农药登记毒理学细菌回复突变

农药登记毒理学细菌回复突变

1 范围

GB/T 15670的本部分规定了细菌回复突变试验的基本原则、方法和要求。

本部分适用于为农药登记而进行的细菌回复突变试验。

2 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.1

回复突变试验reverse mutation test

利用一组鼠伤寒沙门氏菌和/或大肠杆菌检测引起细菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的需要某种氨基酸的菌株（分别为组氨酸或色氨酸）成为不需要外源性供应氨基酸的菌株的突变，即是由营养缺陷型回变到野生型。

2.2

碱基置换型致突变物base pair substitution mutagens

引起DNA分子中一个或多个碱基对置换的物质。在回复突变试验，此改变可能发生在细菌基因组的原突变部位或另一个部位。

2.3

移码型致突变物frameshift mutagens

引起DNA分子增加或丢失一个或多个碱基对的物质。

3 试验目的

检测受试物的诱变性，预测其遗传危害和潜在致癌作用的可能性。

4 试验概述

细菌回复突变试验利用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌来检测点突变，涉及DNA的一个或几个碱基对的置换、插入或缺失。原理是通过观察试验菌株在缺乏所需要氨基酸的培养基上的生长情况，检测试验菌株是否恢复合成必需氨基酸的能力，评价受试物诱发突变的能力。

5 培养基和试剂

注：培养基成分或试剂至少应是化学纯，无诱变性。避免重复高温处理，选择适当保存温度和期限，如肉汤保存于4℃不超过6个月，其他详见下述各培养基及溶液说明。

5.1 营养肉汤培养基

牛肉浸膏 5 g

氯化钠 5 g

胰胨10 g

磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O） 2.6 g

加蒸馏水至1000 mL

加热溶解，调节pH至7.4，分装后0.103 Mpa，20 min灭菌，保存期不超过6个月。

5.2 营养肉汤琼脂培养基

琼脂粉 1.5 g

加营养肉汤培养基至100 mL

加热溶解，调节pH至7.4，0.103 Mpa，20 min灭菌。

5.3 底层培养基（即最低营养培养基）

5.3.1 Vogel-Bonner（V-B）培养基

柠檬酸（C6H8O7·H2O） 2.0 g

磷酸氢二钾（K2HPO4）10.0 g

磷酸氢铵钠（NaNH4HPO4·4H2O） 3.5 g

硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.2 g

加蒸馏水至200 mL

逐个将化学物在少量蒸馏水中单独溶解后，硫酸镁水溶液在最后缓慢加入，加蒸馏水至200 mL。

0.103 MPa，20 min灭菌，4℃保存备用。

5.3.2 20%葡萄糖溶液

葡萄糖20.0 g

加蒸馏水至100 mL，0.055 MPa，20 min灭菌。

5.3.3 1.5%底层琼脂培养基

琼脂粉15 g

加蒸馏水至700 mL

V-B培养基200 mL

20%葡萄糖溶液100 mL

配制：首先将前两种成分于0.103 MPa下高压灭菌20 min后，再加入后两种成分，充分混匀倒底层平板。按每皿25 mL（相对于90 mm平皿）制备平板，冷凝固化后倒置于37℃培养箱中24 h，备用。

5.4 顶层培养基

5.4.1 顶层琼脂

琼脂粉 3.0 g

氯化钠 2.5 g

加蒸馏水至500 mL

0.103 MPa，20 min高压灭菌。

5.4.2 0.5 mmol/L组氨酸-生物素溶液

D-生物素（分子量244）12.2 mg

L-组氨酸（分子量155）7.8 mg

[或L-盐酸组氨酸（分子量192）9.6 mg]

加蒸馏水至100 mL，贮于4℃冰箱中。

5.4.3 顶层培养基制备

加热融化顶层琼脂，临用时每100 mL顶层琼脂中加10 mL 0.5 mmol/L组氨酸-生物素溶液（大肠杆菌则需配制0.5 mmol/L色氨酸-组氨酸-生物素溶液），分装在三角烧瓶中，0.103 MPa，20 min灭菌。用时融化分装小试管，每管2 mL，在45℃水浴中保温。

5.5 S9辅助因子（混合液试剂）的配制

5.5.1 盐溶液[1.65 mol/L氯化钾（KCl）+0.4 mol/L氯化镁（MgCl2）]

氯化钾（KCl） 6.15 g

氯化镁（MgCl2·6H2O） 4.07 g

蒸馏水50 mL

0.103 MPa，20 min高压灭菌或滤菌。

5.5.2 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）

磷酸氢二钠（Na2HPO4）（14.2 g/500 mL）440 mL

磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）（13.8 g/500 mL）60 mL

0.103 MPa，20 min高压灭菌或滤菌。

5.5.3 辅酶-II（氧化型）溶液

准确称取辅酶-II，用无菌蒸馏水溶解配制成0.025 mol/L溶液，低温保存（-20℃以下）。

5.5.4 葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液

称取葡萄糖-6-磷酸钠盐，用无菌蒸馏水溶解配制成0.05 mol/L，低温保存（-20℃以下）。

5.6 10% S9混合液配制

每10 mL由以下成分组成，临用时配制。

磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH7.4） 6.0 mL

MgCl2-KCl盐溶液0.2 mL

葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液（0.05 mol/L）1.0 mL

辅酶-II溶液（0.025 mol/L） 1.6 mL

肝S9 1.0 mL

无菌蒸馏水0.2 mL

混匀，置冰浴中待用。

5.7 活化系统（大鼠肝S9）的诱导和制备

选健康雄性成年SD大鼠或Wistar大鼠，体重200 g左右。将多氯联苯（Aroclor1254或国产PCB-五氯）溶于玉米油中，按500 mg/kg体重一次腹腔注射，5 d后处死动物，处死前12 h禁食，但可自由饮水。