化学 盐析沉淀法PPT课件
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盐析法分离蛋白质ppt(共27张PPT)
盐析机理示意图
盐析的机理
①盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解 蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏 了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；
②盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；
③盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的 极化，使水活度降低。
盐析沉淀基础
3 等电点沉淀实例
①从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝，可先于左右 进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3．O)。工业 生产胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH至除去碱性蛋白质，再调pH至除 去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。
②碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调后出现含碱性磷酸酯酶 的沉淀物，离心收集沉淀物。用的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液重新溶
解，加入20～40%饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀TrisHCl缓冲液再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。
4 有机溶剂沉淀原理图
有机溶剂沉淀实例
5 选择性热变性沉淀实例
酵母干粉中加入0.066 mol/L磷酸氢二钠溶液， 37℃水浴保温2 h，室温搅拌3 h，离心收集 上清液，升温至55℃，保温20 min后迅速冷 却离心去除热变性蛋白，上清液中多为热稳 定性较高的醇脱氢酶。
图7 不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系（25℃） (○)NaCl; (▼)KCl; (◘)MgSO4; (▲)NH4)SO4; (●)Na2SO4; (□)K2SO4; (■)柠檬酸三钠
温度的影响
pH对β的影响
蛋白质起始浓度的影响
二次盐析
盐析操作
①从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝，可先于左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3．O)。 ③盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。 ①从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝，可先于左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3．O)。 ①从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝，可先于左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3．O)。 ②碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。 不同蛋白质的溶解度曲线 图7 不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系（25℃） (○)NaCl; (▼)KCl; (◘)MgSO4; (▲)NH4)SO4; (●)Na2SO4; (□)K2SO4; (■)柠檬酸三钠 3)时，先调pH至除去碱性蛋白质，再调pH至除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。 ②碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。 3)时，先调pH至除去碱性蛋白质，再调pH至除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。 ②碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。 工业生产胰岛素(pI＝5. ②碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。 ②碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。 3)时，先调pH至除去碱性蛋白质，再调pH至除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。
化学 盐析沉淀法
一、盐析沉淀法
盐析法：
在高浓度中性盐存在下，欲分离物质在中性 盐水溶液中的溶解度降低而产生沉淀。 早在19世纪盐析法就被用于从血液中分离蛋 白质，目前该方法仍广泛用来回收或分离蛋白 质（酶）等生物大分子物质。
（一）基本原理
蛋白质的溶解特性取决于其组成、构象、周 围环境的物理化学性质以及溶剂的可利用度。 这些性质就本质而言是水分子间的氢键和蛋白 质表面所暴露出的N、O原子的相互作用，所以 易受溶液温度、pH值、介电常数和离子强度等 参数的影响。
（2）缺点：
① 沉淀物中含有大量盐析剂 ② 硫酸铵容易分解产生氨的恶臭味，产品不能 直接用于医药上
盐析法可以作为初始的提取方法，再与多种精 制手段结合起来，如采用超滤、凝胶色谱、透析 等方法将无机盐去除，就可制得高纯度产品。
阳离子对盐析效果的影响：
Al3+ > H+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Cs+ > Rb+ > NH4+ > K+ > Na+ > Li+
无机盐可按两种方式加入溶液中： 直接加入固体(NH4)2SO4粉末—工业生产
(分批加入，充分搅拌)
加入(NH4)2SO4饱和溶液—实验室和小规模生产
_ _ _ _ _ _ _ _ _
蛋白质的盐析机制示意图
蛋白质在水中的溶解度不仅与中性盐离子的浓 度有关，还与离子所带电荷数有关，高价离子影 响更显著。 通常用离子强度表示对盐析的影响。
2.5 蛋白质溶解度 2.0 1.5 lgS 1.0 0.5 0 起始蛋白 -0.5 浓度 -1.0 -1.5
50
60
盐析法：
在高浓度中性盐存在下，欲分离物质在中性 盐水溶液中的溶解度降低而产生沉淀。 早在19世纪盐析法就被用于从血液中分离蛋 白质，目前该方法仍广泛用来回收或分离蛋白 质（酶）等生物大分子物质。
（一）基本原理
蛋白质的溶解特性取决于其组成、构象、周 围环境的物理化学性质以及溶剂的可利用度。 这些性质就本质而言是水分子间的氢键和蛋白 质表面所暴露出的N、O原子的相互作用，所以 易受溶液温度、pH值、介电常数和离子强度等 参数的影响。
（2）缺点：
① 沉淀物中含有大量盐析剂 ② 硫酸铵容易分解产生氨的恶臭味，产品不能 直接用于医药上
盐析法可以作为初始的提取方法，再与多种精 制手段结合起来，如采用超滤、凝胶色谱、透析 等方法将无机盐去除，就可制得高纯度产品。
阳离子对盐析效果的影响：
Al3+ > H+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Cs+ > Rb+ > NH4+ > K+ > Na+ > Li+
无机盐可按两种方式加入溶液中： 直接加入固体(NH4)2SO4粉末—工业生产
(分批加入，充分搅拌)
加入(NH4)2SO4饱和溶液—实验室和小规模生产
_ _ _ _ _ _ _ _ _
蛋白质的盐析机制示意图
蛋白质在水中的溶解度不仅与中性盐离子的浓 度有关，还与离子所带电荷数有关，高价离子影 响更显著。 通常用离子强度表示对盐析的影响。
2.5 蛋白质溶解度 2.0 1.5 lgS 1.0 0.5 0 起始蛋白 -0.5 浓度 -1.0 -1.5
50
60
化学 盐析沉淀法PPT课件
60
70 饱和度（%）
操作方式对延胡索酸酶盐析的影响
采用间歇方式所需盐量比连续方式少； 间歇操作中，用饱和溶液精选的ppt 需盐量比用固体盐的高2。0
6.盐析法的优缺点
（1）优点： ① 室温下沉淀物在硫酸铵盐析溶液中长时间放置
不会失活，且无机盐不容易引起蛋白质变性失活； ② 非蛋白的杂质很少被夹带沉淀； ③ 适用范围广，几乎所有蛋白质和酶都能采用 ④ 设备简单，操作方便。
中性盐 破坏水膜
pH>pI,带负电， 有水膜，是稳定 的亲水胶体
中性盐 破坏水膜
+ +
+
+
中性盐
+ + 中和电荷
+ + + ++ SO42-
_+
+_ +
+ __ _+
中性盐 中和电荷
_ _
_
__
NH4+ _
或Na+
_
_ _
蛋白质沉淀
蛋白质的盐精析选pp机t 制示意图
5
蛋白质在水中的溶解度不仅与中性盐离子的浓度 有关，还与离子所带电荷数有关，高价离子影响更 显著。
中性盐
温度（oC） 0 20 40 60 80 100
(NH4)2SO4 70.6 75.4 81.0 88.0 95.3 103
Na2SO4 4.9 18.9 48.3 45.3 43.3 42.2
MgSO4
-- 34.5 44.4 54.6 63.6 70.8
NaH2PO4 1.6 7.8 54.1 82.6 93.8 101
通常用离子强度表示对盐析的影响。
2020高三化学一轮复习 第十章 实验探究 沉淀分析法中
(4)因为母液中存在Cl-和SO
2 4
,当母液循环使用时,
母
液
中
C
l
-
和
S
O
2 4
累
积
,
导
致
产
品
中
含
有
N
a
C
l
和
Na2SO4杂质,制备的产品不纯。
答案 (1)Fe(OH)3、CaCO3和Mg(OH)2
(2)防止温度下降时Na2CO3·H2O溶解,避免析出
Na2CO3·10H2O或Na2CO3·7H2O
实验探究 沉淀分析法中的几个典型问题
在有些实验中不但要把沉淀分离出来,还要准确称 量所得沉淀的质量。因此,一方面要让沉淀剂适当 过量,另一方面还要把沉淀洗涤干净。 (1)沉淀剂过量的检验 根据沉淀溶解平衡原理可知,欲使杂质离子沉淀完 全,应加入稍过量的沉淀剂。那么,如何判断沉淀 剂已加入过量呢？一般的操作方法是:把反应混合 物静置后,吸取少量上清液,置于一洁净的试管中, 再滴加少量的沉淀剂,若没有沉淀生成则证明沉淀 剂已过量。
【实验探究1】现有含KCl、K2SO4和KNO3的混合溶液, 选择适当的试剂将其转化为相应的沉淀或固体,从
而实现Cl-、SO
2 4
和NO
3
的相互分离
。相应的实验
过程可用如图表示:
(1)写出上述实验过程中所用试剂的名称:
试剂1
,试剂2
,
试剂4
。
(2)恰当地控制试剂4的加入量的方法是
。
(3)加入过量试剂3的目的是
。
(4)在加入试剂4后,获得固体D的实验操作④是
(填操作名称)。
解析
实
化学沉淀法课件
交
全交换
换
容量
容 量
工作交 换容量
一定量的树脂所具有的活性 基团或可交换离子的总数量
树脂在给定工作条件下实际 的交换能力
3. 交联度 交联度较高的树脂，孔隙较低，密度较大，离子
扩散速度较低，对半径较大的离子和水合离子的交换 量较小，浸泡在水中时，水化度较低，形变较小，也 就比较稳定，不易破碎。
4. 交换势 交换势大，交换离子越容易取代树脂上的可交换
难溶盐和难溶氢氧化物在溶液中的离子的浓度之积(称溶度积Ks)是常数，当 能结合成难溶盐的两种离子的浓度之积超过这盐的溶度积时，该盐将析出，而 这两种离子的浓度将下降，需要去除的离子就与水分离。
化学沉淀法分类
• 氢氧化物沉淀法 • 硫化物沉淀法 • 碳酸盐沉淀法 • 铬酸盐沉淀法 • 卤化物沉淀法 • 铁氧体沉淀法等。
两性树脂
二、离子交换树脂的选用
1. 离子交换树脂的有效pH范围
树脂 强酸性离子 弱酸性离子 强碱性离子 弱碱性离子 类型 交换树脂 交换树脂 交换树脂 交换树脂
有效
pH范 1~14
5~14
1~12
0~7
围
2. 交换容量
定量表示树脂交换能力的大小，单位为mol/kg(干 树脂)或mol/L(湿树脂)
• （2）沉淀剂的投加量不能太多，以免沉淀的氯化银又 与氯离子产生络合反应，使部分固体氯化银又重新溶解。
• （3）当处理电镀含银废水时，一般先采用氯化法氧化 氰，反应过程中释放出来的氯离子再与银离子发生沉淀 反应。
第四节 氧化还原法
一阶段反应，pH值越高，反应速度越快，pH值小于8.5则有放出剧毒物CNCl的危险。 CNO—在低pH条件下易水解生成NH3，且有重新溢出CNCl的危险。
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作图来表示：
dP
8 – d—S 6
dP 4
利用不同蛋白质盐析分布 曲线在横轴上的位置不同， 可采取先后加入不同量无 机盐的办法来分级沉淀蛋 白质。
2
0 20 30 40 50 60 70 P
蛋白质溶解度随(NH精4)选2pSpt O4
饱和度而变化的速率 16
2.蛋白质浓度的影响 蛋白质浓度不同，沉淀所需无机盐用量也不同。 随浓度提高，盐用量减少。
一、盐析沉淀法
盐析法：
在高浓度中性盐存在下，欲分离物质在中性 盐水溶液中的溶解度降低而产生沉淀。
早在19世纪盐析法就被用于从血液中分离蛋 白质，目前该方法仍广泛用来回收或分离蛋白 质（酶）等生物大分子物质。
精选ppt
1
（一）基本原理
蛋白质的溶解特性取决于其组成、构象、周 围环境的物理化学性质以及溶剂的可利用度。
中性盐
温度（oC） 0 20 40 60 80 100
(NH4)2SO4 70.6 75.4 81.0 88.0 95.3 103
Na2SO4 4.9 18.9 48.3 45.3 43.3 42.2
MgSO4
-- 34.5 44.4 54.6 63.6 70.8
NaH2PO4 1.6 7.8 54.1 82.6 93.8 101
这些性质就本质而言是水分子间的氢键和蛋白 质表面所暴露出的N、O原子的相互作用，所以 易受溶液温度、pH值、介电常数和离子强度等 参数的影响。
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2
蛋白质在自然环境中通常是可溶的， 表面：大部分是亲水基团 内部：大部分是疏水基团
蛋白质呈稳定 的分散状态
两性物质，一定pH下表面带有一定的 电荷，静电斥力作用使分子间相互排斥
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9
盐析效果：阴离子 > 阳离子 尤其以高价阴离子更为明显。
常见阴离子的盐析作用顺序：
PO43- > SO42- > CH3COO > Cl > NO3 > ClO4 > I > SCN
阳离子对盐析效果的影响：
Al3+ > H+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Cs+ > Rb+ > NH4+ > K+ > Na+ > Li+
12
1.无机盐加入量的影响
2.5 蛋白质溶解度 2.0
1.5 lgS 1.0
0.5 0
-0.5
-1.0 -1.5
β S0
盐析
1 234 56 μ(离子强度)
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13
蛋白质种类不同，盐析所用的无机盐量也不同
0.50
蛋白质溶解度
0 lgS
-0.50 -1.00
0 2 4 6 8 10 μ(离子强度)
蛋白质周围的水分子有序排列，在表面 形成水化膜，这一层能保护蛋白质粒子 避免因碰撞而聚沉。
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3
当向蛋白质溶液中加入中性盐时： 低盐--盐溶(低盐情况下，随着中性盐离子强度的 增加，蛋白质溶解度增大)
高盐--盐析(高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减小)
盐离子部分中和蛋白 质的电性，使分子间 排斥作用减弱
通常用离子强度表示对盐析的影响。
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6
蛋白质溶解度
2.5 2.0
1.5 lgS 1.0
0.5
起始蛋白
0
浓度
-0.5
-1.0
-1.5
β
碳氧血红蛋白的lgS
与(NH4)2SO4离子强
盐溶 度μ的关系
S0
盐析
1 234 56 μ(离子强度)
盐析区: lgS = β - Ks μ
蛋白质溶解度 常数 盐析常数 盐离子强度
8 – d—S 6
dP 4 2
30g/L
3g/L
分级沉淀： 将溶液稀释，使重叠 曲线拉开距离
制取成品： 提高蛋白质浓度
0 40 50 60 70 80 P
不同浓度碳氧肌红蛋白的精选盐ppt 析分布曲线
17
3.温度的影响 低盐浓度：温度升高，溶解度升高 高盐浓度：温度升高，溶解度降低
温度适当提高有利于蛋白质沉淀。 高温容易导致蛋白质变性。 蛋白质盐析一般在室温下进行，某些温度 敏感性的蛋白质盐析最好在低温下进行。
中性盐 破坏水膜
pH>pI,带负电， 有水膜，是稳定 的亲水胶体
中性盐 破坏水膜
+ +
+
+
中性盐
+ + 中和电荷
+ + + ++ SO42-
_+
+_ +
+ __ _+
中性盐 中和电荷
_ _
_
__
NH4+ _
或Na+
_
_ _
蛋白质沉淀
蛋白质的盐精析选pp机t 制示意图
5
蛋白质在水中的溶解度不仅与中性盐离子的浓度 有关，还与离子所带电荷数有关，高价离子影响更 显著。
不同蛋白质溶解度与离子强度的关系
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14
对于特定的蛋白质，一定操作条件下产生沉淀 时的无机盐浓度范围都是一定的，即具有一定的 蛋白质盐析分布曲线。
40
蛋白质溶解度
30
lgS 20
C0
10
0 20 30 40 50 60 70
P—不精同选pp(t NH4)2SO4 饱和度
15
蛋白质沉淀的速度可用 - —dS 对盐饱和度（P）
60
70 饱和度（%）
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7
（二）无机盐的选择
在蛋白质盐析中，常用的盐析剂有(NH4)2SO4,
Na2SO4， MgSO4，NaH2PO4，NaCl， Na3PO4,
K3PO4。 廉价
(NH4)2SO4 原因
在水中溶解度大，且溶解度随温度变 化小，低温下仍具有较大的溶解度
对大多数蛋白质的活力无损害
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8
常用盐析剂在水中的溶解度（g/100ml水）
精选ppt
18
4.pH的影响 蛋白质在pI时的溶解度最小，最容易从 溶液中析出，因此选择在被盐析的蛋白质 的pI附近。
耗盐少，蛋白质收率也高
பைடு நூலகம்
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19
5.操作方式的影响
10 固体， 间歇12h
5 酶活性
U/ml
2.5
饱和溶液，
间歇12h
1
50
饱和溶液， 连续12h
饱和溶液， 连续1.6min
精选ppt
10
无机盐可按两种方式加入溶液中：
直接加入固体(NH4)2SO4粉末—工业生产
(分批加入，充分搅拌)
加入(NH4)2SO4饱和溶液—实验室和小规模生产
(防止溶液局部过浓，但加量较多时溶液会被稀释)
精选ppt
11
（三）影响盐析的各种因素
无机盐的加入量 蛋白质的浓度 温度 pH 操作方式
精选ppt
中性盐的亲水性比蛋白质大，
盐离子在水中发生水化作用
从而使蛋白质脱去水化膜，
暴露出疏水区域
精选ppt
4
+ +
+ + ++
++ + ++
H+ OH-
_+
+_ +
+ _
__ +
__ _
__
_
_
_ _
pH<pI,带正电， 有水膜，是稳定 的亲水胶体
中性盐 破坏水膜
pH=pI时, 有水膜， 是不稳定的亲水 胶体