细胞骨架的观察教程教案
实验细胞骨架的观察共17页
3%戊二醛用PBS配制
[实验步骤]
1、撕取洋葱鳞茎内表皮(约1平方厘米)置于3~5ml pH6.8 磷酸缓冲液中待其下沉(烧杯1) ；对照无 PBS处理；
2、用3~5ml 1%Triton X-100处理20 min(烧杯2) ； 对照无1%Triton X-100的M缓冲液处理20min;
3、吸去Triton X-100，用M缓冲液3~5ml洗2次，每 次5 min (烧杯3) ；对照无M缓冲液处理;
4、 3~5ml 3%戊二醛固定20 min(烧杯4) ； 5、pH6.8磷酸缓冲液3~5ml洗2次，每次5 min，滤
纸吸去残液(烧杯1) ； 6、 3~5ml 0.2%考马斯亮蓝R250染色15和30分钟，
然后用蒸馏水小心冲洗1～2次(烧杯5) ；做染色时 间的影响； 7、将表皮铺放在载玻片上，加盖玻片，在高倍显 微镜或者油镜下进行观察。
细胞骨架
洋葱表皮细胞骨架
46、我们若已接受最坏的，就再没有什么损失。——卡耐基 47、书到用时方恨少、事非经过不知难。——陆游 48、书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者。——史美尔斯 49、熟读唐诗三百首，不会作诗也会吟。——孙洙 50、谁和我一样用功，谁就会和我一样成功。——莫扎特
实验细胞骨架的观察
服从真理，就能征服一切事物
实验六 细胞骨架的观察
Triton X-100 SDS
[实验器材、材料和试剂]
➢ 光学显微镜；烧杯、吸管、镊子、玻片染 色缸、载玻片、盖玻片；
➢ 新鲜洋葱;
➢ 6mM磷酸盐缓冲液 （pH6.8）、M缓冲液、 1%Triton X-100、 0.2%考马斯亮蓝R250、 3%戊二醛。
细胞实验课件植物细胞骨架的显示与观察
根据细胞骨架成份的蛋白质性质及其抗去垢 剂抽提的特点，用戊二醛在室温下固定细胞后， 经非离子型去垢剂TritonX-100处理除去膜结构 和可溶性蛋白质，留下抗抽提的细胞骨架成份， 用考马斯亮兰R250染色显示。
植物细胞骨架的显示与观察
实验目的 １．加深了解细胞骨架成份的化学性质、形态
分布与功能。 ２．掌握用考马斯亮兰显示细胞骨架系统的原
理与方法。
植物细胞骨架的显示与观察
１．仪器、用具 显微镜、载玻片、盖玻片、剪刀、镊子
２．材料 新鲜的洋葱鳞茎பைடு நூலகம்表皮
３．试剂 （１）3%戊二醛固定液 （２）1%TritonX-100抽提剂 （３）0.2%考马斯亮兰R250染色液
植物细胞骨架的显示与观察
植物细胞骨架的显示与观察
１．洋葱鳞茎内表皮要选取新鲜的。 ２．材料在载玻片上要确保展平，并且
是单层细胞。 ３．要保证材料充分和药品接触。
植物细胞骨架的显示与观察
作业：实验报告，观察到的图像要画图。
植物细胞骨架的显示与观察
观察时，先用低倍镜观察，可以看见细胞的核 区及细胞质中的细胞骨架成份被染成兰色，成束 的细胞骨架成份从核周围呈现放射状地向细胞质 中延伸，找到典型的图像后，转用油镜细心观察 ，注意调节显微镜的工作状态，尽可能达到最佳 分辨效果和清晰度，并仔细地调节细调旋钮，在 立体细胞的不同水平面进行观察。这时候，可以 看到细胞骨架结构的立体情况，并在细胞膜下见 到由很细的纤维构成的网格结构，此外，还可以 明显观察到横穿细胞壁的胞间连丝存在的部位。
1 取材：新鲜内表皮。 2 固定：3%戊二醛固定液，15min。水洗干净，
吸干水分。 3 抽提：1%TritonX-100抽提剂，20min。水洗
2 实验五 细胞骨架的显微观察
Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用：
• Triton X-100是常用的非离子去垢剂－ 温和型
• 适当浓度的Triton X-100可使膜蛋白溶 解下来并保持活性，胞质中可溶性成分 随之流失，而主要存留细胞骨架系统。
• 注意缓冲液？？
戊二醛（glutaualdehyde, GA）作用：
中间纤维(intermediate filament, IF) 实心线状，粗细居中(直径10nm), 角蛋白 等多种蛋白组成，无极性
微管的体外组装和解聚条件
tubulin<临界浓度, Ca2+, 0°C低温 （解聚）
MT
(-tubulin)
tubulin>临界浓度, pH6.9, Mg2+, 37°C, GTP
微丝的体外组装和解聚条件
体外
ATP, Ca2+, 低浓度的Na+.K+(解聚)
MF/F-actin
G-actin
Mg2+, 高浓度的Na+.K+溶液诱导(装配)
取材
注意事项：
• 在指管中用缓冲液漂洗时每隔1分钟用滴管 吹打一次 ，用滴管吸取缓冲液漂洗时不要 洗掉样品
• 染色时间不宜过长 • 染色、水洗均在表面皿上操作 • 显微镜观察时先用低倍镜找，找到后转高
撕取洋葱近中轴鳞片内表皮0.5-1cm2约4-5片 ↓
玻璃指管中3% 戊二醛 固定15min
磷酸缓冲液洗三次,每次2min，期间轻轻震荡
↓ 2% Triton X-100, 室温20min
↓ M-缓冲液洗三次，每次2min，期间轻轻震荡
↓ 置于表面皿中 0.2% 考马斯亮蓝染色 10min
实验五植物细胞骨架观察课程护理课件
结果分析
分析一
通过对比实验结果与理论 预期，验证了实验方法的 可靠性和有效性
分析二
对实验结果进行统计分析 ，得出细胞骨架在不同生 长阶段的功能差异
分析三
结合文献资料，对实验结 果进行深入探讨，提出可 能的机制解释
结果讨论
讨论一
讨论实验结果对理解植物细胞生 长和发育过程的意义
讨论二
探讨实验结果对植物细胞生物学 研究的贡献和影响
04
05
抗体（可选）
03
实验步骤与操作
实验前的准备
实验材料准备
准备好实验所需的植物细胞样本 、显微镜、染色剂、实验器材等
。
实验知识准备
了解植物细胞骨架的基本概念、组 成和功能，以及实验原理和注意事 项。
实验环境准备
确保实验室干净整洁，准备好实验 所需的所有设备和试剂，并确保安 全。
实验操作步骤
实验意义
促进生物学知识整合
本实验涉及植物学、细胞生物学、生物化学等多个学科的 知识，通过本实验，学生可以将所学知识进行整合，形成 更加完整的生物学知识体系。
培养综合能力
本实验不仅培养学生的实验操作能力，还培养学生的观察 力、分析问题和解决问题的能力，有助于提升学生的综合 素质。
服务农业科学研究
植物细胞骨架的研究对于改良作物、提高产量具有重要意 义。本实验的结果可以为农业科学研究提供一定的参考。
理解细胞骨架在植物生长中的作 用
通过观察不同生长阶段的植物细胞骨架， 学生应能理解细胞骨架在植物生长、发育 过程中的重要作用。
培养实验操作技能
培养科学探究精神
本实验涉及一系列复杂的实验操作，通过 实践这些操作，学生可以提升自己的实验 技能和实验素养。
实验三细胞骨架的光学显微镜观察（5篇）
实验三细胞骨架的光学显微镜观察（5篇）第一篇：实验三细胞骨架的光学显微镜观察实验三细胞骨架的光学显微镜观察一、实验目的掌握植物细胞骨架的光镜标本制作方法。
细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和中间纤维。
它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。
光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用1% Triton X-100处理细胞，可使细胞膜溶解，而细胞骨架系统的蛋白质被保存，再用考马斯亮兰R250染色，使得胞质中细胞骨架得以清晰显现。
二、材料、试剂和仪器1．材料新鲜洋葱鳞茎、人口腔上皮细胞2．试剂1）M缓冲液（pH 7.2）各成分终浓度为：50mmol/L咪唑(MW:68.08)，50mmol/L KCl(MW:74.55)，0.5mmol/L MgCl2?6H2O(MW:203.30)，1mmol/L EGTA(MW:380.36)，0.1mmol/L EDTA-Na2(MW:372.24)，1mmol/L DTT(MW:154.3)2）6mmol/L PBS磷酸缓冲液（pH 6.5）:KH2PO4 : Na2HPO4?2H2O = 7:3(见附录3 查磷酸缓冲液的配置)3）0.7% NaCl生理盐水4）1% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)溶于 M-缓冲液5）3% 戊二醛100mL: 25% 戊二醛取12mL ,PBS 88mL6）0.2% 考马斯亮蓝R250染液 200mL:考马斯亮蓝R250 0.2g，甲醇46.5mL，冰乙酸7mL，蒸馏水46.5 mL3．仪器光学显微镜，镊子，剪刀，试管，表面皿，滴管，载玻片，盖玻片,灭菌牙签，1.5mL离心管，1mL吸头，1mL取液器，酒精灯，染色缸细胞骨架动画三、实验程序四、结果与分析洋葱鳞茎外层与内层的表皮细胞比较（放大倍数10×20）五、思考题1．光镜下观察到的细胞骨架有何形态特征？2．对实验成功或失败的原因进行讨论。
实验6 植物细胞骨架观察
实验6 植物细胞骨架观察〔目的要求〕了解动植物的细胞骨架的基本形态〔实验原理〕1%Triton X-100处理细胞，使95%以上的可溶性蛋白及全部脂质被抽提，而细胞骨架中的蛋白质却不被破坏，经固定和考马斯亮兰（非特异性蛋白质染料）染色后，胞质背景着色弱，有利微丝的显示，可在光镜下观察到由微丝组成的纤维束。
〔仪器材料〕1、器材：恒温水浴锅、光学显微镜、小培养皿、小镊子、载玻片、盖玻片、吸管、50ml烧杯、小烧杯、吸水纸、擦镜纸2、材料：洋葱鳞茎3、试剂：6mmol/L磷酸缓冲液（PBS）、1% Triton X-100，3%戊二醛、M缓冲液、0.2%考马斯亮蓝R250染液4、试剂配制：（1）PBS（pH=6.5）A液：NaH2PO4.2H2O 936mg/1000mlB液：Na2HPO4.12H2O 2148mg/1000ml工作液：A液68.5ml+B液31.5ml，NaHCO3调pH=6.5（2）M缓冲液（pH=7.2）咪唑3.4克、KCl 3.71g、MgCl2.6H2O 101.65mg、EGTA(乙二醇双醚四乙酸)380.35mg、EDTA（乙二胺四乙酸）29.22mg、巯基乙醇0.07ml、甘油292ml，加蒸馏水至1000l。
HCl调pH为7.2。
（3）1% Triton X-100：Triton X-100 1ml、M缓冲液99ml。
（4）3%戊二醛：25%戊二醛12ml、6mmol/LPBS 88ml（5）0.2%考马斯亮蓝R250染液：考马斯亮蓝R250 0.2g、甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸馏水46.5ml〔内容方法〕1、取材：洋葱内表皮，浸入装有PBS缓冲液的烧杯中，使其下沉处理3分钟2、抽提：吸去PBS，加2ml 1% Triton X-100入烧杯中，置37℃恒温处理30分钟3、冲洗：转移到载波片上,吸去Triton X-100，用M缓冲液轻轻洗2次，每次10分钟。
细胞骨架的显示和观察
• 配方：
试剂 相对分子质量 所需浓度 每升加量 备注 咪唑 68.08 50mmol/L 3.40g KCL 74.55 50mmol/L 3.73g MgCl2。6H2O 203.30 0.5mmol/L 0.1g EGTA 380.40 1.0mmol/L 0.38g EDTA。2H2O 372.24 0.1mmol/L 0.04g B-巯基乙醇 78.13 1.0 mmol/L 70ul 甘油 92.09 4.0mmol/L 294.8ml 加水定容至1L，PH调至7.2
『实验内容和方法』
1、取材：撕取小块洋葱鳞茎内皮(约1cm2大小若干片) ，浸于6 mmol/L PBS中，使其下沉，处理5-10min。
2、抽提：吸去PBS，加2 ml 1%的TritonX-100，于37℃水浴处理 30min。
3、冲洗： 吸去TritonX-100，用M缓冲液轻轻洗3次，每次5min。 4、固定：3%戊二醛固定20min。 5、冲洗：弃戊二醛，用6mmol/L PBS液洗3次，每次5min。 6、染色：吸去PBS，用0.2%考马斯亮蓝R250染色10min。 7、制片：倒掉染液，用水洗2-3次，在载玻片上铺展开，加盖玻
错的纤维网络结构，按组成和形态结构的不同分为微 管（microtubule，MT）、微丝（microfilament， MF）、中间纤维（intermediatefilament，IF）。它 们对细胞的形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、 分化和物质的运输等起重要作用。观察和研究细胞骨 架可用光镜、电镜、间接免疫荧光技术、细胞化学技 术等方法。对光镜下细胞骨架的形态学观察多用1%的 TritonX-100（聚乙二醇辛基苯醚）处理细胞，使95% 以上的可溶性蛋白质以及全部脂质被抽提，再以蛋白 质染料考马斯亮蓝R250染色，使细胞内细胞骨架得以 清晰显现。
细胞骨架高中生物教案
细胞骨架高中生物教案教学目标：1. 了解细胞骨架的组成和功能。
2. 掌握细胞骨架在细胞内的重要作用。
3. 能够描述细胞骨架在细胞运动和细胞形状维持中的作用。
教学重点：1. 细胞骨架的组成和结构。
2. 细胞骨架在细胞内的功能和作用。
教学难点：1. 理解微管、微丝和中间丝在细胞骨架中的作用。
2. 掌握细胞骨架在细胞运动和形状维持中的作用。
教学准备：1. PowerPoint课件2. 实验用显微镜3. 细胞骨架模型教学过程：一、导入（5分钟）通过展示细胞骨架的结构图，激发学生对细胞骨架的兴趣，并引入本节课的主题。
二、讲解细胞骨架的组成和结构（15分钟）1. 细胞骨架的组成：微管、微丝和中间丝。
2. 细胞骨架的结构：微管由蛋白质管组成，微丝由蛋白质丝组成，中间丝则是一种介于微管和微丝之间的结构。
三、探讨细胞骨架在细胞内的功能（20分钟）1. 细胞骨架在细胞形状维持中的作用：通过支撑细胞膜，维持细胞形状的稳定性。
2. 细胞骨架在细胞运动中的作用：微管参与细胞器的运输，微丝促进细胞的运动。
四、观察细胞骨架实验（20分钟）利用显微镜观察细胞骨架的结构和运动方式，让学生亲自感受细胞骨架在细胞内的作用。
五、总结与评价（10分钟）让学生总结本节课所学内容，强化对细胞骨架的理解。
并进行课堂表现评价，激励学生的学习兴趣。
六、作业布置（5分钟）布置练习题，让学生对所学知识进行巩固。
扩展阅读：1. 了解细胞骨架在细胞分裂过程中的作用。
2. 探究细胞骨架在疾病发生中的作用。
教师招聘高中生物《细胞骨架》教案
教师招聘高中生物《细胞骨架》教案《细胞骨架》教案一、教学目标1.描述细胞骨架的概念、细胞骨架的结构及其特点、功能。
2.通过观察和分析细胞骨架图片，提高概括能力和归纳能力。
3.认同结构和功能相统一的生物学观点。
二、教学重难点重点：细胞骨架的结构及其特点、功能。
难点：细胞骨架的结构及其特点。
三、教学过程(一)温故知新，导入新课1.人之所以有着一定的形态是为什么呢?(有骨骼、肌肉等支撑着身体)2.那么一个细胞又是通过什么来维持着一定的形态的呢?从而引出细胞的骨架，那么究竟什么是细胞骨架，它又有什么功能呢?这节课我们一起来学习细胞骨架。
(二)新课展开1.细胞骨架的概念让学生类比人体骨骼尝试归纳细胞骨架的概念，出示细胞骨架的图片，师生共同概括细胞骨架的概念(广义的细胞骨架包括细胞质骨架、核骨架、膜骨架及细胞外基质。
细胞骨架指真核细胞中与保持细胞形态结构和细胞运动有关的蛋白质纤维网架体系(包括微管、微丝、中间丝)。
)出示考马斯亮蓝R250染色后的细胞骨架图片，提出问题：从图片中能看到什么呢?(细胞骨架被染成深蓝色，呈放射状从细胞核向周围延伸。
)2.细胞骨架的类型及功能①播放电镜下微管的亚显微结构模式图，引导学生仔细观察，并在自主阅读教材的基础上思考如下问题：微管的形态结构是怎样的?外径、内经分别是多少?主要构成成分有哪些?(微管是一种中空的管状蛋白质纤维结构，其外径平均为25nm左右，内经约为15nm，一般仅长几微米。
)②播放纤毛、鞭毛、神经突起、中心粒、纺锤体图片，引导学生思考：这些图片是什么呢?他们都有什么共同点呢?(纤毛、鞭毛、神经突起、中心粒、纺锤体，共同点是微管是纤毛、鞭毛、神经突起、中心粒、纺锤体的主要构成成分。
)③微管的功能是什么?接着设疑：遇到高压或秋水仙素等物理、化学因素作用时有什么变化?(其功能是保持细胞形状(如细胞质微管)、引起细胞运动(如纤毛、鞭毛)和协助细胞内的物质运输(神经突起)、维持细胞内细胞器的定位和分布(中心体等)等。
大学课程《细胞生物学》实验教案--植物细胞骨架的光学显微镜观察
大学课程《细胞生物学》实验教案植物细胞骨架的光学显微镜观察一、实验目的掌握细胞染色的基本过程及非切片法制片技术，了解细胞骨架的结构，学会制作永久封片。
二、实验原理当用适当浓度的TritonX—100处理细胞时，因其非离子型表面活性剂的特性，可以除去可溶性蛋白质和脂类，而微丝束属不可溶性蛋白，就不会被TritonX—100破坏而保留在细胞中。
当用考马斯亮蓝R250染色时，在光学显微镜下通常能观察到以核为中心的纤维状骨架，在质膜下还能见到丝状骨架，骨架上常附着一些与膜运动、整合有关的蛋白质。
考马斯亮蓝R250并不是特异地显示微丝，但由于有些细胞骨架纤维如微管等在该实验条件下不够稳定，又因有些类型的纤维太细而在光学显微镜下无法分辨，因此看到的是由微丝组成的纤维束，直径约在40nm左右。
三、实验材料新鲜洋葱鳞状叶。
四、实验器材普通光学显微镜，50ml烧杯，滴管，试剂瓶，载玻片，盖玻片，镊子，染色板，吸水纸，擦镜纸。
五、实验药品1．M—缓冲液：所含各成分终浓度为50mmol／L眯唑，50mmol／LKCL，0.5mmol／LMgCl2，lmmol／LEGTA(乙二醇双(α—氨基乙基》醚四乙酸)，0.1mmol／L EDTA，lmmol／L巯基乙醇或二硫苏糖醇<DTT)。
lmol／L HCl调pH到6.82 0.01mol/L磷酸缓冲液(pH 6.8)用0.2mol/L磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲液稀释配制其中磷酸盐缓冲液配法：0.2mol/LNa2HPO449ml0.2mol/LNaH2PO45lml3. 1％TrltonX—100，用M—缓冲液配制。
4．0.2％考马斯亮蓝R250。
配制用的溶剂为：甲醇：冰醋酸:水(46.5：7：46.5)。
·5. 3％戊二醛溶液，用9.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)配制6. 50％，70％，95％乙醇。
7. 叔丁醇8. 正丁醇9. 二甲苯。
10.中性树胶。
实验五植物细胞骨架观察课程
2）磷酸缓冲液（PBS）
3）1%Triton-X-100（用M－缓冲液配制 ）
4）0.2%考马斯亮蓝R250 ：
考马斯亮蓝R250 0.2g、甲醇 46.5mL、冰醋酸
7.0mL、蒸馏水 46.5mL
5)植物细胞固定液：
5ml 38%甲醛、 5ml冰醋酸、90ml 70%酒精和5ml 甘油
示的原理
2、掌握考马斯亮蓝R250染色方法
3、观察细胞骨架在细胞中的分布情况
二、原理
细胞骨架指细胞质中纵横交错的纤维网络 结构。可分为微管、微丝和中间纤维，它对细胞 形态维持、细胞生长、运动、分裂、分化X-100处理时，可将质膜中和细胞内蛋白
油镜的番茄表皮细胞的胞间连丝
实验五 植物细胞骨架显示与观察
问题
1、什么叫细胞骨架？ 2、广义的细胞骨架指什么？ 3、狭义的细胞骨架又指什么？ 4、20-25nm_______;6-7nm___________ 8-11nm______
一、目的与要求
1、了解植物细胞骨架制片方法和其成分显
四、实验步骤
1、取材：内表皮约0.5cm2，放在盛有PBS 缓冲液的小烧杯中，浸泡处理10min。 2、抽提：吸去PBS缓冲液，取2ml 1%Triton-100入小烧杯中，置于37℃恒温 水浴锅中保温30min。 3、冲洗：吸去1%Triton X-100，用M缓冲液轻洗三次， 每次5min。
4、固定：加植物固定液2ml固定30min 5、冲洗：弃去固定液后，用PBS缓冲液清洗 三次，每次1-2min 6、染色：吸去PBS，滴1滴0.2考马斯亮蓝 R250染液染色5min 7、制片：倒去染液，用蒸馏水清洗三次，将 标本平铺在载玻片上，再盖上盖玻片。 8、观察
8-细胞骨架的观察
细胞骨架的观察
M－缓冲液配方
• 咪唑（Ph6.7） • KCl • MgCl2·6H2O • EGTA • EDTA·2H2O • β－巯基乙醇 • 甘油 • 水定容
3.4g 3.73g 0.10g 0.38g 0.04g 70μl 294.8ml 1000ml
实 验步骤
1）取PBS液4ml培养皿中,再驳取洋葱鳞茎内表皮约1cm2若干片， 放入盛有磷酸盐缓冲液的培养皿中（每二人用一个容器）。 2）吸去缓冲液，用1%TritonX-100 4ml处理洋葱表皮25-40 min。 3）除去TritonX-100，用M-缓冲液充分洗3次，每次约10 min 4）加3.0%戊二醛固定液4ml（用0.2 mol/L的磷酸缓冲液pH 6.8配制） 固定0.5h 。 5）用PBS洗3次，滤纸吸去残留液体。 6）0.2%考马斯亮蓝R250染色30min。 7）用蒸馏水洗数遍，降低背景。 8）将样品置于载玻片上，加盖玻片，在光学显微镜下观察。 9）结果：微丝束呈深蓝色
Mg2+ 高浓度Na+ K+诱导
F- actin
含ATP Ca2+ 低Na+ K+
细胞骨架的观察
仪器、材料与试剂
仪器：光学显微镜 材料：植物洋葱
每二人一套的用具:平皿或试管，镊子 、吸管；
每人一套的用具:载玻片（为区别细胞的正反面，作个标记 ) 盖玻片、吸水纸等。
试剂 (1) 磷酸缓冲盐溶液（PBS，pH ７.３），
实验四：细胞骨架观察
• 2.3.7％甲醛-PEMD室温固定10min,用PBS洗去固定液 后,略干燥再放入预冷的-20℃丙酮中再固定3-5min,取出 略干燥。
• 3.用甲基罗丹明-鬼笔环肽染色:滴加20 µL染液在清洁的 载玻片上,将盖玻片上的细胞样品反扣其上,放入湿盒内, 置暗处室温下染色20-25min,然后用PBS洗涤3次,无离子 水洗涤,略干燥后用甘油-PBS封片。
实验七：细胞骨架观察
一.考马斯亮蓝R250染色法观察微丝 二.甲基罗丹明标记的鬼笔环肽染色法
观察微丝
一.考马斯亮蓝R250染色法观察微丝
实验目的
• 掌握观察动物细胞内微丝的方法:考马斯亮 蓝R250染色法
实验原理
• 真核细胞胞质中有错综复杂的纤维网,称为细胞骨架。根据 纤维的直径分为微丝,微管和中间纤维。此外,还散布着一 些比微丝还细的纤维。
• 本实验观察的是由微丝平行排列组成的纤维束,在动物细胞 里称作”应力纤维” .
• 应力纤维在体外培养的贴壁细胞中尤其发达。一般当细胞 充分铺展时,经考马斯亮蓝R250染色,可看到沿细胞长轴伸 展的粗大纤维束,此即应力纤维。
仪器、材料和试剂
• （一）仪器
光学显微镜,温箱,细胞培养设备
• （二）材料
用水冲洗,蒸馏水冲洗,空气中略干燥。 • 7.普通光学显微镜下用40×物镜或油镜观察。应
力纤维成深蓝色。
注意事项
1.洗片时要轻柔，以免把细胞从载片上洗去。 2.细胞盖片注意正反面。 3.染色后应冲洗盖片背面，避免损伤细胞。
实验报告
• 1.画出你所观察到的微丝图像。 • 2.对实验成功失败的原因进行讨论。
实验6细胞骨架的观察【精选】
质的固定效果好，且不破坏细胞骨架的结构。
0.2% 考马斯亮蓝R250染液： 考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，可以使细胞
内各种蛋白质染色。本实验中，有些骨架纤维(微管，2025nm)不稳定；有些纤维(中间纤维，8-11nm)太细，在光学 显微镜下无法分辨。 所以，我们观察到的主要是微丝束， 由许多微丝（5-7nm）结合在一起，直径约在40nm左右，考 马斯亮蓝R250染色对微丝束的显示起了夸大的作用。
8. 观察：光镜下观察可见表皮细胞的轮廓，细胞内存在 着被染成蓝色、粗细不等的纤维网络结构，便是细胞 骨架。转高倍镜下观察，转动微调可见细胞骨架的立 体结构。
五、注意事项：
1. 撕取洋葱鳞茎内表皮不可带茎肉，样本要展开铺平。 2. 去垢处理要掌握好时间和温度。 3. 染色时间需掌握好，必要时可分不同时间进行染色。 4. 观察时选择平展、染色适中的部位观察。
溶液配制：
M-缓冲液 咪唑 3.40 g，氯化钾 3.70g，氯化镁(MgCl2.6H2O) 101.65 mg，EGTA （乙二醇双醚四乙酸）330.35mg，EDTA（乙二胺四乙酸）29.22mg， 巯基乙醇 0.07ml，甘油 292 ml，蒸留水加至 1000 ml。
1%Triton X-100溶液 Triton X-100 1ml + M-缓冲液 99 ml 。
四、实验方法与步骤：
1. 取材：撕取洋葱鳞茎近中轴内表皮，浸入装有5ml PBS 溶液的小烧杯中 ，使其下沉，处理3次，每次3min。
2. 抽提：吸去 PBS溶液，加 3ml 1 % Triton X-100 入小烧 杯，置 37 ℃恒温箱处理20min。
3. 冲洗：吸去 TritonX-100 ，用 3ml M缓冲液轻轻洗 3 次， 每次 3min。
细胞骨架的观察实验指导
细胞骨架的观察实验指导实验材料：1.细胞培养物2.细胞培养培养基3.PBS（磷酸盐缓冲盐溶液）4.4%多聚甲醛5. 0.1% Triton X-100 溶液6.1%BSA溶液7.细胞骨架特异抗体（如抗微管抗体和抗中间丝抗体）8.辅助抗体（如荧光标记的二抗）9.荧光染料（如荧光素-鳦绿或苏木精红）10.封片用溶剂（如磁性切片载玻片和硝酸盐封片剂）实验步骤：1.倒置细胞培养物：a.制备细胞培养物并放置在合适的培养箱中。
b.取出培养箱中的细胞培养物，小心地倒置在培养皿或玻璃片上。
确保培养物均匀地覆盖在底部。
2.固定细胞：a.慢慢地向细胞培养物中加入4%多聚甲醛，使浓度达到最终浓度。
b.使用PBS洗涤细胞3次，每次洗涤5分钟。
3.渗透化细胞膜：a. 用0.1% Triton X-100 溶液渗透化细胞膜，在室温下孵育5分钟。
b.使用PBS洗涤细胞3次，每次洗涤5分钟。
4.阻止非特异结合：a.使用1%BSA溶液阻止非特异结合，将其加入细胞上，孵育30分钟。
b.使用PBS洗涤细胞3次，每次洗涤5分钟。
5.免疫反应：a.加入特异性抗体（如抗微管抗体或抗中间丝抗体），孵育1小时。
b.使用PBS洗涤细胞3次，每次洗涤5分钟。
6.加入荧光标记的二抗：a.添加荧光标记的二抗，与特异抗体结合，孵育1小时。
b.使用PBS洗涤细胞3次，每次洗涤5分钟。
7.染色：a.使用适当的荧光染料（如荧光素-鳦绿或苏木精红）进行细胞染色。
按需求用荧光染料染色。
b.使用PBS洗涤细胞3次，每次洗涤5分钟。
8.封片：a.倒置细胞培养物到切片载玻璃片上。
b.轻轻地用硝酸盐封片剂将细胞培养物封盖，并放置在室温下干燥。
9.观察并记录：a.将封片放置在显微镜台上。
b.使用荧光显微镜观察细胞骨架。
c.使用相机或图像捕获软件记录观察到的细胞骨架结构。
实验注意事项：1.细胞处理和操作过程中要保持洁净，避免细菌和污染物的干扰。
2.细胞固定和渗透化过程中要严格控制时间和温度，使得细胞组织得到最佳的处理效果。
实验4 细胞骨架的显示及观察
实验4 细胞骨架的显示及观察姓名：李思露学号：131140040一、实验目的1.掌握用考马斯亮蓝R250染色观察动物和植物细胞骨架的原理和方法。
2.了解免疫荧光法检测细胞成分的原理和方法。
二、实验原理1.细胞骨架：指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。
广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。
狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，包括微管（microtubule，MT）、微丝（microfilament，MF）、中间纤维（intermediated filament，IF）。
2.微管微管是细胞内由微管蛋白形成的直径约20~26nm的长度不一的小管。
分布在核周围，呈放射状向胞质四周扩散，主要确定膜性细胞器的位置和作为膜泡运输的导管。
微管蛋白有α和β两种。
αβ异二聚体沿纵向聚合成丝，原丝成环状排列形成微管的壁。
微管不稳定，对低温（冷冻）、高压等物理因素及秋水仙素（微管断裂剂）等化学因素敏感。
紫杉醇可以和微管蛋白多聚体结合，抑制微管解聚。
3.微丝：真核细胞内是主要由肌动蛋白（actin）组成的直径为5～7nm的骨架纤丝。
主要分布在细胞质膜的内侧，作用是确定细胞表面特征、并与细胞运动、收缩、内吞等功能有关。
脊椎动物肌动蛋白分为α、β和γ三种类型，不同种类细胞中肌动蛋白组成不同。
肌动蛋白单体为球形，依次连接成链，两串肌动蛋白链互相缠绕扭曲成一股微丝。
细胞松弛素B为微丝断裂剂。
4.中间纤维：直径介于微丝和微管之间（7~11nm）、由多种不同蛋白组成的细胞骨架成分。
在细胞中围绕着细胞核分布，成束成网，并扩展到细胞质膜，与质膜骨架相连结。
主要起机械支撑和加固作用。
组成中间纤维的蛋白：角蛋白，波形蛋白，结蛋白、神经纤维，神经胶质纤维和核纤层蛋白。
不同组织来源的细胞，组成其中间纤维的蛋白质种类可能不同。
5. 研究细胞骨架的意义。
（1）了解细胞骨架与细胞各种功能行使之间的关系。
（2）了解理化因素是否通过影响细胞骨架对细胞功能产生影响，以便趋利避害。
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• 2.2 细胞骨架的观察
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2.1 免疫组织化学技术
• 免疫组织化学(Immunochistochemistry) 是利用免疫学抗原抗体反 应的原理，用带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗 体反应和组织化学的呈色反应，对组织细胞内特定抗原进行定性、定 位和定量研究的一项新技术，又称免疫细胞化学 (immunocytochemistry)。
• 目前观察细胞骨架的手段主要有电镜、间接免疫荧光技术、 酶标、组织化学等。
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微丝的观察—考马斯亮蓝法
• 考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使各 种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝，但是由于 有些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管； 还有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此 我们看到的主要是微丝组成的张力纤维，直径约40nm左 右。
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细胞骨架的观察
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1.实验目的
• 熟悉免疫化学方法的原理及操作步骤。 • 掌握掌握考马斯亮蓝R250染色法及观察
细胞内微丝的方法。 • 掌握用间接免疫荧光法显示细胞内微管的
方法。
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2. 实验原理
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微管的观察—免疫组织化学法
• 用抗管蛋白的免疫血清(一级抗体，例如兔抗管蛋白抗体) 与体外培养细胞一起温育，该抗体将与胞质中的微管(抗 原)特异结合，然后再加荧光素标记的抗球蛋白抗体（二 级抗体），例如异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔抗体 共同温育，该二级抗体与一级抗体结合，从而使微管间接 地标上荧光素。置荧光显微镜下用一定波长激发光照射即 由荧光所在显示出微管的形态和分布。
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2.2 细胞骨架的观察
• 细胞骨架(cytoskeleton)是真核细胞细胞质中错综复杂的 蛋白质纤维网络，按纤维直径、组成成分和组装结构的不 同分为微丝(microfilaments，MF，5～7nm)、微管 (microtubule，MF，20～25nm)和中等纤维 (intermediate filaments，IF，8～11nm)。
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4.实验步骤
微丝的观察—考马斯亮蓝法 • ①细胞培养在平皿中的盖玻片上，生长密度达++～+++时，取出盖玻片，
用PBS洗3次。 • ②用1%Triton X—100处理25—30 min，室温或37℃均可。 • ③立即用M—缓冲液轻轻洗细胞3次。 • ④略晾干后，用3%戊二醛固定细胞5-15 min。 • ⑤PBS洗数次，滤纸吸干。 • ⑥用0.2%考马斯亮蓝R250染片30min-1h。然后小心用水冲洗，蒸馏水冲
• ④荧光显微镜下观察结果，用绿光激发。
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4. 实验步骤 微管的观察
• ①细胞培养在盖玻片上，长到++～+++时取出，用37℃预温的 PEMP缓冲液轻轻漂洗细胞。
生物科学与工程系细胞生物学实验教验材料 、用品
• 实验材料：培养的Hela细胞 • 实验用品：
①实验器材：光学显微镜，荧光显微镜，冰箱(—20℃及4℃)，小型 振荡器，温箱，细胞培养设备；平皿，直径30mm小染缸，载玻片， 盖玻片，铝盒等。 ②主要试剂 M—缓冲液，1%Triton X—100（用M—缓冲液配制），0.2%考 马斯亮蓝R250，3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制）， 3.7%甲醛—PEMD，甲基罗丹明—鬼笔环肽染液。 PEM缓冲液，PEMP缓冲液，PEMD缓冲液， 兔抗管蛋白血清（一 抗），FITC-羊抗兔抗体（二抗），甘油-PBS(9:1，pH 8.5-9.0)。
• ②3.7%甲醛—PEMD室温固定10 min，用PBS洗去固定液后，略 干燥再放人预冷的–20℃丙酮中再固定3～5 min，取出略干燥。
• ③在清洁的载玻片上滴加20µl染液，将盖玻片上的细胞样品反扣其 上，放人湿盒内，置暗处室温下染色20～25 min。然后用PBS洗 3次，无离子水洗2次，略干燥后甘油—PBS封片。
洗，空气中略干燥。 • ⑦普通光学显微镜下用40×物镜或油镜观察。
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4. 实验步骤
微丝的观察—甲基罗丹明—鬼笔环肽法
• ①细胞培养在平皿中的盖玻片小条上，当细胞生长密度达+++(约 70%～80%)时取出放进小染缸中，用PBS清清冲洗。
• 免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高、定位准确和简便快速等 优点，又能够同形态、功能及代谢等研究结合起来，用以研究其它技 术（如化学、生化、免疫及生理等）难以深入的领域。
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大连理工大学 免疫荧光法
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免疫荧光法分为直接法和间接法。
• 直接法：将荧光素（最常用异硫氰酸荧光素、FITC）标记 在特异性抗体上，使其直接与细胞上相应抗原结合，在荧 光显微镜下观察即可鉴定未知抗原。
• 间接法：将荧光素标记在第二抗体上，待一抗与细胞抗原 结合后，再用标记了的二抗与一抗相接，从而显示未知抗 原。间接免疫荧光法中具有2对抗原、抗体系统。
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• 实验中用1％Triton X—100可抽提掉胞质中除骨架蛋白 以外的其他蛋白，能清晰地显示微丝束。 生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室
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微丝的观察—荧光法
• 用荧光染料甲基罗丹明标记的鬼笔环 肽处理后，可在荧光显微镜下看到微 丝动态变化的图象。
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