细胞工程第二章 细胞工程实验室组成及无菌操作技术-精选文档
细胞培养—无菌操作课件
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洁净级别—无菌药品生产所需的洁净 区可分为4个级别
• A级：高风险操作区，如灌装区、放置胶塞桶和与无菌制剂直接接 触的敞口包装容器的区域及无菌装配或连接操作的区域，应当用单 向流操作台（罩）维持该区的环境状态。单向流系统在其工作区域 必须均匀送风，风速为0.36-0.54m/s（指导值）。应当有数据证明 单向流的状态并经过验证。在密闭的隔离操作器或手套箱内，可使 用较低的风速。
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无菌操作—器皿的消毒
• 所有用到的器皿（买时已灭菌的除外）都必须经过高压灭 菌烘干后才能放入超净台内
• 已灭菌的、外包装完好的培养瓶、离心管、冻存管等可以 表面经75%酒精擦拭后直接放入超净台
• 凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的 瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面
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生物安全柜
• 生物安全柜一般是做致病菌，霉菌，酵母菌，病毒来用，操作区域 是负压，简单说是往上处抽风的，当然致病菌也不是直接抽出排到 室外，是过滤在生物安全柜的顶部漏器上，从排风量上可以分为， 50%外排型，75% 以及100%外排型。在生物安全柜内所形成的几乎没 有微生物的环境中，尽量避免使用明火，酒精灯的火焰可能会影响 室内的气流平衡。
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洗手和着装
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洗手和着装
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洗手和着装
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洗手和着装
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无菌操作—个人防护
• 在实验室工作时必须使用个体防护装备 • 个人衣服和普通实验服不能穿入细胞培养室内 • 实验室内不能穿长摆裙，短裙及短裤，不得在实验室内穿露脚趾的鞋
细胞工程(第二章)
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三、蒸汽压力消毒器
实验室中最常用的灭菌设备就是高压蒸汽灭菌器。常见 的有立式、卧式和手提式几种。
基本操作步骤： ➢向锅内注水到规定刻度，注意保持导气管通畅； ➢将待灭菌物放入锅内，盖紧锅盖； ➢通电加热，排放冷气； ➢加热至压力额定值，开始计时； ➢计时结束，切断电源，自然降压至接近零； ➢灭菌器盖微开5 min，取出灭菌物；
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五、过滤除菌装置
1. 玻璃漏斗式滤器 滤板是由玻璃粉热压而成，具有微孔，清洗麻烦，很少使用。
2. 蔡氏滤器 使用混合纤维素酯微孔滤膜，孔径有0.22微米、0.45微米等不
同规格。蔡氏滤器可分为抽滤式（负压）和加压式（正压）两种。 3. 针头式滤器
针头式加压塑料小滤器的上下部件为螺旋式连接，中间夹一层 微孔滤膜（常用孔径为0.22微米），滤器上部的进液口可直接接在 注射器上，液体经注射器加压进入滤器，经过膜过滤除菌后，由滤 器下部的出液口流出。
此外，根据不同培养目的， ABA(脱落酸)、乙烯、B9、 CCC(矮壮素)等生长抑制物质有时也被用于调节培养物的生 长发育过程，如诱导某些变态器官的发生等。
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四、其它物质
天然提取物，如椰乳、番茄汁、YE(酵母提取物) 琼脂 活性炭
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六、超净工作台
超净工作台是以空气过滤去除杂菌孢子和灰尘颗粒来达 到空气净化目的的装置，主要由鼓风机、滤板、操作台和照 明灯组成。
单人和双人，垂直和平流； 75%酒精擦拭超净台，放入器械，开紫外灯30min，关 闭紫外灯，点燃酒精灯在下火焰方进行操作。
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七、生物安全柜
生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性 标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、 实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程 中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。
细胞工程课后题答案
第二章细胞工程实验室组成及无菌操作技术1、目前，常用的植物细胞培养基种类有哪些？各有什么特点？1）MS培养基特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的平衡溶液。
2）5B培养基其主要特点是含有较低的铵，这是因为铵对不少培养物的生长有抑制作用。
3）White培养基其特点是无机盐数量较低，适于生根培养N培养基其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。
4）65）KM8P培养基其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合培养。
2、简要说明MS培养基的基本组成。
1）大量元素母液配制MS培养基的大量元素主要包括硝酸铵（NH4NO3）、硝酸钾(KNO3)、磷酸二氢钾（KH2PO4）、硫酸镁（MgSO4•7H2O）和氯化钙（CaCl2,CaCl2•2H2O）五种化合物。
2）微量元素母液配制MS培养基的微量元素由7种化合物（除Fe外）。
3）铁盐母液配制MS培养基中的铁盐是硫酸亚铁（FeSO4•4H2O）和乙二胺四乙酸二钠（Na2•EDTA）的螯合物，必须单独配成母液。
4）有机母液的配制MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、烟酸硫胺素和盐酸吡哆素。
5）激素母液配制MS培养基中的激素有生长素类、细胞分裂素3、配制培养基时，为什么要先配制母液？如何配制母液？为了避免每次配制时都要称量各种化学药品，常常把培养中必需的一些化学药品，以10倍、50倍或100倍的量，配制成一种浓缩液，这种浓缩液被称为母液。
配制母液不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移去，而且还便于低温保藏。
确定培养基--按照扩大倍数称量--溶解--按顺序混合--定容--母液分装--贴标签--保存于冰箱。
大量元素应配成浓度为10倍的母液，--般将微量元素配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。
配置时化合物应分别称量，分别溶解;混合时注意先后顺序，防止产生沉淀;混合时要边搅拌边混合。
4、常用的灭菌方法有哪些，各有哪些优缺点？（一）物理灭菌1）湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）优点：高温高压蒸汽对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡，是一种最有效的灭菌方法。
细胞工程细胞工程实验室组成及无菌操作技术精选文档
倒置显微镜
分注器
血球计数器
磁力搅拌器
移液器
8、其它辅助设备
①培养基灌装机及洗瓶机
②空调机：用于接种 室和培养室温度的控 制。
③ 除湿机：使培 养室的湿度保持在
定的范围内。
⑤冰箱：用于在常温下易变 性或失效的试剂和母液的储 藏，细胞组织和试验材料的 冷冻保藏，以及某些材料的 预处理。
锅内温度达121℃。在此蒸气温度下，可以很快 杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
(2)使用方法：首先检查灭菌锅内是否有水，而且水
刚好淹住加热器，然后放入灭菌材料，对称拧紧灭菌锅 上的螺丝，关闭放气阀通电。待压力上升到0.05MPa时， 打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭 放气阀。三次放气后，关阀再通电，压力表上升达0.10.15Mpa时，维持20min后，断电，待压力降至零时，打 开入气阀，取出灭菌材料。
④烘箱：用于干燥洗净后的玻 璃器皿，还可用80℃的温度烘 干组织培养植物材料以测定干 物质。
⑥ 纯 水 机 与 蒸 馏 水 发 生 器
⑦天平：天平包括分析天平，电 子天平，药物天平等，用于制备 母液时培养基组成成分的称取。 如一些需要量少的激素和微生素 类物质，天平的精确度要到 0.0001g，这就要求精确度更高的 分析天平。
（4）培养室：
培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需 要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和 节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性 能。
培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设4-5层， 最低一层离地高约l0cm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左右。 培养架长度都是根据日光灯的长度而设计， 如采用40W日光灯，则长1.3m， 30W的长lm，宽度一般为60cm。
细胞工程-第二章 细胞工程基础上精品文档
不含固醇
大 小 ， 复 杂 程 比细菌大几倍至几十倍， 小，简单
度
结构复杂
第二章 细胞工程基础
(1)真菌形态结构及类型
单细胞真菌 圆形或卵圆形 酵母菌(yeast)
二相性(dimorphic)
多细胞真菌 菌丝和孢子， 丝状菌(filamentous fungus)
交织成团 1.菌丝 hypha
或霉菌(mold)
毒性强，各种细菌的外毒素 毒性弱，各种细菌内毒素 对某些组织细胞有特殊的亲 的毒性作用相似。全身性 和力，引起特异性病变。 、致发热、腹泻、呕吐。
抗原性
强，能刺激机体产生抗毒素 弱，不能刺激机体产生抗
。经甲醛处理，可脱毒成为 毒素。不能经甲醛处理成
类毒素。
为类毒素。
致热性
对宿主不致热
致热性。常致宿主发热
第二章
第一节
细细胞革胞生兰物工氏学程基阳基础性础菌细胞壁
革兰氏阳性菌细胞壁
第二章 细胞工程基础
革兰氏阴性菌细胞壁
细胞壁的结构
第二章 细胞工程基础
第一节 细胞生物学基础
• 细胞膜 • 厚约8-10nm，外侧紧贴细胞壁。一些行光合作用的原核生物，
质膜具有与捕光反应有关的内褶。一些革兰氏阳性菌质膜内 褶形成小管状结构，称为间体 。
分裂中的链球菌
分裂中的大肠杆菌
第二章 细胞工程基础
（3）细菌毒素 细菌产生对机体有毒害作用的化学物质，称 为毒素。包括内毒素和外毒素。
特性
外毒素
内毒素
产生细菌 主要是革兰氏阳性菌
主要为革兰氏阴性菌
来源
由活的细菌释放至菌体外
是细菌细胞壁成分，细菌 崩解后释放出来
化学成分 毒性
生物技术概论2细胞工程
第二章 细 胞 工 程
第二章 细 胞 工 程
• 三、植物细胞原生质体的制备与融合
• （一）原生质体的制备 • 1. 取材与除菌 • 2. 酶解 • 3. 分离 • 4. 洗涤 • 5. 鉴定
第二章 细 胞 工 程
• （二）原生质体的融合
• 1. 化学法诱导融合
第二章 细 胞 工 程
• 五、人工种子的研制
• （一）人工种子的构成及特点 • 1. 人工种皮 • 2. 人工胚乳 • 3. 胚状体
第二章 细 胞 工 程
• 人工种子具有以下突出的优点：
• ①可以不受环境因素制约，一年四季进行工厂化生产； • ②由于胚状体是经人工无性繁育产生，有利于保存该种系 的优良性状； • ③与试管苗相比，人工种子成本更低，更适合于机械化田 间播种； • ④可根据需要在人工胚乳中添加适量的营养物、激素、农 药、抗生素、除草剂等，以利胚状体的健康生长。
第二章 细 胞 工 程
• （三）杂合体的鉴别与筛选
• 1. 杂合细胞的显微镜鉴别
• 2. 互补法筛选杂合细胞
• 3. 采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体 • 4. 根据融合处理后再生长出的植株的形态特征进行鉴别
第二章 细 胞 工 程
• 四、单倍体植物诱发与利用
• （一）花药培养
• 1. 选取成熟度适中的花蕾或幼穗 • 2. 花药预处理 • 3. 选择适当的培养基与培养条件
第二章 细 胞 工 程
第二章 细 胞 工 程
• 2. 外植体的消毒灭菌
第二章 细 胞 工 程
• 对外植体除菌的一般程序如下： • 外植体→自来水多次漂洗 • →消毒剂处理→无菌水反复冲洗
细胞工程实验室配置及基本技术
用蔗糖调节外，常用的还有甘露醇，山梨
醇等。
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§3.培养条件
六.气体影响
CO2、 O2
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§3. 培养条件
六.气体影响
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§4.离体培养的营养需求
一.无机盐类 二.有机化合物 三.植物激素 四.其它附加成分
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§4.离体培养的营养需求
一.无机盐类
消毒器、紫外灯。
无菌操作设备 净化工作台、接种箱。 光温控制设备 时间程序控制器、空调及温度感应器。 细胞培养设备 培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、
摇床、 生物反应器等。
细胞学鉴定设备 光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜。
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§2.实验室设置
二.基本设备配置
灭菌设备
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§3.培养条件
四.pH值
通常使用的pH值范围是5.0～6.5。pH在 4.0以下或7.0以上培养物就不能正常生长。
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§3.培养条件
五.渗透压
事实上为了某些培养需要，在设计培养基
时就应该考虑渗透压的问题，如White培
养基的渗透压为0.15个大气压，MS培养基
为1.9个大气压。此外，培养基的渗透压除
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§2.基本技术
一.洗涤技术
洗涤方法 玻璃器皿洗涤 新的玻璃器皿 已使用过的试管、烧杯、三角瓶 吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品 塑料用品洗涤 一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较 强，因此冲洗时必须反复多次，最后用 蒸馏水冲洗。 金属用品洗涤 金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤， 需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火 焰干燥。 第12页/共32页
第二章 细胞工程基本理论及其基本操作技术课件高中生物竞赛
微生物以及它们的芽孢或袍子，使物体成为无菌状态 消毒：是非彻底杀菌，即用物理或化学等方法，杀死物体上的有
害物质，但不能杀死全部芽孢 防腐：是抑菌过程，即用化学或物理方法，防止或抑制微生物生
长繁殖
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实验室常用于细胞工程的 三种消毒灭菌方法：物理法、化学法、抗生素法 1）物理法：
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要求 1、掌握 组织培养的概念及相关 2、掌握植物组织培养技术中 营养条件有哪些 3、掌握培养基中必不可少 的六大类无机盐元素 4、了解各无机盐元素的生理功能
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有机化合物
糖 类：
1）作用：既可作为C源，又可维持细胞的渗透压；
胁迫作用
2）原因：通常植物本身能进行光合作用，不需要从
外部供给糖，但植物组织培养进行异养的情况下，大
可根据需要配制成 弱、中、强三种。 弱 用重铬酸钾50g加入蒸馏水1L，加热溶化，冷却后再缓慢加
入浓硫酸90ml。 中 用重铬酸钾50g加入蒸馏水100ml，加热溶化，冷却后再缓
慢加入浓硫酸875ml。 强 与浓硫酸加热的同时缓慢加入磨碎的重铬酸钾，直到重铬
酸钾达到饱和为止。一般浓硫酸1L加入重铬酸钾50g
在胡萝卜胚状体的分化中，仅含硝酸盐是不能分化，只有 铵盐同时存在时才会产生胚状体的分化。
植物组织从培养基中吸收NO3-和NH4+后，经过一系列的反应转 化成氨基酸，进而合成蛋白质，成为植物体的主要组成部分
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无机盐类
磷：常用的是磷酸盐，是植物必需元素之一。 磷参与植物生命过程中的核酸合成、蛋白质合
是一种全新的植物组织培养技术, 是环境控制技术和组培技术的有机结合。
其特点在于: 1）以CO2 代替糖作为植物体的碳源,利用工程技术手段调节组培 微环境的空气、光照、湿度等影响因子,促进植物体自养生长 。 2）提高苗的质量和产苗率,缩短培养周期。
【精品】细胞工程基础和植物部分
指应用细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来对细胞的遗传表型进行定向改造，以获得新型生物或一定细胞产品的一门综合性科学技术.胚胎移植实质上是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转换,而胚胎本身的遗传物质并不发生改变，因此各种性状均能保持其原来的优良特性.植物组织培养（PlantTissueCulture）：指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、原生质体等培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽，或者长成新的完整植株的一种实验技术.主要用于植物快速繁殖的组培技术plantcellCulture）：是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养并使其增殖,获得大量细胞群体的一种技术。
plantCellTotipotency）：植物每一个具有完整细胞核的体细胞，都含有植物体的全部遗传信息,在适当条件下，具有发育成完整植株的潜在能力.分化：细胞后代在形态结构和功能上发生稳定性的差异的过程。
PlantCellDedifferentiation）：也称去分化，指离体条件下生长的植物细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或不分化细胞的过程.再分化(redifferentiation):脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在特定的条件下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生形成单极性的芽或根，或经历胚胎发生形成双极性的胚状体，进一步发育成完整植物体的过程。
Callus）：植物受到机械、动物或微生物等伤害后，创伤部位的细胞脱分化而不断增殖形成松散排列、无特定结构和功能的非器官化组织。
explant）：指将用于离体培养的各种植物材料,如器官、组织、细胞和原生质体等。
当继代培养时，将原培养物切割或不切割转移至新的培养基中的部分也称之为外植体。
细胞工程基本技术
四、培养用品的清洗
在培养物中无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件，因此对培 养器皿的清洗和灭菌是极为重要的环节。
清洗的目的是清除杂质和微生物,使器皿内不残留任何影响细胞生长 的成分(有害物质、微生物、细胞碎片及非营养性化学成分）。
三．电离辐射消毒
○ 适用于消毒量大和不适于做高压或滤过的用品。
三．湿热灭菌
湿热灭菌即高压蒸气灭菌，是最常用和最有效 的一种方法。布类、胶塞、金属器械、玻璃器 皿及某些培养用液都可用此法消毒灭菌。
各种物品有效消毒灭菌压力和时间不同，一般 培养用液、橡胶制品要求10磅(114℃)，10～ 20分钟或8磅(112℃)30分钟。布类、玻璃制 品、金属器械等为15磅(12l℃)20分钟。
玻璃滤器适用于各种培养液的滤过除菌。玻璃滤器根据滤板的孔 径分为G1一G6几种规格，一般采用G6型(孔径在1.5μm以下)， 可达到除菌目的。
微孔滤膜滤器，应选用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌。 各种滤器必须先经高压蒸气消毒、烤干后方可使用。
2. 化学消毒法
3. 消毒剂
○ 细胞培养室的工作面、家具、墙壁、地面和空气等可用消毒剂进 行灭菌处理。如：75％酒精常用于皮肤和瓶皿开口部位的消毒； 0.1％新洁尔灭是目前最常用的消毒剂，可以对器械、皮肤、操 作面进行擦拭和浸泡消毒；乳酸可用于空气消毒：来苏儿可用于 地面消毒；过氧乙酸消毒能力很强，在0.5%的浓度下，10min 就可将芽孢菌杀死。甲醛是一种光谱灭菌剂，其水溶液和气体对 各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。
○ 支原体的污染是一个常见而棘手的问题，外观 上看不出明显的变化，实际上或多或少的影响 到细胞的众多机能。目前尚无有效的防范措施。 可通过支原体培养、PCR及电镜观察等方法进行 检测。
细胞工程
第二章细胞工程实验室组成及无菌操作技术植物细胞培养基的组成成分1.无机化合物大量元素(major element) ：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S微量元素(minor element) ：Fe、B、Zn、Cu、Mn、Co、Mo2.有机化合物（1）维生素：直接参与酶的形成以及蛋白质、脂肪的代谢，常用的有维生素VB1(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、VB3（烟酸）、VB9(叶酸)、肌醇以及维生素•C(抗坏血酸)等（2）氨基酸：甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等（3）其他有机附加物：水解酪蛋白（CH）、椰子汁（CM）、麦芽浸出物（ME）、酵母浸出物（YE）等3.碳源和能源常用蔗糖，作为碳源和能源，同时也可维持一定的渗透压；也可用葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖等。
4.植物生长调节物质(Plant growth regulator)（1）生长素类(auxin)：促进细胞生长和分裂，用于诱导愈伤组织的形成和根的分化，常用的有2,4-D、IAA、NAA和IBA等（2）细胞分裂素类(cytokinin)：促进细胞分裂；诱导愈伤组织或器官的分化，常用6-BA、KT、ZT等（3）赤霉素类:常用赤霉酸(GA3)，可促进幼苗茎的伸长生长和胚状体发育成小植株（4）脱落酸（5）乙烯5.固化剂常用琼脂，一般用量为0.6～1.0％，有时可配成不加固化剂的液体培养基，进行液体浅层培养，液体培养有如下优点：低成本、生长快、移栽成活率高等。
6.其他成分：活性炭、硝酸银、抗生素等动物细胞培养基的组成、常用培养基类型、常用溶液培养基的成分1.糖类：作为碳源和能源，主要是葡萄糖，含量一般为1g/L（低糖）或4.5g/L（高糖）2.氨基酸：12种必需氨基酸3.维生素：包括叶酸、维生素B、烟酰胺和吡哆醇等4.无机盐类：大量元素包括Na+、K+、Ca2+、Mg2+、PO43-等，微量元素包括Cu2+ ，Zn2+ 和Mn2+等。
细胞工程实验室组成及无菌操作技术
质体的浅层液体培养。 ➢ 果酱瓶— 常用作试管苗大量繁殖。
2、计量器皿：吸管、量筒、容量瓶、移液器（刻 度移液管、微量移液器）等
3、盛装器皿：烧杯、试剂瓶等 4、接种工具：镊子、剪刀、解剖刀、接种针、酒
精灯等。 5、新型材料器皿：塑料培养瓶、封口膜等 6、分注器
基本的设备：工作台、药品柜、冰箱等、培养基分装
器、蒸汽压力灭菌锅等。
②接种室/无菌操作室： 功能：是进行接种、继代、细胞融合等无菌
操作的场所。 要求：封闭性好，干燥清洁明亮，防止空气
对流。外应设缓冲室、更衣室 。
基本的设备：超净工作台（接种箱）、电热灭菌器、喷雾
消毒器、紫外灯、酒精灯等。
③培养室 功能：是对接种到培养瓶的离体材料进行控制培养的 场所。 要求：是要能控制光照和温度，应保持干燥和清洁， 防止微生物感染。
第二节、无菌操作技术
一、实验器皿及洗涤 二、灭菌和消毒的方法 三、植物无菌操作的一般程序
一、实验器皿及洗涤
1、玻璃器皿
常用的各种规格的培养瓶、培养皿、吸管、离心管等。
①浸泡： 清水、5%稀盐酸 ②刷洗：软毛刷蘸洗涤剂 ③酸洗：铬酸洗涤液 ④冲洗：自来水冲洗、蒸馏水漂洗
2、塑料器皿
主要有多孔培养板、培养皿及培养瓶等。
此外，根据实验目的进行观察、分析和操作等其它配套。
一、实验室组成
1．基本实验室 ①准备室/化学实验室 ②接种室/无菌操作室 ③培养室
2．辅助实验室 细胞学实验室 生化分析室 摄影室及暗室
3. 移栽设施/温室
1．基本实验室
①准备室/化学实验室: 功能： 就是进行一切与实验有关的准备工作。 要求： 宽敞明亮，通风条件好 ，地面便于清洁并 应防滑处理。
chapter2 植物细胞工程基本技术
（6）熏蒸灭菌
长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方 法：甲醛、高锰酸钾熏蒸。甲醛的用量通常按每 立方米空间2-6毫升计算，高锰酸钾的用量是甲醛 的一半。室内准备妥当后，把称好的高锰酸钾放 在瓷碗或烧杯内(最好在碗或杯下面铺一张报纸， 以利清洗)，然后将甲醛也倒入碗或杯内，立即出 屋关门。几秒钟后，甲醛溶液即沸腾挥发。高锰 酸钾是一种氧化剂，当它与一部分甲醛作用时， 由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥发为气体。
2、高硝态氮培养基
硝酸钾含量高，氨态氮的含量低，含有较高的 VB1。主要适合与木本植物、十字花科植物和单子 叶植物的组织和花药培养。主要有B5、N6、SH培养 基。
3、中等无机盐含量培养基
大量元素约为MS培养基的一半，微量元 素种类减少，但含量较MS的高，维生素种类 比MS多，如增加了生物素、叶酸等。适合于 花药培养，主要有Nitch，NT、H、Miller培 养基。
1.2 培养基配制间
60平方米左右，配备的主要仪器设备有 ：冰 箱、天平、微波炉、pH计、培养基分装器、药品 柜、器械柜、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、 培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶 等。冰箱以体积180-200L为宜，用于储存培养基 母液、激素维生素等贵重药品、彩色胶卷、及保 存植物材料。天平应有不同感量。
1.3 消毒间
配备实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、
细菌过滤设备、干热消毒柜、电炉等。灭菌锅 的选择应根据不同的要求选择不同型号的灭菌 锅。一般实验室可选用小型的医用手提式高压 灭菌锅，较大的实验室可选用立式自动控制压 力和温度的灭菌锅。生产性的实验室可选用大 型的卧式灭菌锅。
如果没有条件的话，可以将上述工作间 合并成一个准备间，要求是设备的安装和排列 要合理、房间要宽敞、明亮、透风，地面要便 于清洁、防滑。
细胞工程——精选推荐
细胞工程第1章细胞培养的设施与基本条件1、什么是细胞培养？细胞培养是最值培养的一种形式，所谓组织培养（tissue culture）习惯上泛指所有的体外培养，即器官培养、组织培养和细胞培养的总称。
其本意是指从活的机体中提取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术称为组织培养。
2、细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法分离为单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单细胞层生长，或在培养液呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养。
3、细胞工程实验室与其他一般实验室的主要区别：严格保持无菌环境，避免微生物及其他有害因素的影响。
4、细胞工程实验室设计–原则防止微生物污染和有害因素影响–要求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘划分不同功能区或用铝合金隔板隔开无菌操作区应在室内较少走动的内侧–清洗和消毒安置在另室5、细胞工程实验室核心部分：准备室、缓冲间、培养室6、细胞培养设备⏹CO2培养箱：CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5％CO2 。
⏹使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。
②保持培养箱内空气干净。
定期消毒（90 ℃，14 h)。
③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。
7、生物安全防护水平（BSL）由一级防护屏障（安全设备）和二级防护屏障（实验室设施）组合构成四级生物安全水平。
一级生物安全防护水平（BSL－1）：适合于非常熟悉的病源，不会经常引发健康成人疾病，对实验人员和环境潜在危险小。
一般也不使用特殊的遏制设备和设施。
二级生物安全防护水平（BSL－2）：适合于对人和环境有中度潜在危险的病源，应在生物安全柜中或其它物理遏制设备中进行。
三级生物安全防护水平（BSL－3）：该会引发严重的、可能致死的疾病的病源。
在生物安全柜或其他物理遏制装置中进行，或由穿戴合适防护服及设施的实验人员进行。
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⑤冰箱：用于在常温下易变 性或失效的试剂和母液的储 藏，细胞组织和试验材料的 冷冻保藏，以及某些材料的 预处理。
④烘箱：用于干燥洗净后的玻 璃器皿，还可用80℃的温度烘 干组织培养植物材料以测定干 物质。
⑥ 纯 水 机 与 蒸 馏 水 发 生 器
⑦天平：天平包括分析天平，电 子天平，药物天平等，用于制备 母液时培养基组成成分的称取。 如一些需要量少的激素和微生素 类物质，天平的精确度要到 0.0001g，这就要求精确度更高的 分析天平。
70%—75%的酒精或0.5%过氧乙酸喷洒擦拭消毒工作台面 。 3、操作区不允许放置不必要的物品，保持洁净、气流通畅。整个
实验过程中，实验人员应按照无菌操作规程操作。
4、使用完毕，应擦净工作台面。
2、高压蒸气灭菌锅
用于培养基、蒸馏水和接种器械的灭菌消毒。
(1)高压蒸气灭菌锅工作原理：
在密闭的蒸锅内，0.1MPa的压力下，
无菌操作室
培养室 细胞生物学实验室
辅助实验室
温
室
生化分析实验室
一、实验室组成
1、组成
化学实验室、洗涤室、无菌操作室 （接种室）、培养室、细胞学实验室和温室 或大棚等。
（1）化学实验室（准备室）：
完成所使用的各种药品的贮备、称量、 溶解、配制、培养基分装等。 主要设备： 药品柜、防尘橱（放置培养容 器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常 用的培养基配制用玻璃仪器。
①带日光灯的培养架，主要用于接种后材料的培 养。
②恒温箱：又称培养箱，可用于原生质体和酶 制剂的保温，也可用于组织培养材料的保存及 暗培养。
③摇床与转床：在液体培养基中，可改善培养 基中的培养材料的通气况。如从疏松的愈伤 组织中获得单个细胞。但注意要设定适合的温 度及转速。
恒 温 振 荡 培 养 箱
⑧酸度计： 用于校正培养基和酶制剂的PH。
⑨温室（大棚）：
第二节 无菌操作技术
一、实验仪器及洗涤 二、常用灭菌和消毒方法
一、实验仪器及洗涤 1、 玻璃器皿的选择与清洗
试管 三角瓶
培养皿 培养瓶
制光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照 10-16h，也有的需要连续
照明。短日照植物需要短日照条件，长日照植物需要长日照条件。现代组培
实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源， 而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。
主要设备：培养架（控温控光控湿）、摇床、培养箱、紫外光源
0.15Mpa时，维持20min后，断电，待压力降至零时，打
开入气阀，取出灭菌材料。
(3)注意事项： ①对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、
接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要
严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中
的成分变质或效力降低，不能随意延长时间；
②对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。
主要内容：
第一节 细胞工程实验室组成
第二节 无菌操作技术 第三节 培养基组成及其配制
学习的目标与要求：
了解细胞工程实验室的组成及所需的各种
实验仪器，掌握细胞工程中各种实验仪器的操 作及无菌操作技术，了解细胞工程所用培养基 的组成成分及配制。
第一节 细胞工程实验室组成
准备室（通用实验室）
基本实验室 实验室 组成 缓冲室
（2）洗涤、灭菌室：
完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培 养基的灭菌等。 主要设备：水池、操作台、高压灭菌锅、 干燥灭菌器（如烘箱）等。
（3）无菌操作室（接种室）：
主要用于动植物材料的消毒、接种、培 养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制 备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。 主要设备：紫外光源、超净工作台、消 毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、 解剖刀、接种针）等。
锅内温度达121℃。在此蒸气温度下，可以很快 杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
(2)使用方法：首先检查灭菌锅内是否有水，而且水
刚好淹住加热器，然后放入灭菌材料，对称拧紧灭菌锅 上的螺丝，关闭放气阀通电。待压力上升到0.05MPa时，
打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭
放气阀。三次放气后，关阀再通电，压力表上升达0.1-
培养架长度都是根据日光灯的长度而设计， 如采用40W日光灯，则长1.3m，
培养室最重要的因子是温度，一般保持在20-27℃左右，具备产热装置，并安 装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度， 最好不同种类有不同的培养室。
室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70%～80%为好，可安装加湿器。控
洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20-30min；
③高压灭菌前后的培养基，其pH值下降0.2-0.3单
位。因此，调PH值时，可适当调高0.1－0.3个单
位。
④接通电源前一定要加入足量的水。
3、相关仪器
电炉
推车
酒精灯
封口膜
接种器具
灭菌器
培养瓶
4、接种工具
酒精灯 接种针
镊子
解剖刀
5、培养设备
光 照 培 养 箱
6、细胞培养设备
摇 床
7、细胞学鉴定设备 光学研究显微镜、实 体显微镜、倒置显微 镜
光 学 显 微 镜
倒置显微镜
分注器
血球计数器
移液器
磁力搅拌器
8、其它辅助设备
①培养基灌装机及洗瓶机
②空调机：用于接种 室和培养室温度的控 制。
③ 除湿机：使培 养室的湿度保持在 定的范围内。
等。
二、基本设备及使用
1、接种设备：无菌超净工作台
用于培养材料的消毒及接种。使用前， 将超净工作台上面的排风和杀菌按钮开启，
灭菌15min后，关闭杀菌按钮，打开照明 按钮，即可在上面进行操作。
超净工作台
超净工作台使用注意事项
1、使用超净工作台前，应提前开机并开启紫外灭菌灯30分钟以上。
2、使用超净工作台时，关闭紫外灭菌灯，开启日光灯，并用
（4）培养室：
培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需 要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和 节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性 能。
培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设4-5层，
最低一层离地高约l0cm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左右。 30W的长lm，宽度一般为60cm。