考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量.doc..

分光光度计的分类
红外分光光度计: 测定波长范围为 大于760 nm的 红外光区
可见光分光光度计:
测定波长范围为 400~ 760 nm的 可见光区
测定波长范围为 200～400 nm的 紫外光区
紫外分光光度计:
可见光谱
可见光范围内波长和颜色的关系
分光光度计的基本结构
无论哪一类分光光度计都包括：光源、单 色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光 度计各部件的次序如图所示:
质反应虽然比较缓慢， 但是可以被洗脱下去， 所以可以用来对电泳条 带染色。
在一定蛋白质浓度范围内 (1～1000µg/ml）, 蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白 质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
由于蛋白质－染料复合物具有很 高的消光系数，因此大大提高了蛋白 质测定的灵敏度（最低检出量为 1µg）。
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6待测
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来自百度文库
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摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色
A595nm 0 ？ ？ ？ ？ ？ ？
1.如黑板上表格操作 2.绘制标准曲线：以A595nm为纵坐
标，标准蛋白含量为横坐标，在坐 标纸上绘制标准曲线。
的优缺点。 2.在考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度时，当蛋 白质浓度偏高时，为什么曲线会适当下斜?
考马斯亮蓝G-250在游离状态
下呈红色，最大光吸收在 465nm；当它与蛋白质结合 后变为青色，蛋白质-色素结 合物在595nm波长下有最大 光吸收。其光吸收值与蛋白质 含量成正比。
蛋白质与考马斯亮蓝G250的
结合十分迅速，约2min即可 反应完全，其复合物在1h内 保持稳定。
考马斯亮蓝R250与蛋白
A=lg(1/T)=Kbc
A为吸光度; T为透光度,是透射光强度比上入射光强度（I/I0); c为吸光物质的浓度; b为吸收层厚度(光程）.
物理意义 当一束平行单色光垂直通过某一吸光物质时,其吸 光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比.
思考题
1.蛋白质的测定方法有几种？比较各种方法
入射光 强度 Io 单色器 样品池 透射光 强度 I
光源
检测器 及仪表
光照射到物质上，物质的分子结构决定 哪些特定波长的光被吸收。这一现象符 合符合朗伯－比耳定律。
入射光强度 Io 透射光强度 I
样品浓度c
光程 b
当一束平行单色光(I0)照射有色溶液时，光的一部 分被吸收，一部分透过溶液(I)
朗伯—比尔定律:
【器材与试剂】
（一）器材 1. 可见光分光光度计 2. 刻度移液管 3. 移液枪 （二）试剂 1. NaCl （0.15mol/L） 2. 考马斯亮蓝试剂 3. 蛋白质标准液 （1mg /mL） 4. 待测蛋白质溶液
试管编 号 标准蛋 白溶液 （mL） 0.15mol/ L NaCl （mL） 考马斯 亮蓝试 剂（mL）
考马斯亮蓝法（Bradford法） 测定蛋白质含量
【实验目的】 1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量
测定蛋白质的原理与方法。
2. 熟练分光光度计的使用和
操作方法。
【实验原理】
考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于 染料结合法的一种。 考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕 红色，最大吸收峰在465nm；当它与蛋白 质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色， 其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数 更大。
3.算出待测蛋白质浓度？
【分光光度法的基本原理和分光光度计的 使用方法】
定义: 分光光度法是利用物质所特有的吸 收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术。 特点: 灵敏、精确、快速和简便，在复杂组 分系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的 极少量物质。 应用: 生物化学研究中广泛使用的方法之 一，广泛用于糖，蛋白质，核酸，酶等的快速定 量检测。