染的细胞换新鲜的培养基，8mL/10cm⽫。
注意：293T细胞贴壁性不是很好，换液时应⼩⼼滴加尽量避免冲起细胞。
3.转染（1）以⼀个10cm平⽫为例，取2个EP管，分别加⼊500 µl⽣理盐⽔，标记为A、B；（2）A管加⼊60µg PEI，并充分涡旋混匀，B管加⼊过表达质粒和两个辅助质粒pSPAX2、pMD2.G，三质粒⽐例为4：3：1，共24µg；（3）将A管PEI加⼊到B管中,轻轻混匀，静置20min；将混合液加⼊细胞中，过夜培养。
注意：质粒提取的质量，包括浓度和纯度。
浓度⾄少要超过500ng/ul，因为浓度低，加⼊的体积就会相应增⼤，会增加细胞污染的风险。
纯度可以使⽤核酸测定仪进⾏检测，260/280在1.8-2.0之间。
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Clontech-Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User ManualProtocol No.
PT5135-1慢病毒包装操作说明
A.用Lenti-X HTX Packaging System生产慢病毒悬浮物为了获得最高效价的病毒悬液，用Lenti-X 293T细胞系，严格尊守以下说明，尤其尊守（1）培养体系和培养量（2）DNA的量和转染质量（3）无四环素血清（4）孵育时间。
所有的Xfect™转染成份，量和条件最好用Lenti-XVectors，Lenti-XHTX包装混合物，Lenti-X293T细胞。
用10cm组织培养板并确保血清无四环素，四环素污染的血清对表达包装成份是有害的。
所有的实验步骤均在无菌组织培养器血中完成。
包装病毒需要有微生物安全等级2的生物安全柜中进行，注意重组的假性慢病毒包装颗粒能够感染人。
6
1.转染24小时前，在10cm培养板接种4-5×10个293T细胞，添加10ml的生长培养基。
在37℃，5%CO2℃条件下过夜。
在进行第7步前确保培养血有80-90%的覆盖率。
2.充分混均Xfect Polymer。
3.每个转染样品需准备两个离心管，按顺序添加如下试剂Tube 1(Plasmid DNA) Tube 2(Polymer)557µlXfectReaction Buffer
592.5µl Xfect ReactionBuffer36µl Lenti-X HTX Packaging Mix
7.5µl Xfect Polymer7µl Lenti-X Vector DNA(1µg/µl)600µl 总量600µl 总量注意：
Xfect Polymer不要在室温下搁置长于30min
4.充分混均每个管
5.把Tube2添加到Tube1中，中速涡旋10秒。
6.在室混下孵育DNA-Xfect混合物10min，这时可形成纳米复合物。
7.把1200µl的DNA-Xfect溶液（第5步制备）加入到第1步准备好的细胞中，前后左右轻轻晃动培养血，使其均匀。
8.在37℃条件下培养。
9.4小时或过夜后，换10ml的完全生长培养基，在37℃条件下在培养24-48h。
病毒滴定量在48h后可达到最高。
注意：
移弃的培养液包含了可感染的慢病毒。
1
0.吸取慢病毒悬液。
在500g下离心10min。
注意：
悬浮液包含可感染的慢病毒。
TM
11.用Lenti-X GoStix鉴定病毒产物或者滴定病毒株。
然后可用病毒产物转导靶细胞。
也可在-80℃保存。
B：
Lenti-Viruses转导靶细胞
1.转导前12-18h，用完全生长培养基培养靶细胞
2.轻轻混合冻融的病毒株或从细胞包装得到的病毒株，不要涡旋。
需要提醒的是每次的冻融都降低2-4倍的病毒效价
3.根据靶细胞的培养液的量调节病毒和聚凝胺的添加量。
在转导中可用足量的聚凝胺（e.g.4µg/ml）来获得需要的最终浓度
4.用细胞培养液稀释病毒株，获得需要的MOI。
如要不知道病毒效价，可连续稀释病毒株或包装悬液，使得用于转导的病毒总量不会超过病毒包装时培养液的1/
3。
5.在靶细胞中加入病毒悬液，转导8-24h。
离心的培养液可以增加感染效率。
6.移除丢弃存留病毒的转导培养液，换成新鲜的生长培养液。
注意：
移弃的培养液包含可感染的慢病毒。
7.继续培养细胞24-48h，在靶细胞中积累基因产物。
8.收集细胞进行分析，或者用合适的抗生素再进行筛选。
注意：
为了检测转导效率，可以选取少量细胞用抗生素处理。
剩余的细胞可进行后续的分析。
细胞进可能用完，但不要转导后少于24h内进行分析。