考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量.doc..
实验二 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
实验二考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量一、目的与要求1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法2. 熟练分光光度计的使用和操作方法。
二、实验原理考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。
它在酸性溶液中呈棕红色，最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。
考马斯亮蓝G-250—蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内，595nm下光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。
考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。
附：（一）、分光光度法原理：光的吸收定律（朗伯-比尔定律）：一束单色光(强度为I0)通过某吸光物质的溶液时,其光能量的被吸收与该物质浓度的关系符合朗伯—比尔定律即当入射光波长、温度和溶液的厚度一定时，吸光度与溶液的浓度成正比。
用公式表示为：T = I／I0则A = lg（1／T）=Kbc式中T —透光率I —透过光强度I0—入射光强度 A —吸光度K —比例常数 b —溶液的厚度 c —溶液的浓度（二）、离心机的使用说明：1.要离心的离心管和管套要称重，重量不等时将水加在管套里。
2．离心管的放置是对角线放置，要求必须对称。
3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间，定好时间后缓慢旋转转速旋钮，使离心机均匀的提速到预定转速。
（三）、分光光度计的使用说明：1.接通电源开关，预热20min后，再选择须用的单色光波长。
2.放入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿（溶液装入4／5高度，置第一格）置于光路上，调节100％透射比按钮，使吸光度值A=0.00。
3.推动试样架拉手，使样品比色皿置于光路上，读出吸光度值。
4.测量完毕，取出比色皿，洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。
5.电源开关置于“关”，拔下电源插头。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
蛋白质的含量测定
目前常用的5种经典方法： 凯式定氮法（Kjedahl法） 紫外吸收法 双缩脲法（Biuret法） Folin-酚试剂法（Lorry法） 考马斯亮蓝法（Bradford法）
（一）凯式定氮法
原理： 蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催 化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与 硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离， 用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根 据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。
Bradford 法的优点
(1)灵敏度高 其最低检测蛋白质含量可达1ug/ml,
这是因为蛋白质与染料相结合后产生 的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有 更高的吸光系数 ,因而光吸收要比Folin –酚试剂法大得多。
(2)测定快速,简洁
只需要加一种试剂，完成一个样品 的测定，只要5分钟左右。由于染料与 蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即 可完成，其颜色可以在1小时内保持稳 定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的 稳定性最好。
(3)干扰物质少 一些阳离子如K+、Mg+、Na+和硫酸铵 等不干扰测定。
干扰物质：去污剂、 SDS、TritonX-100 、0.1 MNaOH
Bradford 法的缺点
(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含
量不同，因此 Bradford 法用于不同蛋白质时有较
大的偏差，最好选用与待测样品氨基酸成份相同 的标准蛋白。 (2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质 有去污剂等。 (3)标准曲线也有轻微的非线形，因而不能用比尔定 律进行计算而只能用标准曲线来测定未知蛋白质 的浓度。
缺点： 操作比较复杂、费时（8-10小时） 灵敏度低，适用于0.2-1.0mg氮测定。
考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量：分光光度的使用
2．校正 （1）打开吸收池暗室盖，调节[0% T]旋钮， 使数字显示为“00.0”，将参比溶液置于光路， 盖上吸收池盖，调节透光率[100% T] 旋钮， 数字显示为“100.0”。 （2）如果显示不到“100”，则可适当增加电 流放大器灵敏度档数，当改变灵敏度 后必须重 新校正“0”和“100”。 （3）按（1）连续几次调整“00.0”和 “100.0”后，将选择开关置于“A”，调节吸光 度调零旋钮，使数字显示为“.000”，即可进行 吸光度A的测量.
考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋 白质含量：分光光度的使用
【实验目的】
1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测
定蛋白质的原理与方法。 2. 熟练分光光度计的使用和操作
方法。
【实验原理】 考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量 属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝 G250在酸性溶液中呈棕红色，最大吸 收峰在465nm；当它与蛋白质通过范 德华键结合成复合物时变为蓝色，其 最大吸收峰移至595nm，而且消光系 数更大。
灵敏度
0
100
暗盒盖
调波长旋钮
比色皿拉杆
1．调整
（1） 接通电源。 （2） 调波长调节器至所需波长。 （3） 开启电源开关，指示灯亮，选择开关置
于“T”，将灵敏度旋钮调至”1”档位，调节透 光率[100%T]。预热20min . 预热仪器应在不测定时，将比色皿暗箱盖打开， 使光路切断。
液。残渣用2.0ml蒸馏水悬浮，
4000rpm离心10min，合并上清液并含量测定:
取3支试管，各吸取样品提取液0.1ml，
加入考马斯亮蓝G250试剂3.0ml，充分振荡
混合,放置5min后，测 A595值。
3. 根据A595值，在标准曲线上求出样品中蛋 白含量。
蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250max λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。
根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重) =）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μSDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。
图1 考马斯亮蓝标准法根据线性拟合公式y=a x+b计算所测溶液的蛋白质的含量。
（二）SDS干扰数据和图表2 考马斯亮蓝SDS干扰实验表格根据表2，以A595为纵坐标，SDS浓度为横坐标，作图2。
实验九考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度含( Bradford 法)
1
0 1.0
2
0.1 0.4
3
0.2 0.3
4
0.3 0.2
5
0.4 0.1
6
0.5 0
考马斯亮蓝
蛋白质浓度 (μg/ml) O.D595
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
混匀，室温静臵３min，以第１管为空
பைடு நூலகம்
白，于波长595nm处比色，读取吸光度，
以吸光度为纵坐标，各标准液浓度为
横坐标作标准曲线．
２、样液的测定
另取2支干净的试管，加入样品液0.5
ml及考马斯亮蓝染液3.0 ml，混匀，
室温静臵3 min, 于波长595nm处比色，
读取吸光度，由样品的吸光度查标准
曲线求样品含量。
思考题
在考马斯亮蓝法测定蛋白质含量中 需要注意那些事项？
量的去污剂如Triton X-100，SDS，玻璃去污剂有少
量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。
考马斯亮蓝染色法的缺点：
1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的
含量不同,因此 Bradford 法用于不同蛋白质时有较
大的偏差。因为研究发现，染料主要是与蛋白质中的
碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相
结合。 2.显色剂的稳定性较差。 3.溶液中有大量去污剂的存在是对颜色影响太大,不 宜使用此法测定蛋白质含量。
三、试剂和器材
1、试剂 （1） 考马斯亮蓝试剂 考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 ml 95%乙醇中，加入100 ml 85%磷酸，用蒸馏 水稀释至1000 ml。 （2） 标准蛋白质溶液 牛血清蛋白或卵其清白蛋白等，预先测 定其蛋白纯度，再根据纯度用蒸馏水或0.9 ％NaCl 准确配制。
蛋白质含量测定法
实验一 蛋白质含量测定法[实验目的]1． 掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法 2． 掌握紫外吸收法测定蛋白质含量的方法一．考马斯亮蓝法（Bradford 法）[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250max λ−−→−+-[器材与试剂]（一） 器材1． 722型和753型可见光分光光度计 2． 漩涡混合器 3． 试管16支 （二） 试剂1． 标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.03mg/ml 和0.103mg/ml 。
2． 考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]1． 标准方法 （1） 取10支试管，分别编号后按 表1-1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
（2） 加完染料20min 后，使用722分光光度计（灵敏度4），塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A 595。
（3） 用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，查表即可求得未知样品的蛋白质含量。
2． 微量法取10支试管，分别编号后按 表1-3 剂量依次加入稀释的标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
其他步骤同上，不过使用753分光光度计（狭缝4）。
3． SDS 干扰实验 （1） 取5支试管，分别编号后按表1-5剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
（2） 加完染料20min 后，使用753分光光度计（狭缝4），塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]（一） 标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 （1.03mg/ml ） 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 未知蛋白质 （约0.5mg/ml ）0.04 0.08 0.10 蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.06 0.02 0 考马斯亮蓝 G-250试剂 3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0对应的吸光度A 5950.200 0.311 0.362 0.483 0.624 0.752 0.845 0.387 0.501 0.572根据表1，以A 595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg ）为横坐标，作图1。
蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250m ax λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。
根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重)=）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μ以蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
计算出回归方程。
如Y=aX+b让后把待测样品的吸光值代入回归方程，算出待测样品浓度 SDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。
(完整word版)考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。
如核糖核酸酶或溶菌酶。
去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。
如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。
2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。
如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。
通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。
4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。
染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。
注意，显色反应不得超过30min．6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。
注意：考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。
待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。
适用范围考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。
当考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从465nm 变为595nm。
在考马斯亮蓝G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝G-250 从吸收峰为465nm 的形式转变成吸收峰为595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。
一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量欧阳学文一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。
因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作（一）、试剂：1、考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
2、标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（）。
2、移液管使用（）。
（三）、标准曲线制作：1、A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
1）、利用标准曲线查出回归方程。
2）、用公式计算回归方程。
3）、或用origin作图，测出回归线性方程。
即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。
4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。
（四）、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。
（五）、注意事项：1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。
实验1考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
蛋白质含量的测定
微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法（Lowry法） 双缩脲法（Biuret法） 紫外光吸收法 考马斯亮蓝法（Bradford法）
▪ 实验类型——基础验证型
实验目的
掌握和学习考马斯亮蓝G-250染色法 测定蛋白质含量的基本方法。
五 思考题
测定蛋白质含量还有哪些方法， 测定原理有哪些不同？
移液枪的使用方法
量程的调节 枪头（吸液嘴）的装配 移液的方法 移液器的正确放置 维护保养时的注意事项
吊钩 手柄
移液控制及调节旋纽 吸/枪头推出器
数字显示器
枪杆
移液枪的结构
1.量程的调节 ！！看清量程再调节
千万不要将按钮旋出量程， 否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。
➢ 吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出 残留于管尖的溶液。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的 吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。(0.5ml以下的都要吹）
➢ 吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中， 以免污染吸量管及试剂。
➢ 吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应 及时用自来水冲洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上 冲洗，待实验完毕后，用自来水冲洗干净，晾干备用。
/mL
0
10
蛋白质浓度
(μg/mL)
A595
3
4
5
6
7
0.2
0.4
0.6
0.8 1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
4.0
4.0
4.0
4.0 4.0
20
40
60
考马斯亮兰法测定蛋白质含量
考马斯亮兰法（bradford法）蛋白质含量测定一、实验原理双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
二、试剂与器材2.1 试剂：①标准蛋白质溶液：0.1mg/ml牛血清蛋白(bsa)：称取牛血清蛋白25mg，加入去离子水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用去离子水稀释至100mL即可。
②考马斯亮兰g-250染料试剂：称取25mg考马斯亮兰g-250，溶于12.5ml 95%乙醇后，再加入30mL85%磷酸，用去离子水稀释至250mL，贮存于棕色瓶中。
常温下可保存一个月。
2.2 仪器及器材：紫外可见分光光度计、具塞试管、研钵、离心机、离心管（2mL）、移液器等。
三、操作方法3.1 标准曲线的绘制①取7支具塞试管，按照表1加入相应试剂，每加完一管，立即充分混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。
表1考马斯亮兰法实验表②放置5min，在595nm处测定吸光度，空白对照为第1号试管。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。
塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
③用标准蛋白质浓度（mg/ml）为横座标，吸光度值A595为纵座标，绘制标准曲线。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量的流程
考马斯亮蓝法测蛋白质含量的流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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Bradford法蛋白质含量的测定
Bradford法蛋白质含量的测定
原理：这一方法基于考马斯亮蓝G-250 有红蓝两种不同的形式。
在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。
反应化合物在 465-595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量。
溶液：
1）Bradford储存液
100ml95%乙醇
200ml88%磷酸
350mgServaG蓝
室温下长期保持稳定。
2）Bradford工作液
425ml双蒸水
15ml95%乙醇
30ml88%磷酸
30ml Bradford储存液
用滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，可保存数周，但在使用前需要过滤。
3）配制1mg/ml牛血清蛋白（BSA）
做标准曲线：
取样品即可测量。
注意事项：
1、样品制备，样品制备是做好2-d 的关键，样品中离子浓度不能过大，最好用新
鲜的样品提取蛋白质，如果不确定蛋白提取情况，建议先跑sds-page检验。
2、上样量的问题， ipg 胶条是13 厘米的上样量在50ng-80ng之间，上样量不合适，丰度低的将会被丰度高的所遮盖。
3、ipg 胶条ph 的选择，根据不同样品选择不同pH值。
4、针对不同的蛋白质，分离胶的浓度需调整。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量
实验一 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量【实验目的】1．掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理和过程。
2．熟悉蛋白质含量测定的影响因素。
【实验原理】1976年Bradford 等建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，迅速、灵敏的定量测定蛋白质的方法。
染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465 nm 变为595 nm ，光吸收增加。
蛋白质-染料复合物具有较大的吸光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1 g 蛋白。
染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。
由于该法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
N CH 2CH 3CH 2N +CH 3CH 2CH 2NHCH 3CH 3O CH 2CH 3SO 3-SO 3Na蛋白质+ 蛋白质-染料复合物H +考马斯亮蓝G-250（蓝色，λmax595nm ）【仪器与试剂】1．紫外-可见分光光度计，微量注射器。
2．考马斯亮蓝G-250，95%乙醇，85%(W/V)磷酸。
【实验步骤】1．标准蛋白质溶液的配制称取牛血清白蛋白适量，加水溶解并配制成1 mg/ml 的溶液。
2．蛋白试剂的配制称取100 mg考马斯亮蓝G-250，加入95%乙醇50 ml溶解，再加入85%(W/V)磷酸100 ml，将溶液用水稀释至1000 ml。
试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%乙醇和8.5%(W/V)磷酸。
3．标准曲线的制作取标准蛋白质溶液5、10、20、50、100 μl于小试管中，用水稀释至0.1 ml，然后分别加入5 ml蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。
以0.1 ml水及5 ml蛋白试剂作为空白对照。
以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量依据。
4．样品测定取含10~100 μg蛋白质溶液于小试管中，加水稀释至0.1 ml，然后加入5 ml 蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量(原理
考马斯亮蓝法测蛋白质含量(原理考马斯亮蓝法（Bradford Assay）是一种常用的蛋白质含量测定方法。
它基于蛋白质与一种铜离子络合的原理，通过测定在碱性条件下蛋白质-考马斯亮蓝配合物与吸光度之间的关系，来确定蛋白质含量。
考马斯亮蓝法有以下几个特点：1. 敏感度高：考马斯亮蓝法对大多数蛋白质具有很高的灵敏度，可以检测到微量的蛋白质。
2. 特异性好：虽然考马斯亮蓝法可以测定多种类型的蛋白质，但对不同蛋白质的反应程度是有差别的，因此它在特异性上表现较好。
3. 操作简便：考马斯亮蓝法具有简单、快速、稳定性好等优点，非常适合大规模蛋白质含量的测定。
4. 利用范围广：除了用于测定溶液中的蛋白质含量外，考马斯亮蓝法还可用于固相蛋白质含量测定、酶联免疫吸附试验（ELISA）等领域。
1. 制备标准曲线：首先需要制备一组蛋白质浓度已知的标准溶液，常用的标准蛋白质有牛血清白蛋白、胰蛋白酶等。
将这组标准溶液分别加入少量试剂和适量去离子水，制备出一系列不同浓度的样本溶液，用吸光度计测定它们的吸光度值，并以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 取待测样本：从所需样本中挑选适量，加入量一般为10~100 μg，用去离子水稀释至一定浓度。
3. 添加试剂：向标准溶液和样品中分别加入适量的考马斯亮蓝试剂，0.5 ml的试样通常需要添加0.1 ml试剂。
4. 摇匀反应：使用磁力搅拌器或振荡器将样品和试剂充分混合，使反应达到最大化。
5. 测定吸光度：待反应结束后，用吸光度计测定样品的吸光度值，一般在595 nm波长处读数。
6. 读取浓度：根据标准曲线，将测出的吸光度值与标准曲线上对应浓度值对照，就可以推测样品中蛋白质的含量。
需要注意的是，考马斯亮蓝法本身也有一些缺陷。
例如，不同蛋白质的反应程度有差别，容易受到其他物质的影响而产生误差。
此外，在测定含有其他物质的样品中，需要对反应条件进行优化和校正，才能更准确地测定蛋白质含量。
考马斯亮蓝测蛋白实验报告
考马斯亮蓝测蛋白实验报告Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】实验二：分光光度计的学习之考马斯亮蓝G-250法（Bradford法）测定蛋白质含量定一实验目的学习分光光度计的基本原理和使用方法，并使用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量。
二实验原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。
该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
三实验材料1. 实验材料：未知浓度的牛血清样品2. 主要仪器：试管、移液枪、分光光度计等。
3. 试剂：蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。
此溶液在常温下可放置一个月。
四实验步骤标准曲线制作：取6 支10mL 干净的试管，按表1 取样。
摇匀后放置2min ，用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。
表1 低浓度标准曲线制作上图数据标准曲线如下：拟合标准方程：y=+2．未知蛋白质浓度的测定另取2 支10mL 试管，按下表取样。
吸取测定液，蒸馏水 mL放入试管中，加入5mL 考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂，充分混合，放置2min 后用1cm 光径比色杯在595nm 下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测品提取液中蛋白质的含量X（μg）。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量5
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一，原理1、考马斯亮蓝G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料最大吸收峰位置由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为亮兰色.染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合.2、蛋白质-染料复合物在595nm下测定的吸光度与蛋白质的浓度成正比.二，Bradford法优点1)灵敏度高其最低检测蛋白质含量可达1ug/mL,这是因为蛋白质与染料相结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的吸光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化要比其它方法大得多。
2)测定快速、简洁只需要加一种试剂；完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。
染料与蛋白质结合的过程大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间颜色的稳定性最好。
3)干扰物质少一些阳离子如K+、Mg2+、Na+和硫酸铵等不干扰测定。
干扰物质：去污剂SDS、TritonX-100三，Bradford法缺点(1)由于各种蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford 法用于不同蛋白质时有较大的偏差.(2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有去污剂等.(3)标准曲线也有轻微的非线形,因而不能用比尔定律进行计算，只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度.四，试剂与器材1.试剂(1)标准蛋白质溶液,用牛血清蛋白配制成0.1mg/ml。
(2)考马斯亮兰G-250染料试剂:称100mg考马斯亮兰G-250,溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml85 %的磷酸,用水稀释至1L后过滤使用。
2.器材(1)可见光分光光度计(2)试管3，操作管号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0(0.1mg/ml)未知蛋白质 0.2 0.4 0.6蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4考马斯亮蓝 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0充分混匀后，两分钟于595nm处比色。
考马斯亮蓝 法测定蛋白质含量
二、Bradford法(一）、原理：考马斯亮蓝G250 ( CBB- G-250）与蛋白质结合后形成蓝色的化合物，在595nm有最大吸收峰，且蓝色的深浅与蛋白浓度成正比。
这是一种快速、准确、重复性好的蛋白质定量方法。
该方法快速、准确、干扰因素少。
CBB- G-250在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在2小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的干扰。
但较高浓度的十二烷基硫酸钠（Soldium dodecyl sulfate），Triton X－100等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照品来消除。
（二）器材及试剂1、器材A. 分光光度计B. 微量加样器C. 移液管、试管及试管架D. 坐标纸2. 试剂（1）考马斯亮蓝G-250溶液：称取CBB- G-250 100毫克溶于50 ml 95%(V/V)乙醇溶液中，然后加入100毫升85%（V/V）磷酸，最后加蒸馏水定容至1000毫升。
（2）0.14mol/L 氯化钠溶液（生理盐水）（3）标准蛋白质溶液（0.1mg/ml）：精确称取10.0毫克牛血清白蛋白，用生理盐水定容至100毫升。
(4) 血清样品(已稀释200倍)(5) 层析样品(三）、操作（标准曲线制作）：取7支试管按下表操作：混匀，室温放置5分钟，在595nm测定各管O.D值并以蛋白浓度为横坐标，以O.D 值为纵坐标绘制标准曲线．以Bradford法测定层析分离蛋白内的蛋白浓度取试管从层析样品中各取20.0ul，加入生理盐水20ul,最后加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0ml，混匀，以595nm 波长测定二者光密度，在标准曲线上查出其蛋白浓度以上需要购买的试剂有：1、标准蛋白质即牛血清白蛋白。
教学内容：实验八考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量【实验目的】1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法2. 熟练分光光度计的使用和操作方法【实验原理】此方法是1976年Bradform建立。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验报告
考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验报告考马斯亮蓝法（Bradford assay）是一种常用于测定蛋白质含量的实验方法。
本文将对考马斯亮蓝法进行详细介绍，并展示一个实验报告的范例。
1. 引言蛋白质是生命体中不可或缺的重要分子，因此准确测定蛋白质的含量对于生物学研究至关重要。
考马斯亮蓝法是一种常用的蛋白质测定方法，其原理基于蛋白质与考马斯亮蓝染料之间的非共价结合。
2. 实验目的本实验的目的是利用考马斯亮蓝法测定给定溶液中蛋白质的含量。
3. 实验步骤3.1 准备工作首先，准备好所需的试剂和设备，包括考马斯亮蓝试剂、蛋白质标准品、显微管、离心机等。
3.2 制备标准曲线按照给定的浓度，分别取一系列蛋白质标准品，加入不同的显微管中。
然后，加入适量的考马斯亮蓝试剂，充分混合。
将显微管放入离心机中离心，使液体沉淀。
离心后，取出显微管，观察颜色变化，并使用分光光度计测定吸光度。
3.3 测定待测样品将待测样品加入显微管中，加入适量的考马斯亮蓝试剂，充分混合。
然后，将显微管放入离心机中离心，使液体沉淀。
离心后，取出显微管，观察颜色变化，并使用分光光度计测定吸光度。
4. 结果与讨论通过测定标准曲线，我们可以得到各个蛋白质标准品的吸光度与浓度之间的关系。
利用这个关系，我们可以计算出待测样品中蛋白质的浓度。
在实验中，我们观察到显微管中的液体颜色会随着蛋白质浓度的增加而加深。
这是因为考马斯亮蓝染料与蛋白质发生非共价结合，形成复合物，使溶液变色。
吸光度的测定则是通过分光光度计来实现的。
需要注意的是，考马斯亮蓝法对于某些物质的干扰较大，因此在实验中应该选择适当的样品稀释倍数，以确保测定结果的准确性。
5. 结论通过考马斯亮蓝法，我们成功测定了给定溶液中蛋白质的含量，并得到了标准曲线。
通过标准曲线，我们可以计算出待测样品中蛋白质的浓度。
6. 结束语考马斯亮蓝法是一种简单、快速且准确的测定蛋白质含量的方法。
它被广泛应用于生物学研究和实验室工作中。
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分光光度计的分类
红外分光光度计: 测定波长范围为 大于760 nm的 红外光区
可见光分光光度计:
测定波长范围为 400~ 760 nm的 可见光区
测定波长范围为 200～400 nm的 紫外光区
紫外分光光度计:
可见光谱
可见光范围内波长和颜色的关系
分光光度计的基本结构
无论哪一类分光光度计都包括：光源、单 色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光 度计各部件的次序如图所示:
A=lg(1/T)=Kbc
A为吸光度; T为透光度,是透射光强度比上入射光强度（I/I0); c为吸光物质的浓度; b为吸收层厚度(光程）.
物理意义 当一束平行单色光垂直通过某一吸光物质时,其吸 光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比.
思考题
1.蛋白质的测定方法有几种？比较各种方法
考马斯亮蓝法（Bradford法） 测定蛋白质含量
【实验目的】 1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量
测定蛋白质的原理与方法。
2. 熟练分光光度计的使用和
操作方法。
【实验原理】
考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于 染料结合法的一种。 考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕 红色，最大吸收峰在465nm；当它与蛋白 质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色， 其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数 更大。
【器材与试剂】
（一）器材 1. 可见光分光光度计 2. 刻度移液管 3. 移液枪 （二）试剂 1. NaCl （0.15mol/L） 2. 考马斯亮蓝试剂 3. 蛋白质标准液 （1mg /mL） 4. 待测蛋白质溶液
试管编 号 标准蛋 白溶液 （mL） 0.15mol/ L NaCl （mL） 考马斯 亮蓝试 剂（mL）
的优缺点。 2.在考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度时，当蛋 白质浓度偏高时，为什么曲线会适当下斜?
0
1
2
3
4
5
6待测
0
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.10
0.10
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0
5
5
5
5
5
5
5
摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色
A595nm 0 ？ ？ ？ ？ ？ ？
1.如黑板上表格操作 2.绘制标准曲线：以A595nm为纵坐
标，标准蛋白含量为横坐标，在坐 标纸上绘制标准曲线。
入射光 强度 Io 单色器 样品池 透射光 强度 I
光源
检测器 及仪表
光照射到物质上，物质的分子结构决定 哪些特定波长的光被吸收。这一现象符 合符合朗伯－比耳定律。
入射光强度 Io 透射光强度 I
样品浓度c
光程 b
当一束平行单色光(I0)照射有色溶液时，光的一部 分被吸收，一部分透过溶液(I)
朗伯—比尔定律:
3.算出待测蛋白质浓度？
【分光光度法的基本原理和分光光度计的 使用方法】
定义: 分光光度法是利用物质所特有的吸 收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术。 特点: 灵敏、精确、快速和简便，在复杂组 分系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的 极少量物质。 应用: 生物化学研究中广泛使用的方法之 一，广泛用于糖，蛋白质，核酸，酶等的快速定 量检测。
质反应虽然比较缓慢， 但是可以被洗脱下去， 所以可以用来对电泳条 带染色。
在一定蛋白质浓度范围内 (1～1000µg/ml）, 蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白 质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
由于蛋白质－染料复合物具有很 高的消光系数，因此大大提高了蛋白 质测定的灵敏度（最低检出量为 1µg）。
Hale Waihona Puke 考马斯亮蓝G-250在游离状态
下呈红色，最大光吸收在 465nm；当它与蛋白质结合 后变为青色，蛋白质-色素结 合物在595nm波长下有最大 光吸收。其光吸收值与蛋白质 含量成正比。
蛋白质与考马斯亮蓝G250的
结合十分迅速，约2min即可 反应完全，其复合物在1h内 保持稳定。
考马斯亮蓝R250与蛋白