第5章荧光分析法与化学发光分析法.
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
F=K’·φf· I0（1-e-εbC）
K’——仪器常数，φf——激发光强度
当C很小时，A=εbC≤0.05时，
e-εbc=1-εbc
F=k’·φf· I0εbC=KC
39
2．定量分析方法
标准曲线法 比例法 多组分混合物的荧光分析
40
3．荧光分析新技术简介
（1）激光荧光分析 （2）时间分辨荧光分析
（2）产生荧光的必备条件
强紫外-可见吸收 一定的荧光效率
π→π*跃迁
强吸收带
n →π*跃迁
弱吸收带
存在共轭的π→π*跃迁， φf高，荧光强度大。
18
2．影响荧光强度的结构因素
(1)共轭效应 (2)分子的刚性与共平面性 (3)取代基效应
19
(1)共轭效应
绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂 环，因为芳香环或杂环分子具有长共轭的 π→π*跃迁。π电子共轭程度越大，荧光强度 （荧光效率）越大，而荧光波长也长移。
20
苯
λ ex 205nm
萘
268nm 321nm
蒽
356nm 404nm
λ em 278nm
φf
0.11
0.29
0wk.baidu.com36
21
(2)分子的刚性与共平面性
在同样的长共轭分子中，分子的刚性和共 平面性越大，荧光率越大，并且荧光波 长产生长移。
C H2
22
(3)取代基效应
第一类取代基：－NH2、－OH、－OCH3、 －NHR、－NR2、－CN等 第二类取代基：－COOH、－NO2、－C＝ O、－NO、－SH、－NHCOCH3、－F、
第5章 荧光分析法与 化学发光分析法
基本内容
5.1 5.2 荧光分析法 化学发光分析法
1
相关定义
光致发光：分子、原子吸收光辐射时被激发，然后再发射出
与吸收的波长相同或更长光的现象。
荧光：物质分子吸收光子能量被激发后从激发态的最低振动 能级返回到基态时所发射出的光。 分子荧光分析法 ：研究物质分子的荧光谱线位置及其强度进 行物质鉴定和含量测定的方法 ，简称荧光分析法 。
散射光的影响
瑞利散射光
拉曼散射光
干扰荧光测定，应采取措施消除
30
硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱
31
5.1.3
荧光分光光度计
32
1. 激发光源
高压氙灯 ——强谱线的连续光谱
连续分布在250-700nm波长范围内，尤其是300-400nm波 长之间的谱线强度几乎相等
汞灯 ——线光谱
高压：近紫外区365nm,398nm，405nm，436nm，546nm，579nm 低压:紫外区，最强254nm
11
蒽的激发光谱和荧光光谱
12
蒽的能级跃迁
13
与UV比较
相同点 λ区段：Vis-UV区 适用性：均可用于定性定量，多用于定量 定量方法：相似 样品性质、量：以液体为主、均少 分析时间：均快
操作难易程度：易
14
与UV比较
不同点
UV 性 质 分子吸收光谱 广 不高 10-7 透射光 1 应用范围 选择性 灵敏度 g/ml 仪器观察角度 谱线数目 FL 分子荧光光谱 有荧光的物质，较少 高 10-10~10-12 90° 2
化学发光：基于化学反应产生能量来激发分子，分子由激发
态回到基态时产生的光辐射现象。
2
特点
荧光分析法：灵敏度高、选择性好
化学发光分析法：灵敏度高；线性范围宽；分析
速度快；仪器设备简单，不需要光源及单色器 等；没有散射光及杂散光等引起的背景值。
3
5.1 荧光分析法
5.1.1 基本原理
5.1.2 影响荧光强度的因素
－Cl、－Br、－I等
第三类取代基：－R、－SO3H、－NH3＋等
23
3．影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 pH值的影响
荧光熄灭剂的影响
散射光的干扰
24
温度和溶剂
温度：温度升高，荧光物质的荧光效率 和荧光强度下降 溶剂：溶剂极性增大，荧光波长随着而 长移，荧光强度增强；溶剂粘度减小， 荧光强度减小
27
荧光熄灭剂
荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质 分子相互作用引起荧光强度降低的现象。
引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂。
28
常见的荧光熄灭剂
卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、 重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物
荧光熄灭的形式：
a、碰撞、 b、生成不发光配位化合物 c、荧光物质氧化
29
33
2. 单色器
激发单色器---除去不需要的光线 发射单色器---选择不同的荧光发射波长
34
3. 样品池
低荧光的玻璃或石英
方形适用于90°测量
35
4.检测器
光电倍增管
36
5.读出系统
数字电压表 记录仪 带有计算机控制的读数装置
37
5.1.4 分析方法
溶液产生荧光的光路示意图
38
1．荧光强度与物质浓度的关系
15
5.1.2 影响荧光强度的因素
1．荧光效率与荧光产生的条件 2．影响荧光强度的结构因素 3．影响荧光强度的外部因素
16
(1)荧光效率
激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发
光的光子数之比，常用φf表示：
发射荧光的光子数 f 吸收激发光的光子数
φf (0~1)
φf 大的有荧光发射
17
25
pH值的影响
当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH 值对该荧光物质的荧光强度有较大影响，
这主要是因为弱酸弱碱分子和它们的离子
结构有所不同，在不同酸度中分子和离子 间的平衡改变，因此荧光强度有差异。
26
苯胺在不同pH值下有下列平衡关系
NH3+ OH－ H＋ NH2 OH－ H＋ NH－
苯胺在pH7～12的溶液中主要以分子形式存在，由于 -NH2为提高荧光效率的取代基，故苯胺分子会发生 蓝色荧光。但在pH<2和pH>13的溶液中均以苯胺离 子形式存在，故不能发射荧光。
1）激发光谱和发射光谱 2）荧光光谱特征
8
1）激发光谱和发射光谱
激发λ、ε 荧光λ 图形 激发光谱 发射光谱 变 不变 不变 变 F~λex图 F~λem图
9
硫酸奎宁的激发光谱（a） 及荧光光谱（b）
10
2）荧光光谱特征
（1）Stokes位移 （2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关 （3）荧光光谱与激发光谱的镜像关系
5.1.3 荧光分光光度计 5.1.4 分析方法 5.1.5 应用示例
4
5.1.1
基本原理
1．分子中电子的激发过程 2．分子荧光的产生 3．荧光光谱的类型和特征
5
1．分子中电子的激发过程
6
2.分子荧光的产生
振动弛豫 内部能量转换 荧光发射
外部能量转换
体系间跨越 磷光发射
7
3．荧光光谱的类型和特征
K’——仪器常数，φf——激发光强度
当C很小时，A=εbC≤0.05时，
e-εbc=1-εbc
F=k’·φf· I0εbC=KC
39
2．定量分析方法
标准曲线法 比例法 多组分混合物的荧光分析
40
3．荧光分析新技术简介
（1）激光荧光分析 （2）时间分辨荧光分析
（2）产生荧光的必备条件
强紫外-可见吸收 一定的荧光效率
π→π*跃迁
强吸收带
n →π*跃迁
弱吸收带
存在共轭的π→π*跃迁， φf高，荧光强度大。
18
2．影响荧光强度的结构因素
(1)共轭效应 (2)分子的刚性与共平面性 (3)取代基效应
19
(1)共轭效应
绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂 环，因为芳香环或杂环分子具有长共轭的 π→π*跃迁。π电子共轭程度越大，荧光强度 （荧光效率）越大，而荧光波长也长移。
20
苯
λ ex 205nm
萘
268nm 321nm
蒽
356nm 404nm
λ em 278nm
φf
0.11
0.29
0wk.baidu.com36
21
(2)分子的刚性与共平面性
在同样的长共轭分子中，分子的刚性和共 平面性越大，荧光率越大，并且荧光波 长产生长移。
C H2
22
(3)取代基效应
第一类取代基：－NH2、－OH、－OCH3、 －NHR、－NR2、－CN等 第二类取代基：－COOH、－NO2、－C＝ O、－NO、－SH、－NHCOCH3、－F、
第5章 荧光分析法与 化学发光分析法
基本内容
5.1 5.2 荧光分析法 化学发光分析法
1
相关定义
光致发光：分子、原子吸收光辐射时被激发，然后再发射出
与吸收的波长相同或更长光的现象。
荧光：物质分子吸收光子能量被激发后从激发态的最低振动 能级返回到基态时所发射出的光。 分子荧光分析法 ：研究物质分子的荧光谱线位置及其强度进 行物质鉴定和含量测定的方法 ，简称荧光分析法 。
散射光的影响
瑞利散射光
拉曼散射光
干扰荧光测定，应采取措施消除
30
硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱
31
5.1.3
荧光分光光度计
32
1. 激发光源
高压氙灯 ——强谱线的连续光谱
连续分布在250-700nm波长范围内，尤其是300-400nm波 长之间的谱线强度几乎相等
汞灯 ——线光谱
高压：近紫外区365nm,398nm，405nm，436nm，546nm，579nm 低压:紫外区，最强254nm
11
蒽的激发光谱和荧光光谱
12
蒽的能级跃迁
13
与UV比较
相同点 λ区段：Vis-UV区 适用性：均可用于定性定量，多用于定量 定量方法：相似 样品性质、量：以液体为主、均少 分析时间：均快
操作难易程度：易
14
与UV比较
不同点
UV 性 质 分子吸收光谱 广 不高 10-7 透射光 1 应用范围 选择性 灵敏度 g/ml 仪器观察角度 谱线数目 FL 分子荧光光谱 有荧光的物质，较少 高 10-10~10-12 90° 2
化学发光：基于化学反应产生能量来激发分子，分子由激发
态回到基态时产生的光辐射现象。
2
特点
荧光分析法：灵敏度高、选择性好
化学发光分析法：灵敏度高；线性范围宽；分析
速度快；仪器设备简单，不需要光源及单色器 等；没有散射光及杂散光等引起的背景值。
3
5.1 荧光分析法
5.1.1 基本原理
5.1.2 影响荧光强度的因素
－Cl、－Br、－I等
第三类取代基：－R、－SO3H、－NH3＋等
23
3．影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 pH值的影响
荧光熄灭剂的影响
散射光的干扰
24
温度和溶剂
温度：温度升高，荧光物质的荧光效率 和荧光强度下降 溶剂：溶剂极性增大，荧光波长随着而 长移，荧光强度增强；溶剂粘度减小， 荧光强度减小
27
荧光熄灭剂
荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质 分子相互作用引起荧光强度降低的现象。
引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂。
28
常见的荧光熄灭剂
卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、 重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物
荧光熄灭的形式：
a、碰撞、 b、生成不发光配位化合物 c、荧光物质氧化
29
33
2. 单色器
激发单色器---除去不需要的光线 发射单色器---选择不同的荧光发射波长
34
3. 样品池
低荧光的玻璃或石英
方形适用于90°测量
35
4.检测器
光电倍增管
36
5.读出系统
数字电压表 记录仪 带有计算机控制的读数装置
37
5.1.4 分析方法
溶液产生荧光的光路示意图
38
1．荧光强度与物质浓度的关系
15
5.1.2 影响荧光强度的因素
1．荧光效率与荧光产生的条件 2．影响荧光强度的结构因素 3．影响荧光强度的外部因素
16
(1)荧光效率
激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发
光的光子数之比，常用φf表示：
发射荧光的光子数 f 吸收激发光的光子数
φf (0~1)
φf 大的有荧光发射
17
25
pH值的影响
当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH 值对该荧光物质的荧光强度有较大影响，
这主要是因为弱酸弱碱分子和它们的离子
结构有所不同，在不同酸度中分子和离子 间的平衡改变，因此荧光强度有差异。
26
苯胺在不同pH值下有下列平衡关系
NH3+ OH－ H＋ NH2 OH－ H＋ NH－
苯胺在pH7～12的溶液中主要以分子形式存在，由于 -NH2为提高荧光效率的取代基，故苯胺分子会发生 蓝色荧光。但在pH<2和pH>13的溶液中均以苯胺离 子形式存在，故不能发射荧光。
1）激发光谱和发射光谱 2）荧光光谱特征
8
1）激发光谱和发射光谱
激发λ、ε 荧光λ 图形 激发光谱 发射光谱 变 不变 不变 变 F~λex图 F~λem图
9
硫酸奎宁的激发光谱（a） 及荧光光谱（b）
10
2）荧光光谱特征
（1）Stokes位移 （2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关 （3）荧光光谱与激发光谱的镜像关系
5.1.3 荧光分光光度计 5.1.4 分析方法 5.1.5 应用示例
4
5.1.1
基本原理
1．分子中电子的激发过程 2．分子荧光的产生 3．荧光光谱的类型和特征
5
1．分子中电子的激发过程
6
2.分子荧光的产生
振动弛豫 内部能量转换 荧光发射
外部能量转换
体系间跨越 磷光发射
7
3．荧光光谱的类型和特征