过氧化物酶同工酶的提取分离

(3)凝胶的质量决定因素：
（1）凝胶度：
是指100mg凝胶溶液中含有单体（Acr）和交联剂 （Bis）的总克数，用T%表示。
（2）交联度：
是指凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的 百分数，用C%表示。 一般浓缩胶的浓度为7.5%，分离胶的浓度为10%。
聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和
该红棕色的物质可用分光光度计在470nm处测定其消光值， 即可求出该酶的活性。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1． 材料：小麦幼苗
2． 仪器：
（1）分光光度计；
（2）移液管
（3）离心机（4 000r/min）； （4）研钵
(5)垂直板电泳装置（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）；
(6)稳流稳压电泳仪；
3、电泳：
(1)定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷
相反的电极方向移动的现象。
(2)影响电泳效果的因素：
①带电颗粒的大小和形状：
颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；
②颗粒的电荷数：
电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；
③溶液的粘度：
粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；
续(2)影响电泳效果的因素：
不连续PAGE电泳胶体系统的组成：
电泳系统
缓冲液 pH 胶体浓度
1 上层 (负极) 缓冲液 Tris-glycine 8.3
-
2 样本溶液
Tris-glycine 8.3
-
3胶
浓缩胶 Tris-HCl
6.7
5%
4体
分离胶 Tris-HCl
8.9
7%
5 下层 (正极)缓冲液 Tris-glycine 8.3
(2)聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：
① 聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长 链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起；
② 链的纵横交错形成三维网状结构，使凝胶具有分 子筛的性质；
③ 网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使 凝胶具有抗对流的作用；
④ 长链富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶； ⑤ 该结构不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。
②光聚合：
催化剂是核黄素（VB2），在痕量氧存在下，核黄素 光解形成无色基，无色基再被氧氧化成自由基，激活单体 发生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于 制备大孔径的浓缩胶。
■ 聚合反应：
聚合反应
架桥物造成分枝
Bis 交错连结 Bis
free radical
端点自由基 可再延续
自由基形成
a与b的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，a 与b的重量比应在30左右。常用29 ： 1
(4)不连续PAGE的原理：
第一、三个不连续性： ①凝胶孔径的不连续； ②缓冲液离子组成及各层凝胶pH的不连续； ③在电场中形成的电位梯度的不连续。
第二、不连续系统中的三种物理效应： ①电荷效应： ②分子筛效应: ③浓缩效应:
（7）高速冷冻离心机；
（8）电子天平；
（9）电冰箱；
（10）瓷盘、微量进样器； （11）电热恒温水浴锅；
（12） S-22pC可见分光光度计；（13）电炉等
3、试剂：
（1）1N HCl：用12N的浓盐酸来配制； （2）分离胶缓冲液（pH8.9的Tris-HCl缓冲液）： （3）浓缩胶缓冲液（pH6.7 Tris-HCl缓冲液）： （4）分离胶丙胶贮液（Acr-Bis贮液Ⅰ）： （5）浓缩胶丙胶贮液（Acr-Bis贮液Ⅱ）： （6）过硫酸铵溶液（NH4）2S2O8简写Ap：（当天配制）； （7）核黄素溶液：8% （8）电极缓冲液：（pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液） （9）40%蔗糖： （10）pH4.7乙酸缓冲液：
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作 为载体的一种区带电泳。
(1)聚丙烯胺凝胶的生成：
聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲 叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。在具 有自由基时，Acr和Bis就会聚合。
引发产生自由基的方法有两种：
①化学法 ②光聚合法
①化学聚合：
引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’－ 四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生氧自由基， 激活单体形成自由基，发生聚合。化学聚合形成的凝胶孔 径较小，且重复性好，用来制备分离胶；
实验四
过氧化物酶同工酶的提取、分离
学时：9
一、实验目的：
1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法； 2、掌握过氧化物酶(POD)活性测定的原理及方法。 3、了解过氧化物酶(POD)的生物学功能。
二、实验原理:
1、过氧化物酶：
过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、 光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发 生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物 酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发 现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织 老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在 受到重视。
④溶液的pH值： 影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，
反之越快； ⑤电场强度：
电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快； ⑥离子强度：
离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快； ⑦电渗现象：
电场中，液体相对于固体支持物的相对移动； ⑧支持物筛孔大小：
孔径小，电泳速度慢，反之则快。
4、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
-
■ 在浓缩胶中的三个主要作用角色：
甘氨酸: pH=8.9 负电荷 pI=6.7 不带电荷
Cl-1:
蛋白质(酶):
小分子
大分子
■ 浓缩效应：
A
B
C
8.0
样 本
浓
缩
6.7
胶
离子缺乏空间
分
离 胶
8.9
+
+
5、过氧化物酶活性测定
以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物， 在此酶存在下，H2O2可ห้องสมุดไป่ตู้邻甲氧基苯酚氧化成红棕色 的4-邻甲氧基苯酚，其反应为：
二、实验原理:
2、同工酶概念：
同工酶指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分 子结构组成却有所不同的一组酶。
同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等 都有一定的关系，如POD在细胞代谢过程中与呼吸作用，光 合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同 工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。
孔径大小均取决于两个重要参数T(总百分浓度)和 C(交联百分浓度)。
T

ab10（0 ％）C m
a＋ bb10（0 ％）
上式中：a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，m为缓 冲液体积（ml）。
当C保持恒定时，凝胶的有效孔径随着T的增加而减小，当T保 持恒定，C为4％时，有效孔径最小，C大于或小于4％时，有效孔 径均变大，C大于5％时凝胶变脆，不宜使用，实验中最常用的C 是2.6％和3 。