端粒酶

端粒酶抑制剂用于肿瘤治疗的研究新进展
近年来，肿瘤细胞永生化的“端粒—端粒酶学说”已为越来越多的研究结果所证实。

端粒酶是唯一的一种以自身RNA序列为模板将端粒重复序列复制添加到染色体3′末端的核蛋白酶。

许多研究结果表明：人类85%～90%的肿瘤细胞的端粒酶活性呈阳性，端粒酶的激活及端粒长度的稳定与肿瘤、衰老的发生和发展有密切关系，针对端粒酶基因的调控可以通过抑制端粒酶的活性来抑制肿瘤的生长并促进其凋亡，具有对肿瘤细胞特异性的作用，是肿瘤靶向治疗的一个新的研究方向。

本文中对端粒、端粒酶的结构和功能，端粒酶活性的调控，端粒酶与肿瘤和衰老的关系，端粒酶抑制剂的最新研究进展以及在肿瘤等疾病治疗中的应用前景进行综述和分析，为进一步开发天然来源的端粒酶抑制剂、研发肿瘤靶向治疗新药提供参考。

1.端粒与端粒酶
1.1端粒端粒（T elomers）为真核细胞染色体末端的一种特殊结构，由端粒DNA和端粒蛋白质组成，其DNA 含有大量的TTAGGG n串联重复结构，其功能是完成染色体末端的复制，防止染色体融合、重组和降解，起着保护染色体末段的作用。

端粒是线性DNA，它的末端会随周期性的复制而逐渐缩短。

Muller1于1938年首次发现这一结构并将其命名为端粒（T elomers）。

由于末端复制问题，细胞每分裂1次，端粒就缩短50～100，当端粒缩短到临界长度时，细胞就会出现衰老以致死亡，因此在正常真核细胞中，端粒可被看成是“生命的时钟”或“有丝分裂的计数器”2。

1.2端粒酶端粒酶(T elomerase) 是一种由RNA和蛋白质组成的特异核糖核酸蛋白复合体，具有逆转录的酶活性，能以自身的RNA为模板5’-CUAACCCUAAC-3’通过逆转录合成端粒重复序列并连接到染色体末端以补偿细胞分裂时端粒的缩短，使细胞获得无限增殖能力3。

端粒酶的主要功能是：①通过自身的RNA 模板、催化亚单位和辅助蛋白将端粒DNA 添加到染色体的末端；②维持和平衡端粒序列长度；③修复断裂的染色体末端4。

端粒酶有三个主要组成部分：人端粒酶RNA（human telomerase RNA，hTR）、端粒酶相关蛋白（telomerase-associated protein，TP1/TLP1）、人端粒酶催化蛋白亚单位（the catalytic protein subunit of telomerase，hTERT），其中hTERT和hTR组成端粒酶最小核心结构。

端粒酶的逆转录酶活性使其能以hTR为模板，向染色体末端添加TT AGGG序列。

端粒酶的活性调控在多个水平进行，包括hTERT和hTR基因转录、剪接和成熟，活性端粒酶组装和端粒酶结合到端粒发挥延伸作用。

而hTERT启动子是端粒酶活性调节的一个决定因素，在大多数的恶性肿瘤中检测到hTERT启动子的活化并与端粒酶活性有高度的相关性5，6。

2.端粒、端粒酶与癌症
近年来随着肿瘤分子生物学的不断发展，越来越多的研究发现：衰老者端粒缩短；癌基因、抑癌基因等可激活端粒酶, 使其以自身为模板合成稳定染色体末端的端粒, 则细胞免于衰老死亡而获得永生化, 发展成肿瘤细胞7；端粒酶在大多数的正常人的体细胞中没有活性；大约在85%-95%的肿瘤细胞中检测到了端粒酶活性（端粒酶阳性），在常见恶性肿瘤细胞中端粒酶活化的阳性检出率分别为: 中腔鳞状细胞癌 80%～90%、食道癌 87%、胃癌 85%、肺癌 80.1%、肝癌 85%、乳腺癌 85%、肾癌 71%、胰腺癌 95%等8。

由此可见端粒酶基因的异常激活是绝大多数恶性肿瘤发生的共同途径。

端粒酶在恶性肿瘤增殖中的重要性及其高表达率，使之成为恶性肿瘤化疗和基因治疗的重要靶点9,10。

当端粒酶催化亚基基因在转入细胞内既能延长细胞寿命又不影响细胞的正常功能时,延长寿命的细胞就能有效的抑制衰老,如皮肤的老化、肌肉的退缩和动脉硬化等11。

由此可见,端粒酶与老年人的多发肿瘤疾病也有着密切关系。

故通过抑制肿瘤细胞增殖和诱导其衰老凋亡而发挥治疗作用的端粒酶活性抑制剂成为肿瘤基因治疗的重点。

2.1端粒酶活性升高可能引起癌症
对癌细胞的研究发现：永生化是癌细胞所具有的显著行为，端粒酶被激活的细胞也具有永生化行为，癌细胞具有端粒酶被激活的细胞所具备的特性，抑制端粒酶活性可以使永生化细胞转变为正常细胞。

癌细胞通过分泌大量端粒酶来防止染色体端粒缩短，以便不断分裂繁殖。

2.2端粒酶缺乏同样会引起癌症
美国哈佛医学院的科学家对实验鼠进行了基因改造，使其体内缺乏端粒酶以及一些抗癌蛋白质（p53），结果发现，实验鼠患上了鼠类通常不会患的人类癌症——器官上皮细胞癌。

研究表明：端粒酶缺乏同样会引起癌症。

1995年Hiyama等人研究了100例成纤维神经细胞瘤，发现有端粒酶活性表达的肿瘤组织占94%；端粒酶活性越高的组织越容易伴有其它遗传学变化，并且预后不良；低端粒酶活性的肿瘤组织中未见有相应的变化，且都预后良好；甚至有3例处于IVS阶段的无端粒酶活性的病例竟出现了肿瘤消退的现象。

这似乎说明：端粒酶同癌症之间存在着相关性，但是否是因果关系，还很难定论。

3.端粒酶抑制剂作用机制及治疗肿瘤的研究
Colorado大学的Thomas Cech 和Robert Weinbrg博士已克隆出一种控制人类细胞端粒酶活性的基因，应用这种基因，很有可能得到一种新的蛋白质——端粒酶控制剂。

目前，端粒酶控制剂直接用于人体试验还尚不成熟，但为人类征服癌症以及其它的同衰老有关疾病的治疗指了方向。

端粒酶活性与恶性肿瘤之间的高度相关性使端粒酶成为近年来肿瘤治疗研究的新热点, 对于端粒酶抑制剂的研究和开发为肿瘤治疗提供了新的思路12。

目前，抑制端粒酶活性为靶点的肿瘤治疗研究主要策略有：①阻断端粒酶RNA的模板作用。

②抑制端粒酶催化蛋白亚基。

③核苷类似物竞争性抑制反转录过程。

④细胞分化诱导剂抑制端粒酶活性。

⑤对细胞内调节机制进行调控。

⑥其它抑制剂对端粒酶活性的调节。

3.1以端粒酶RNA为靶点
3.1.1抑制端粒酶活性——阻断端粒酶RNA的模板作用
端粒酶是以其自身RNA为模板来合成端粒DNA序列，因此可以通过消除其模板作用抑制端粒酶活性，达到限制端粒合成的目的。

消除端粒自身模板作用的方法有；反义核苷酸封闭hTR、反义肽核酸封闭hTR、锤头状核酶切割hTR序列。

反义核苷酸封闭hTR 端粒酶RNA序列中含有与端粒DNA互补的模板序列，因此可设计能与之结合的反义核苷酸来灭活端粒酶，从而阻止端粒序列的合成。

Feng13等首先用含反义hTR 的质粒转染HeLa细胞，经过23～26倍增时间后，HeLa 细胞进入生长危机，并伴随有端粒长度的缩短和端粒酶活性的抑制。

为了提高抗反义核酸降解和进入组织细胞的能力，Piytts 等设计了一种甲基化的反义RNA（2’-O-methyl-RNA），用阳性脂质将其导入人前列腺肿瘤细胞系DU145，使细胞的端粒酶活性减少了97%。

有学者发现，用硫代反义核苷酸活性，还能抑制淋巴瘤细胞系OMABL1的生长，诱导细胞凋亡。

反义肽核酸封闭hTR
肽核酸（peptide nucleic acids,PNA）是一类人工合成的DNA或RNA类似分子；PNA与核酸分子的不同之处在于：将DNA中的磷酸脱氧核糖骨架被酰胺键连接的多肽骨架所代替，碱基通过亚甲羧基链与骨架中甘氨酸的氨基连接；PNA具有与天然DNA相类似的结构特征和相同的DNA/RNA结合特性。

PNA与DNA结构比较
1.骨架由N-（2-氨基乙基）甘氨酸构成
2.碱基通过亚甲羧基链与骨架中甘氨酸氨基连接
PNA对DNA或RNA的亲和力较相应DNA与DNA和DNA与RNA之间的亲和力高
在100mmol/L NaCl 溶液中，每碱基的Tm值约升高5℃；
导致PNA-DNA双链和PNA-RNA双链的Tm值升高的原因是由于PNA-DNA和PNA-RNA 中两条单链之间缺乏静电排斥力；
PNA-DNA 和PNA-RNA双链的方向可以是同向平衡，也可以是反向平衡，反向平衡时Tm值更高。

不同盐浓度对杂交分子Tm值的影响
NaCl浓度PNA/DNA DNA/DNA
0 mmol/L72℃38℃
140 mmol/L69℃56℃
1000 mmol/L65℃65℃
反义肽核酸封闭hTR
PNA不带电荷，中性骨架间无排斥力，使之具有比DNA寡核苷酸更强的结合力和抗蛋白酶和核酸酶降解能力；
Norton等设计了针对hTR模板区的不同长度的PNA，发现其对端粒酶活性的抑制在一定长度范围内随链的延长而增强；
PNA的高度亲和性、高度特异性和抗降解能力，使之成为极具潜力的抗肿瘤新药。

锤头状核酶切割hTR序列
核酶是一类具有酶活性的小分子RNA，通过序列特异性地与靶RNA分子配对，对底物进行切割，从而使其失去生物学功能；
Wan等，合成了一种甲基化修饰的锤头状核酶（2’-O-methyl-modified hammerhead ribozymes），具特异性切割hTR模板区序列的功能。

核酶：四膜虫rRNA自我剪切
将该酶与人神经胶质瘤U87-MG细胞系的细胞抽提物共同孵育，端粒酶活性受到明显抑制，这种抑制作用具有剂量依赖效应；
Y okoyama等设计了针对人端粒酶RNA模板区的锤头状核酶，能有效切割非细胞体系中的RNA 底物，将其导入子宫内膜癌细胞后，可明显抑制端粒酶活性。

抑制端粒酶活性——抑制端粒酶催化蛋白亚单位
Horikawa等发现：将正常人3号染色体导入人肾癌细胞系RCC23，可引起其端粒酶活性的抑制、端粒的进行性缩短和细胞的老化，并且证实端粒酶活性的抑制是由于编码hTERT的基因的下调引起的，提示：3号染色体上存在直接或间接控制hTERT基因表达的基因；
最近大量研究表明：端粒酶三个主要组成成分中hTERT与肿瘤的关系最密切，已成功将其克隆；
hTERT有望成为肿瘤基因治疗的新的理想靶点。

抑制端粒酶活性——核苷类似物竞争性抑制反转录
端粒酶具有反转录酶活性，在催化合成端粒DNA的过程中，需要有4种dNTP的参与；
利用核苷类似物✦竞争性抑制反转录过程✦抑制端粒酶活性✦阻止端粒延长。

Strahl等发现：双脱氧鸟嘌呤核苷（dideoxyguanosine，ddG）可使永生化的人淋巴细胞株JY616 和Jurkat E6-1的端粒发生进行性缩短和端粒酶活性的明显抑制，而且ddGTP也有类似的抑制作用。

Melana等在培养基中加入叠氮脱氧胸苷（3’-azido-3‘-deoxythymidine，AZT），发现：乳腺癌细胞系（四种）、T4白血病细胞出现生长抑制和端粒酶活性的抑制，但不同细胞系所需剂量不同。

抑制端粒酶活性——细胞分化诱导剂
分化不良的恶性肿瘤细胞端粒酶活性一般很高，但终末分化的正常人体细胞却无端粒酶活性表达，这提示：细胞分化与端粒酶活性之间存在某种关系；
Bestilny等研究发现，维甲酸（RA）、二甲亚砜（DMSO）和TPA （12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate）在诱导HL60白血病细胞等永生化细胞终末分化时，可明显抑制细胞端粒酶活性，并使凋亡细胞增多，但这些诱导剂本身并不能直接抑制端粒酶活性。

提示：端粒酶活性的下调是细胞分化所造成的。

Sharma等将DMSO作用于Brukitt淋巴瘤Raji 细胞系，发现其产生可逆性G0/G1停滞，并有端粒酶活性的抑制；
杨骅等分别用维甲酸和苦参碱间接抑制了大肠癌细胞和红白血病细胞株K562的端粒酶活性，这种抑制作用的机制目前尚不清楚。

抑制端粒酶活性——对细胞内调节机制进行调控
目前的研究表明：端粒酶活性受多种细胞内机制的调节，故对这些调节机制进行调控也能有效地抑制端粒酶活性；
Fujimoto等将与c-myc mRNA互补的反义寡核苷酸作用于三种人白血病细胞系HL60、U937和K562细胞，发现三种细胞的端粒酶活性都有明显下调。

Mandal等发现在IL-2依赖的细胞毒T细胞系CTLL-2细胞中，下调凋亡相关基因Bcl-2的表达可引起端粒酶活性的抑制，而Bcl-2的过度表达则可引起肿瘤细胞端粒酶活性的明显升高。

抑制端粒酶活性——其它抑制剂对端粒酶活性的调节
端粒酶活性也受其它一些抑制剂的调节，如蛋白激酶抑制剂和DNA交联剂。

Stao等发现高浓度生物碱9-HE（9-hydroxyellipticine，一种蛋白激酶抑制剂），可快速、完全地抑制端粒酶活性；
提示：端粒酶蛋白亚基的磷酸化及去磷酸化可能参与端粒酶活性的调节。

最近，Li等证实人端粒酶蛋白组分hTP1 和hTERT都是磷酸蛋白，其磷酸化是人乳腺癌细胞端粒酶活化的必要条件；
Kang等证实hTERT是激酶Akt的底物蛋白，hTERT 肽链的磷酸化可引起端粒酶活性的上调。

以上研究表明：蛋白激酶抑制剂可有效阻断端粒酶蛋白的磷酸化，从而抑制端粒酶活性；Burger等发现DNA 交联剂cisplatin（顺铂）可抑制人睾丸癌细胞端粒酶活性，并且这种抑制作用具有浓度依赖性；
Ishibashi研究也得到类似结果，并发现较高剂量的顺铂对端粒酶活性的抑制可能是由于TTAGG重复序列的交联，也可能是顺铂作用于酶蛋白成分所必须的巯基基团。

总结
以端粒酶为靶点的肿瘤治疗研究已取得了一系列可喜的成果；反义核苷酸、肽核酸、核酶、细胞分化诱导剂等作为端粒酶抑制剂正显示出良好的应用前景，而且这方面的研究还在不断深入；端粒酶抑制剂要作为一种肿瘤治疗药物应用于临床，还有许多问题需要解决。

展望
虽然，以端粒酶为靶点的肿瘤治疗的研究刚刚起步，但已显示出了很强的潜在应用价值。

相信随着研究的不断深入，对端酶活性的抑制必将成为一种有效的肿瘤治疗手段，为人类最终战胜肿瘤发挥作用。

肿瘤发生的端粒-端粒酶学说
随着有丝分裂次数的增加，端粒逐渐缩短，当其缩短到一定程度，细胞停止分裂进入永生化Ⅰ期，即M1期。

此期大部分细胞在p53基因调控下将衰老死亡，仅有少部分细胞通过病毒癌基因的整合或p53、Rb等抑癌基因的突变使细胞逃脱死亡，再继续分裂50左右，端粒长度缩短到危机点，细胞进入永生化Ⅱ期，即M2期。

绝大部分细胞因为端粒极度缩短不能维持其功能而死亡，仅有少部分细胞通过某种机制激活端粒酶，使端粒长度得以维持，因而成为永生化细胞。

端粒酶活性与胃癌
Hiyama K,Hiarai YK,Kyoizumi SS,etal. Activation of telomerase in human lymphocytes and hematopoietic progenitor cell. J Immunol 1995,155:3711.
检测66例胃癌及残端标本的端粒酶活性，
结果：
早期胃癌的阳性率82.3% (14/17)
中晚期阳性率为85.7% (42/49)
残端阳性率为6.1% (4/66)
结论：在胃癌中端粒酶活性升高。

贾汝梅，张玉印，宋伟庆，等。

胃癌与端粒酶活性表达及DNA倍体关系的研究。

中国胃肠外科杂志2000年第3卷第2期
结果：
胃癌端粒酶阳性率为83.3% (25/30)
非瘤残端阳性率为3.3% (1/30)
结论：端粒酶活性升高在胃癌中是一种普遍现象。

认为端粒酶可以作为胃肠道肿瘤诊断的有力标志物。

残端组织端粒酶阳性的原因：
(1) 残端组织重度炎症，大量淋巴细胞浸润，而淋巴细胞有微弱的端粒酶活性，所以炎症反应极重的组织端粒酶可能会呈弱阳性；
(2) 残端组织含微转移灶所致，病理仅能通过光镜检测1个平面有无癌转移，端粒酶检测则是测定立体团块细胞的酶活性，比光镜更全面，更易发现肿瘤微转移灶；
(3) 癌前病变也可导致端粒酶阳性表达。

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