结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册

1、深吸气2-3次，每次用力呼出。
2、从肺部深处咳出。
3、将打开盖的痰盒靠近嘴边收集痰液。
4、拧紧盒盖。
注：如果患者刚吃过东西，应先用清水漱口。装有义齿的患者在留取痰标本之前应先将义齿取出。
四、采集痰标本地点
当患者咳嗽、咳痰时，易产生含有结核菌的气溶胶，感染周边人群的机率较高，故采集痰标本时应在远离人群的开放空间，或通风良好的留痰室内进行。
在当前国家结核病防治规划的框架下，通过痰涂片显微镜方法检查抗酸杆菌（acid-fast bacilli，AFB）的目的是：
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结核病的控制是以发现和控制传染源为主，而痰涂片AFB阳性的肺结核患者是社会上最主要的传染源，故痰涂片AFB检结果对诊断传染性肺结核是一项重要指标。
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结核病是由结核分枝杆菌引起的，现行化疗方案的制定也主要以结核分枝杆菌的生物学特性为依据，所以对化疗效果的评价，也将细菌学检查结果作为根据。
血痰：此类标本是因黏液痰或干酪痰标本中混有血液而形成，颜色为褐色或深褐色、鲜红色或伴有血丝；涂片染色后镜检除能够观察到粘液痰或干酪痰的细胞特征外，含新鲜血液的标本中可见到被染色的血细胞。由于含血标
本易干扰AFB镜检的结果，故在制片时应尽量避免挑取含血标本。
黏液痰：标本外观以白色、粘稠度较高的肺部和支气管分泌物为主，制片时需仔细涂抹；涂片染色后镜检时，镜下可见支气管内膜纤毛柱状上皮细胞（细胞较长且形态不规则、细胞核和细胞质着色均较深，细胞一端可见着色较浅
抗酸杆菌阳性抗酸杆菌菌数：1～8条/300视野。
抗酸杆菌阳性（1＋）：3～9条/100视野，连续观察300个视野；
抗酸杆菌阳性（2＋）：1～9条/10视野，连续观察100个视野；
抗酸杆菌阳性（3＋）：1～9条/1视野；
抗酸杆菌阳性（4＋）：≥10条/1视野。
五、痰标本评价
患者留取的痰标本，应由检验人员或经培训的专人目视检查标本质量（特别是用于初次诊断的痰标本）：标本量一般在3～5 ml，标本性状属于干酪痰、褐色血痰或含少量新鲜血液的血痰、粘液痰者为合格的标本；痰标本不合格者，应予以进一步指导并要求其重新送检。进行细菌学检查时应在结核病细菌学实验室登记本（附件1）和痰涂片镜检化验报告单（附件2）上注明标本性状，以供分析结果时参考。
合格的痰标本应是患者深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物。按性状痰标本可分为以下几种：
干酪痰：标本外观以黄色（或奶酪色）、脓样、团块状的肺部分泌物为主，粘度较粘液痰低，制片时较易涂抹；涂片染色后镜检，可发现大量脓性炎症细胞、肺上皮脱落细胞。由于此类标本是由肺部深处咳出，对肺结核的诊断最有价值，故AFB的检出率较高。
为了进一步加强结核病细菌学实验室质量控制，实现全国结核病控制规划目标，必须具备完善、有效的结核病实验室网络，实验室必须能够提供准确可信的试验结果，并且符合成本－效益原则。为此，只有通过实施有效的质量保证
（Quality Assurance，QA）才能实现。完善的实验室质量保证系统依赖于国家结核病防治规划对各级实验室工作的支持、培训和监督，并在具体实施过程中逐步完善。
编委会
2008年10月
第一章
在结核病控制工作中，通过实验室细菌学检查诊断传染性肺结核是DOTS策略的重要要素之一，痰结核菌检查对于发现传染源、确定诊断和化疗方案、考核疗效、评价防治效果具有重要意义。因此，结核病细菌学检查是国家结核病防治规划（National Tuberculosis Programme, NTP）的重要组成部分，在现代结核病控制工作中起着不可缺少的重要作用。
的纤毛），伴有少量肺上皮脱落细胞（多数为圆形、细胞核较小且着色较细胞质深，核质比大于1：3）、脓性炎症细胞（卵圆形、细胞核占细胞比例较大且着色较深，核质比低于1：1）、口腔脱落细胞及口腔寄生菌。此类标本的AFB检出率较唾液高。
唾液：目视观察标本整体外观，以透明或半透明水样、粘度较低的口腔分泌物为主，标本中有时伴有气泡；涂片染色镜检时，镜下可见少量口腔上皮脱落细胞（形态不规则、细胞核着色较细胞质深，核质比接近或大于1：2）和口腔内寄生菌，有时可见食物残渣。由于此类标本进行AFB检查时的检出率很低，是不合格的标本。
（5）流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。
（6）滴加亚甲蓝复染液，染色30秒钟。
（7）流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，然后沥去标本上剩余的水。待玻片干燥后镜检。
（8）一张染色合格的玻片，痰膜肉眼观为亮蓝色，无红色斑块。
（9）染色液配制见附件3。
3.显微镜检查
（1）使用10×目镜双目显微镜读片。
本手册包括了第一版的大部分内容：结核病痰涂片检查的标准化操作、我国结核病实验室网络中各级实验室在痰涂片镜检质量保证中的职责、实验室质量控制及评估的具体方法，并附有统一的表格，供各省（自治区、直辖市）、地市、县区、乡镇卫生院以及各医疗机构从事结核病痰涂片检查的实验室遵照执行。
本手册在修订和出版过程中，得到了香港跨国结核病参比实验室甘启文主任（Dr. KaiMan KAM）、WHO顾问金尚才教授（Dr. SangJae KIM）以及WHO驻中国代表处医学官员海妮女士（Dr. Cornelia Hennig）的大力支持和帮助，谨表谢意。
2、初、复治涂阳患者在疗程强化期结束时，痰菌仍为阳性者，应在治疗第3个月末增加痰涂片检查1次。
3、确诊、登记的涂阴肺结核患者，即使患者因故未接受治疗，也应在登记后满2个月和6个月时进行痰菌检查。
三、痰标本的采集
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必须采用可密封的、带螺旋盖的容器（图1）收集痰标本。容器的参考规格为：直径4厘米，高度2厘米。痰容器应标明病人姓名、编号（初诊病人门诊序号或随访病人登记号）、检查项目和痰标本序号1、2、3（“1”为当日即时痰，“2”为夜间痰，“3”为次日晨痰）。
中国结核病防治规划
痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册
编委百度文库名单
主审肖东楼王文杰许绍发王黎霞
主编赵雁林刘宇红姜广路夏辉尚美
编者（以姓氏拼音为序）
柴琦陈马秀陈田雄冯苗顾才宏贾卫蓝如束李定越李国刚李国明李辉李琳梁庆福刘洁柳正卫梅建尼玛彭多潘毓萱钱明司红艳苏云开谭云洪王进鸿王莉王庆王瑞王苏民杨修军杨丹丹袁薇张学志赵德福周杨
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由于传染性结核病在流行病学中有着特殊的意义，因此，在反映某一国家或地区结核病疫情的严重程度的指标中，涂阳患病率、涂阳发病率被更多关注。
根据世界卫生组织（(World Health Organization，WHO)和国际防痨及肺部疾病联合会（International Union Against Tuberculosis and Lung Disease,UNION）针对低收入且结核病疫情严重的发展中国家所制定的技术指南，痰涂片镜检是相应国家开展结核病控制项目时非常符合成本效益原则的细菌学实验技术。相对于临床和实验室经常采用的其它诊断和检查项目，高质量的痰涂片镜检有其自身特有的优势：
（6）痰膜朝上静置自然干燥后(一般约需要30分钟)进行染色镜检。
（7）为保证检验人员的安全，严禁在涂抹痰标本的同时对载玻片进行加热。涂抹完毕后的痰标本，在结果报告前应暂时保留。
图2制备好的痰涂片示例
2.染色
（1）涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持10 mm以上的距离；加热固定(在5秒钟内将玻片经过火焰加热4次)。
本手册目的是提供标准化操作程序，为评估实验室工作的质量和结果的可靠性提供指南和方法。需要指出的是应用这些方法并不是为了校正每个病人的诊断正确与否，而是为了发现实验室工作中可能存在的问题并提出相应的解决方案和措施，从而确保整个实验室诊断服务的质量。
第二章痰涂片显微镜检查标准化操作
一、痰涂片检查的目的及优势
（2）滴加石碳酸复红染液盖满玻片，加热至出现蒸汽后，停止加热，保持染色5分钟。染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。加热时勿使染色液沸腾。高海拔地区应适当增加加热次数和染色时间。
（3）流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。
（4）自痰膜上端外缘滴加脱色剂盖满玻片，脱色1分钟；如有必要，流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止。
进行AFB检查的医疗机构应提供符合要求的并作了标记的痰盒给患者。
三、对就诊者的留痰宣传教育
对疑似肺结核病者，临床医护人员应通过解释，使其充分了解标本质量对涂片显微镜检查的重要性，示范并指导其掌握从肺部深处咳痰的方法；还要告知患者获得理想的痰标本有时需要反复数次才能获得。如患者识字，可提供宣教材料。
正确地收集痰液的方法：
（2）取染色完毕且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片台上并以卡尺固定。
（3）首先使用40×物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调节至适当亮度，调节焦距至可见细胞形态。
（4）移开40×物镜，在玻片上滴1～2滴镜油，使用100×油镜进行细致观察。但应避免油镜镜头直接接触玻片上的痰膜。
（5）读片时，首先应从左向右观察相邻的视野；当玻片移动至痰膜一端时，纵向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依此类推(图3)。通常20 mm的痰膜，使用100×油镜，每横行约有100个视野。
四、直接涂片抗酸染色显微镜检查标准化操作程序
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1、涂片制备
（1）使用一端有磨砂面的无划痕的新玻片，经脱脂干燥、清洁后备用；
（2）用2B铅笔在磨砂面上注明实验序号及标本序号；
（3）确保玻片上的编号与痰盒上的编号相同。
（4）小心打开承载痰标本的容器，防止产生气溶胶或使标本外溢。
（5）仔细观察标本，使用折断的竹签茬端，挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑部分约0.05 ml，于玻片正面均匀涂抹成10×20 mm的卵圆形痰膜（见图2）。
（6）在淡蓝色背景下，抗酸菌呈红色；其它细菌和细胞呈蓝色。
（7）仔细观察完300个视野，一般需要5分钟以上；每个工作日，一位镜检人员的玻片阅读量不要超过25张，且连续阅读10～12张玻片后，应休息20分钟左右。
图3镜检读片移动方式
4.镜检结果报告
（1）结果分级报告标准：
抗酸杆菌阴性：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。
前言
为加强我国结核病实验室网络建设，提高各级痰涂片实验室工作质量，我国自2004年引入并全面推行了世界卫生组织（WHO）推荐的“结核病实验室痰涂片检查室间质量保证指南”，并出版印刷了第一版《中国结核病防治规划·痰涂片镜检质量保证手册》（以下简称“手册”）。
在使用新的痰涂片镜检质量保证方法的实践中，我们积累了经验，也发现了一些问题；同时，随着我国结核病控制一些新技术策略的出台，现行“手册”需要进行相应的修改和补充。为此，我们广泛征求了各省专家意见，并进行多次讨论，为了更准确地描述本手册涵盖的内容，经2008年省级参比室工作会议决定，将本手册命名为《中国结核病防治规划·痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》。
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凡因结核病症状求诊及转诊的可疑肺结核患者，均应进行痰涂片检查。确定诊断的涂片检查应采集3个合格的痰标本。就诊当时在门诊留一份“即时痰”标本，同时给患者2个痰盒，嘱患者留取“夜间痰”和“晨痰”，于次日交验。
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凡已确诊、登记、治疗的肺结核患者，在化疗期间按照规定应定期查痰：
1、初治涂阳患者在疗程强化期末、治疗5个月末和继续期结束时（一般为治疗后的第2、5和6个月）；复治涂阳患者在疗程强化期末、治疗第5个月末和继续期结束时（一般为治疗后的第2、5和8个月），分别收集1份晨痰和夜间痰进行涂片检查。
1、作为诊断手段，对传染性肺结核的诊断比X线的准确性高；
2、技术相对简单，容易标准化和完成操作；
3、建立AFB检查时需设备投入少；
4、检查成本低，易于接受；
5、从收到标本到报告结果的时间短，能够满足临床诊断的需要；
6、对涂阳患者的治疗效果，能够作出及时和准确的评价。
二、痰涂片检查对象
根据《中国结核病防治规划实施工作指南》的有关规定，检查对象根据检查目的分为两类：确定诊断（发现传染源）、疗效评价（作为确定化疗方案和治疗效果评价的指标）。
图１标本容器
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1、根据痰标本采集的时间，可将标本分为三类：
即时痰：就诊时深呼吸后咳出的痰液
晨痰：患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第2口、第3口痰液
夜间痰：送痰前一日，患者晚间咳出的痰液
2、痰标本采集的数量：
初诊患者应收集3份痰标本（当日即时痰、夜间痰、次日晨痰）；
治疗或随访患者应按期留取2份标本（晨痰、夜间痰）。