肉桂地链霉菌接合转移体系的构建及nsdA基因中断对其次级代谢的影响

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(6):1042~1047

*通讯作者。 Author for correspondence.研究员， 主要从事微生物发酵工程研究。E­mail:.

收稿日期：

2007­04­03 接受日期： 2007­05­07 ·研究论文

· 肉桂地链霉菌接合转移体系的构建

及 基因中断对其次级代谢的影响

陈 芬 1 ，熊 伟 2 ，闵 勇 1 ，范与庆 1 ，梁运祥 1

， 吕和平 3 ，邢仁昌 3 ，郑应华 1,3 *

（1. 华中农业大学农业微生物国家重点实验室，武汉 430070； 2.清华大学生物科学与技术系，北京100084；

3. 北京生物医药研究所，北京 100091）

摘要： 以 pSET152 和 pHL212 为出发质粒， 通过供体大肠杆菌 （ ） ET12567 （pUZ8002） 和 S17­1 属间接合转

移肉桂地链霉菌

（ ）， 构建并优化了肉桂地链霉菌的接合转移系统。利用 PCR 介导的基因置换技术

快速构建了肉桂地链霉菌

(negative regulator of

differentiation)基因 中断载体， 通过接合转移导入肉桂地链霉

菌工业菌株 BIB2005， 筛选得到 1 株遗传稳定表型为 的接合子 BIB309。PCR 分析结果显示，

该接合子即为 中

断突变株。与出发工业菌株相比， 在摇瓶水平上

中断突变株BIB309莫能菌素产能提高了 2.7倍。

关键词： 肉桂地链霉菌； 接合转移； 基因； 基因中断

中图分类号：

S188 文献标识码：

A 文章编号：

1006­1304(2007)06­1042­06 Construction of the Conjugal Transfer System of and Effect of PCR­mediated Gene Disruption on Its Secondary Metabolism

CHEN Fen 1 , XIONG Wei 2 , MIN Yong 1 , FAN Yu­qing 1 , LIANG Yun­xiang 1 , LV He­ping 3

,

XING Ren­chang 3 , ZHENG Ying­hua 1,3

*

Intergeneric transfer of plasmid vectors pSET152and pHL212from donor

ET12567(pUZ8002)and

S17­1to were demonstrated and optimized.The

gene disruption structure was constructed by

PCR­targeting system and then introduced into

BIB2005through intergeneric conjugal transfer.After PCR analysis,

the screened conjugant BIB309was confirmed to be the

pared with the start strain,the yield of monensin of the

mutant BIB309increased 270percent in the level of

flask.

;conjugal transfer;

gene;PCR­mediated gene disruption

肉桂地链霉菌 （ ） 是 一种具有复杂形态分化的革兰氏阳性土壤细菌， 在 不同培养基与培养条件下表现不同产孢和生长特 性。 其次级代谢产物是莫能菌素 （monensin ）， 是一类 五环单羧酸多醚结构的脂溶性抗生素，其体外抗球 虫活性极强，在农业和畜牧业生产中具有广泛的应

用(Day ,1973)。目前莫能菌素生物合成基因簇

的克隆及序列分析工作已基本完成 (Leadlay

., 2001)， 序列分析结果显示莫能菌素生物合成基因簇

与大环内酯类抗生素生物合成基因簇十分相似，

大 小约为 97kb ， 其基因簇以 mon 命名，

G+C %含量高 达 72%(Andrew

,2006)。整个生物合成基因簇 含有 34 个完整的 ORFs ， 其中的 20 个 ORFs 与莫能

菌素的生物合成密切相关(Markiyan

,2003)。 近年来，接合转移作为一种基因转移工具已在 多种链霉菌中成功应用(Trieu­Cuot

,1987)。介 导大肠杆菌与链霉菌接合转移的载体一般都含有一

段 760bp 来源于 IncP 群质粒 RK2 上的 序列，

第6期 陈 芬等:肉桂地链霉菌接合转移体系的构建及 基因中断对其次级代谢的影响

同时还需要供体大肠杆菌提供反式作用的转移功 能。接合转移可以避开胞外核酸酶,使 DNA免遭核 酸酶的降解,在某种程度上可以克服宿主对外源 DNA的限制性修饰提高了转化效率， 而且操作程序 简单， 因此应用较为广泛。目前， 有关肉桂地链霉菌 的体内遗传操作主要是通过原生质体转化来完成， 接合转移技术的应用尚未见报道。

基因是一个首先在天蓝色链霉菌中发现 的全局性负调控基因，对天蓝色链霉菌的产孢形态 分化与抗生素的合成均有负调控作用(Takano ., 2006)。SC7A1是天蓝色链霉菌 A3(2)的一个文库质 粒， 陶美凤发现(Li ,2006)在天蓝色链霉菌 A3 (2)的质粒消除衍生菌株 M145或 J1501中引入 SC7A1后， 宿主的产素和产孢发生延迟， 菌落表面 的褶皱程度加深， 据此推测 SC7A1中可能含有与分 化有关的负调控基因， 导致了这些表型的产生。 根据 SC7A1的序列推断，它所含有的 46kb的染色体片 段内包含 40个 ORFs， 通过一系列的亚克隆把这个 基因定位于 ORF26， 把它命名为 （negative reg­ ulator of Streptomyces differentiation）。 余贞等 （2006） 的研究发现 是普遍存在于大多数链霉菌中的 全局性负调控基因，对链霉菌抗生素的合成和产孢 形态分化具有负调节作用。天蓝色链霉菌 A3(2)中 基因的中断提高了钙依赖抗生素与次甲基霉 素的产量； 变铅青链霉菌 ZX64中 基因的中断 会激活沉默的放线紫红素生物合成基因簇的表达 (Li .,2006)。 生物信息学分析结果显示， 已经发现 的 基因序列存在高度的相似性， 并且 两 侧也存在高度保守的区域， 通过设计保守引物 PCR 和测序可以分析其它链霉菌中 基因的存在。 肉桂地链霉菌中尚未有 基因的相关报道， 因 此确证其基因组中 基因的存在，利用 PCR介 导的基因置换技术对其进行中断，可能是莫能菌素 分子育种的一条新途径。

本研究探索了肉桂地链霉菌 ­大肠杆菌属间接 合转移系统， 并成功地进行了优化， 同时还试图通过 保守引物 PCR的方法确证肉桂地链霉菌中 基 因的存在， 然后利用 PCR介导的基因置换技术构建 肉桂地链霉菌 nsdA中断载体，运用接合转移导入 肉桂地链霉菌， 中断其基因组中的 基因， 为莫 能菌素的生物合成的调控研究提供基础资料，同时 也为进一步研究 基因的功能做了有益探索。

1材料和方法

1.1 菌株

莫能菌素产生菌肉桂地链霉菌(

)BIB2005、 大肠杆菌( ) JM109、 S17­1、 ET12567(pUZ8002)(Tobias ., 2000)均由本实验室保存。 S17­1为接合转移 甲基化供体，整合有接合转移需要的 基因。 ET12567(pUZ8002)为接合转移去甲基化供体， 整合 有 基因。 BW25113(

)为大肠杆菌高 效重组菌株。 由于阿拉伯糖合成基因缺陷， 处于阿拉 伯糖启动子控制之下的基因，能在阿拉伯糖的诱导 下表达。该菌株由英国 John Innes研究所的 Gust博 士构建，并由英国植物生物科学有限公司 （Plant Bioscience Limited,Norwich,England） 惠赠。

1.2 质粒

SuperCos1(Tobias .,2000)来自 Stratagene， 含有的 抗性基因用于双交换筛选，整合型穿梭 载体 pSET152和自主复制型穿梭载体 pHL212由 华中农业大学陶美凤副教授馈赠； pIJ790具有温度 敏感型复制子， 姿 Red重组系统位于其阿拉伯糖操纵 子下游， pIJ773含安普霉素抗性基因 （ ） 和接 合转移位点 （oriT） 由英国植物生物科学有限公司惠 赠。

1.3 限制性内切酶和试剂

酶类均购于 TaKaRa公司 （北京）； DNA分子量 标准物购于 MBI公司（北京）； DNA回收试剂盒购 于北京赛百胜公司， 其它常规试剂参见文献 （Tobias .,2000;Sambrook .,1989)。莫能菌素标准品 由本室保藏。

1.4 培养基和抗生素

大肠杆菌培养基为 LA、 LB和 SOB(Sambrook .,1989);肉桂地链霉菌与大肠杆菌的接合转移 选用了 TSB琼脂、 R2YE、高氏一号和 MS培养基 (Tobias .,2000)、 R6(Illing ,1989)、 肉桂地链 霉菌的种子培养基和发酵培养基(Stark .,1967)； 肉桂地链霉菌固体产孢培养基为高氏一号，液体培 养基为YEME(Tobias ,2000)。 LB中氨苄青霉素 使用量为 100滋 g/mL， 安普霉素为 50滋 g/mL， 氯霉 素为 25滋 g/mL；卡那霉素在链霉菌中的使用浓度 是 25滋 g/mL， 在大肠杆菌中是 50滋 g/mL； 接合转 移培养基中安普霉素使用量为每平板 1000滋 g。 1.5 大肠杆菌与肉桂地链霉菌属间接合转移体系 的构建

1.5.1

孢子和菌丝体对接合转移 效率的影响 分别以孢子和菌丝体作受体，具体接 合转移参见文献 （Tobias .,2000)。

1043