免疫实验免疫学和免疫检测技术试验培训课件
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免疫实验免疫学和免疫检 测技术试验
2、加于淋巴细胞分离液上层，离心：500g 20min
（小于1000rpm)
！沿管壁滴加
!淋巴细胞分离液取法
离心
单个核细胞 （斜面！）
3、吸出细胞，悬于营养缓冲液（1～2倍量含5IU/ml 肝素、2％灭活小牛血清的PBS液 ），离心：200g 10min，除去血小板。
37℃，1hr，洗涤液洗涤三次
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
9
验
3、加酶标抗体、荧光标记抗体：
•所有ELISA各孔均加100ul（已稀释好,稀释倍数：2000
•各荧光孔不加酶标抗体，加荧光标记抗体100ul,(已稀释 好，稀释倍数：50)
•！！！注意！！！ 荧光怕见光，注意避光，加液、保温时都要避光
4、洗涤：同样营免养疫实液验免洗疫涤学和2免次疫检，测洗技术去试 淋巴细胞分离
2
液，离心： 500g 10min 验
5、检查细胞存活率： （1）将1滴细胞悬液和1滴台盼兰混匀，静置5-10分钟。 （2）上述混合液滴入细胞计数板，在显微镜下观察细 胞，计数活细胞数和死细胞数。
三、注意事项：
1。血液制品
5、酶标仪上测各孔492nm的光吸收。
打印直线附在实验报告上！
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
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验
实验三、纳米金免疫检测技术
一、实验原理：
以双抗体夹心法为例。
在硝酸纤维素膜的膜片上滴加纯化的抗体，为膜所吸 附。当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中含 抗原被膜上抗体捕获，其余无关蛋白等滤出膜片。其 后加入的胶体金标记的抗体也在渗滤中与已结合在膜 上的抗原相结合。因胶体金本身呈红色，阳性反应即 在膜中央显示红色斑点。
二、操作：
1、抗体包被：（同实验二）
2、加样本：同实验二，但在本实验中不做标准曲
线，样品加两个稀释浓度，如1：20，1：40，另外
加一个阳性对照（用人IgG标准），每孔做一个复
孔，加空白对照共计8孔。
3、加荧光抗体：从这里开始与实验二不同之处是
一定要记得避光操作。按照要求加入一定稀释度的
给蛋白质一定吸附时间，否则下步的洗涤有可能将蛋 白洗掉！）。
2. 洗涤、封闭：点加10ul 含1%BSA的PBS洗涤（BSA 作用是封闭），待干（注意别让BSA覆盖前一步抗 原），另点1个点（作为阴性对照）。
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
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验
3. 点加金标抗体： 金标记抗体稀释至1：25-1：50，点加10ul，即可在 阳性对照点处观察到红色斑点，而阴性对照则无。
•标准抗原1-5的浓度分别为： 50，100，200，300，500ng/ml (都从500ng/ml加，分别加10，20，40，60，100ul至各 孔，再分别补加90，80，60，40，0ul保温液即可)
•荧光各孔：阴性对照：Ab-Ag-FITC-Ab，阳性对照用 200ng/ml，500ng/ml
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
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验
三、注意事项：
1．斑点大小控制。 2．勿用力戳破膜。 3．给第一抗体和封闭蛋白（BSA）一定吸附时间。 4．把你的实验结果粘贴于实验报告上，报告测定结果， 指出阳性点和阴性点。
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
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验
实验四、免疫荧光检测技术
一、基本原理：
荧光双抗夹心法定位与定量抗原
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
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验
一、原理（续）
测定方法：
酶联免疫测定法应用非常广泛。具体操作方法随测定对 象及测定要求的不同而有很大差异。
液相 固相吸附测定法——酶联免疫吸附测定法(ELISA)简称 酶标法。
酶标法的基本测定方法有三类：
即间接法(抗原-抗体-酶标抗抗体) 双抗体(夹心)法(抗体-抗原-酶标抗体) 抗原竞争法。
18孔的安排：
ELISA
百度文库
荧光免疫
套上包装袋，
4℃过夜，
弃上清，以
洗涤液(200ul) 空 标准：S1-S5 阴 阳
洗涤三次，甩 干。
白 对 照
性性 对对 照照
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
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关于对照、平行！！！ 验
2、加抗原：
！！！稀释抗原用加BSA的保温液稀释！！！ 如上页图所示，加抗原，空白和荧光阴性对照加含BSA 的保温液
酶联免疫测定法实质上是将专一性很强的、十分 灵敏的、能够定量进行的抗原抗体结合反应与高催化效 能的酶促反应偶联在一起的一种分析方法。它除了用来 测定抗体外，原则上适用于一切可以诱导动物产生相应 抗体的抗原和半抗原物质的测定。其特点是专一性强， 灵敏度高，操作简便，无须特殊设备，特别适用于测定 成分复杂的体液及组织中的微量生命物质，而且几乎不 受其他物质的干扰。
2。注意将稀释后的血轻轻地沿管壁铺在细胞分离液上，
避免破坏其界面。
3。在收集单个核细胞时，预先将毛细滴管中的气体排
空，再将毛细滴管轻轻插入单个核细胞层，沿管壁轻轻
旋转吸取细胞，千万不能吹打，以免影响细胞的收集效
果。
免疫实验免疫学和免疫检测技术试 验
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实验二、酶联免疫检测技术 （ELISA）
一、实验原理：
37℃，45min，取出后保温平衡10分钟,洗涤液洗涤三次， 荧光各孔可不洗
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
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验
4、观察荧光、ELISA各孔加底物：
一组同学观察荧光、一组同学加酶底物。 酶底物溶液要现配，由老师或同学代表配制一份即可。 各孔加100ul，37℃保温15min。
终止酶反应：各孔加4mlol/L硫酸50ul终止。
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
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验
本次实验检测血清IgG，应用的是双抗体夹心法。
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验
二、实验方法：
1、包被抗体： 包被抗体浓度为：用包被液稀释（包被聚苯乙烯要
在偏碱性条件下进行，所以该包被液用pH9.6的碳酸盐 缓冲溶液）抗体至10或20ug/ml，每孔加100ul。加18孔
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验
一、实验原理
本实验不用夹心法，直接加抗原，再加金标抗体。
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验
二、实验操作：
1. 点加抗原：（人IgG）： 在硝酸纤维素膜下垫吸水材料（卫生纸），用微量移 液器取3ul抗原溶液点于硝酸纤维素膜上，注意点样 时要逐次点于膜上，待前次所点液体渗入后再继续点， 不要使斑点太大，同时注意不要太用力将膜点破，致 使斑点太大。 烤干或吹干，保证抗原能够吸附到膜上，
2、加于淋巴细胞分离液上层，离心：500g 20min
（小于1000rpm)
！沿管壁滴加
!淋巴细胞分离液取法
离心
单个核细胞 （斜面！）
3、吸出细胞，悬于营养缓冲液（1～2倍量含5IU/ml 肝素、2％灭活小牛血清的PBS液 ），离心：200g 10min，除去血小板。
37℃，1hr，洗涤液洗涤三次
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
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3、加酶标抗体、荧光标记抗体：
•所有ELISA各孔均加100ul（已稀释好,稀释倍数：2000
•各荧光孔不加酶标抗体，加荧光标记抗体100ul,(已稀释 好，稀释倍数：50)
•！！！注意！！！ 荧光怕见光，注意避光，加液、保温时都要避光
4、洗涤：同样营免养疫实液验免洗疫涤学和2免次疫检，测洗技术去试 淋巴细胞分离
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液，离心： 500g 10min 验
5、检查细胞存活率： （1）将1滴细胞悬液和1滴台盼兰混匀，静置5-10分钟。 （2）上述混合液滴入细胞计数板，在显微镜下观察细 胞，计数活细胞数和死细胞数。
三、注意事项：
1。血液制品
5、酶标仪上测各孔492nm的光吸收。
打印直线附在实验报告上！
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
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验
实验三、纳米金免疫检测技术
一、实验原理：
以双抗体夹心法为例。
在硝酸纤维素膜的膜片上滴加纯化的抗体，为膜所吸 附。当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中含 抗原被膜上抗体捕获，其余无关蛋白等滤出膜片。其 后加入的胶体金标记的抗体也在渗滤中与已结合在膜 上的抗原相结合。因胶体金本身呈红色，阳性反应即 在膜中央显示红色斑点。
二、操作：
1、抗体包被：（同实验二）
2、加样本：同实验二，但在本实验中不做标准曲
线，样品加两个稀释浓度，如1：20，1：40，另外
加一个阳性对照（用人IgG标准），每孔做一个复
孔，加空白对照共计8孔。
3、加荧光抗体：从这里开始与实验二不同之处是
一定要记得避光操作。按照要求加入一定稀释度的
给蛋白质一定吸附时间，否则下步的洗涤有可能将蛋 白洗掉！）。
2. 洗涤、封闭：点加10ul 含1%BSA的PBS洗涤（BSA 作用是封闭），待干（注意别让BSA覆盖前一步抗 原），另点1个点（作为阴性对照）。
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
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验
3. 点加金标抗体： 金标记抗体稀释至1：25-1：50，点加10ul，即可在 阳性对照点处观察到红色斑点，而阴性对照则无。
•标准抗原1-5的浓度分别为： 50，100，200，300，500ng/ml (都从500ng/ml加，分别加10，20，40，60，100ul至各 孔，再分别补加90，80，60，40，0ul保温液即可)
•荧光各孔：阴性对照：Ab-Ag-FITC-Ab，阳性对照用 200ng/ml，500ng/ml
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
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验
三、注意事项：
1．斑点大小控制。 2．勿用力戳破膜。 3．给第一抗体和封闭蛋白（BSA）一定吸附时间。 4．把你的实验结果粘贴于实验报告上，报告测定结果， 指出阳性点和阴性点。
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
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验
实验四、免疫荧光检测技术
一、基本原理：
荧光双抗夹心法定位与定量抗原
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
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验
一、原理（续）
测定方法：
酶联免疫测定法应用非常广泛。具体操作方法随测定对 象及测定要求的不同而有很大差异。
液相 固相吸附测定法——酶联免疫吸附测定法(ELISA)简称 酶标法。
酶标法的基本测定方法有三类：
即间接法(抗原-抗体-酶标抗抗体) 双抗体(夹心)法(抗体-抗原-酶标抗体) 抗原竞争法。
18孔的安排：
ELISA
百度文库
荧光免疫
套上包装袋，
4℃过夜，
弃上清，以
洗涤液(200ul) 空 标准：S1-S5 阴 阳
洗涤三次，甩 干。
白 对 照
性性 对对 照照
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
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关于对照、平行！！！ 验
2、加抗原：
！！！稀释抗原用加BSA的保温液稀释！！！ 如上页图所示，加抗原，空白和荧光阴性对照加含BSA 的保温液
酶联免疫测定法实质上是将专一性很强的、十分 灵敏的、能够定量进行的抗原抗体结合反应与高催化效 能的酶促反应偶联在一起的一种分析方法。它除了用来 测定抗体外，原则上适用于一切可以诱导动物产生相应 抗体的抗原和半抗原物质的测定。其特点是专一性强， 灵敏度高，操作简便，无须特殊设备，特别适用于测定 成分复杂的体液及组织中的微量生命物质，而且几乎不 受其他物质的干扰。
2。注意将稀释后的血轻轻地沿管壁铺在细胞分离液上，
避免破坏其界面。
3。在收集单个核细胞时，预先将毛细滴管中的气体排
空，再将毛细滴管轻轻插入单个核细胞层，沿管壁轻轻
旋转吸取细胞，千万不能吹打，以免影响细胞的收集效
果。
免疫实验免疫学和免疫检测技术试 验
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实验二、酶联免疫检测技术 （ELISA）
一、实验原理：
37℃，45min，取出后保温平衡10分钟,洗涤液洗涤三次， 荧光各孔可不洗
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
10
验
4、观察荧光、ELISA各孔加底物：
一组同学观察荧光、一组同学加酶底物。 酶底物溶液要现配，由老师或同学代表配制一份即可。 各孔加100ul，37℃保温15min。
终止酶反应：各孔加4mlol/L硫酸50ul终止。
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
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本次实验检测血清IgG，应用的是双抗体夹心法。
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
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二、实验方法：
1、包被抗体： 包被抗体浓度为：用包被液稀释（包被聚苯乙烯要
在偏碱性条件下进行，所以该包被液用pH9.6的碳酸盐 缓冲溶液）抗体至10或20ug/ml，每孔加100ul。加18孔
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
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一、实验原理
本实验不用夹心法，直接加抗原，再加金标抗体。
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
13
验
二、实验操作：
1. 点加抗原：（人IgG）： 在硝酸纤维素膜下垫吸水材料（卫生纸），用微量移 液器取3ul抗原溶液点于硝酸纤维素膜上，注意点样 时要逐次点于膜上，待前次所点液体渗入后再继续点， 不要使斑点太大，同时注意不要太用力将膜点破，致 使斑点太大。 烤干或吹干，保证抗原能够吸附到膜上，