最新ELISA双抗体夹心法
双抗夹心法-ELISA
双抗夹心法ELISA（TAS-ELISA）步骤：1、准备可控温培养箱或摇床和样品。
样品用液氮或研钵研磨碎，再用组织：1×GEB 缓冲液=1:10（g:ml）浓度液提取。
2、用碳酸盐包被缓冲液稀释一抗，稀释倍数为200倍。
每孔加入稀释后的一抗100μl。
将加入一抗的酶标板用锡箔纸包裹，置于4℃下过夜或室温下放置4小时或37℃下放置2小时。
3、一抗包被结束时，在水池中倒出剩余液体，用1×PBST洗4-5次，每次将酶标板在吸水纸上用力拍一下以去除多余液体。
4、每孔加入100μl事先处理好的样品，每批实验均需加入阳性对照和样品提取液（GEB）。
将加入样品的酶标板用锡箔纸包裹，置于4℃下过夜或室温下放置4小时或37℃下放置2小时。
5、样品包被时间结束时，在水池中快速倒出剩余样品液体，用1×PBST洗7次，最后一次在吸水纸上用力拍一下以去除多余液体。
在室温中放置5min，或用枪头吸尽孔中液体。
6、用ECI抗体稀释液稀释酶标二抗，稀释倍数为200倍。
每孔加入稀释后的二抗100μl。
将加入二抗的酶标板用锡箔纸包裹，置于4℃下过夜或室温下放置4小时或37℃下放置2小时。
7、二抗包被结束时，在水池中快速倒出剩余抗体，用1×PBST洗8次，最后一次在吸水纸上用力拍一下以去除多余液体。
在室温中放置5min，或用枪头吸尽孔中液体和气泡。
8、在二抗包被结束前15min中准备底物显色液。
PNPP/1×PNP Buffer=1mg/ml的浓度配制，避光保存。
每孔加入底物100μl。
将加入底物的酶标板用锡箔纸包裹，置于37℃下孵育1小时。
9、显色30min时用肉眼观察显色结果，阳性孔应该显色，GEB孔应该无色。
直到显色1h时，阴性仍然无色就在酶标仪上测405nm处的OD值，求出阴性对照的OD值的值N，若样品OD值P≥2N，则视为阳性，否则为阴性。
试剂：。
双抗体夹心法原理
双抗体夹心法原理
双抗体夹心法（double-antibody sandwich assay）又称为酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的免疫学检测方法，用于检测目标物质，如蛋白质、抗原或抗体等。
双抗体夹心法的原理是利用两种不同的抗体，一种用于固定在检测板上，另一种被标记着酶，并用于检测样本中的目标分子。
在检测时，将待测样本加入到固定抗体覆盖的检测板孔中，待目标分子结合到固定抗体上后，洗涤样本，加入酶标记的抗体，酶与目标分子再次结合形成“夹心”复合物。
通过在底物的作用下，酶能够将底物转化为荧光或颜色生成物，由于只有与目标分子结合的酶标记的抗体才能够被夹持，因此可以确定样本中目标分子的数量，通过比较标准品样本的反应值得出定量。
总的来说，双抗体夹心法的优点是具有高灵敏度、特异性、精确度高以及批量化检测的优点，同时也非常适合小样本检测。
因此，双抗体夹心法被广泛应用于医学、食品安全、环境监测等领域的检测中。
ELISA操作步骤(双抗体夹心法)
ELISA操作步骤（双抗体夹心法）1. 包被过程(注意设置空白对照,阴性对照):将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体，(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)。
2 PBS洗3次，每次3分钟。
具体为.吸干或甩干孔内反应液；.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；吸干孔内液体，可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；.重复操作涤3次。
3. 加入待检测样品(建立合适的浓度梯度):检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl。
将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔100μl，置于37℃,40-60min。
4 PBS洗3次，每次3分钟。
5. 加入酶标抗体:酶标抗体: 根据酶结合物提供商提供的参考稀释度进行或建立浓度梯度，37℃,30-60min之间，短于30min往往结果不稳定，每孔加100μl。
6 PBS洗3次，每次3分钟。
7. 加入底物液(现用现配):TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl，底物加入量每孔100μl（TMB空白显色孔除外）,置37℃避光放置20-25分钟。
8. 终止反应:每孔加入终止液50μl(2M H2SO4)终止反应,此时蓝色立转黄色，于20min内测定实验结果。
9 结果判断:可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。
也可测吸光值：在ELISA检测仪上，TMB反应产物检测需要450nm波长，检测时一定要首先进行空白孔系统调零。
用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示，当P/N大于2时作为抗体的效价即大于阴性对照吸光值的2倍，(数值的大小依具体检测要求而定)。
免疫学实验ELISA双抗夹心法课件
小于判断值为阴性。 注：阴性对照OD值小于0.05按0.05计算，
大于0.05按实际OD值计算判断值。
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注意事项：
1. 试剂及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂混匀， 弃去1～2滴垂直滴加；
2. 严格按照操作程序依次加样，以保证实验结果准确性； 3. 应尽量避免孔中有气泡，以免所测得OD值不准确。
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思考题：
1.免疫标记技术有哪些？各有何特点？。 2.ELISA操作过程中应注意哪些问题？
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2009级医疗专科复习题
一、名词解释2.5*8,共20分
免疫、抗原、抗原决定基(表位)、异嗜性抗原、白细胞分 化抗原、TD-Ag、 TI-Ag、抗体、免疫球蛋白、单（多）克 隆抗体、补体、经典途径、旁路途径、细胞因子、IL、IFN、 CSF、TNF、MHC、MHC限制性、TCR、BCR、模式识别 受体（PRR）、抗原提呈细胞（ APC）、适应性免疫应答、 免疫耐受、免疫调节、超敏反应、人工主动免疫、人工被动 免疫、计划免疫 注：红色标记为要求掌握英文
实验原理：
酶联免疫吸附试验（ELISA）是将抗原、抗体的特异性反应与酶对底 物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术，可用于检测体 液中微量的特异性抗体或抗原。首先，抗原、抗体的特异性反应在一种 固相载体表面－聚苯乙烯微量反应板孔中进行，通过洗涤去除多余的游 离反应物；然后加入酶标记的抗体或酶标记的抗抗体，从而形成抗体－ 抗原－酶标抗体复合物（双抗体夹心法）或抗原－抗体－抗抗体复合物 （间接法）；此时加入酶底物和显色剂，在酶催化底物后，液体呈现显 色反应。液体显色的强弱与复合物中待测抗原或抗体的量呈正比，借此 可检测待测抗原或抗体的有无及含量。
elisa双抗体夹心法实验报告
elisa双抗体夹心法实验报告实验报告：ELISA双抗体夹心法实验一、实验目的本实验旨在通过ELISA双抗体夹心法，检测待测样品中目标蛋白的含量，为相关研究提供依据。
二、实验原理ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种灵敏的免疫学检测方法，通过将特异性抗体与酶标记结合，实现对目标蛋白的定量检测。
双抗体夹心法是一种常用的ELISA 技术，其原理是将两种特异性抗体分别固定在酶标板的不同位置上，形成两个“抗体夹心”，实现对目标蛋白的双重捕获，从而提高检测的灵敏度和特异性。
三、实验步骤1.酶标板包被：将第一种特异性抗体（capture antibody）包被在酶标板孔中，以固定化抗体形式捕获目标蛋白。
2.封闭：加入封闭液（通常为正常血清或BSA），填充孔内未结合的位点，以减少非特异性吸附。
3.洗涤：洗涤液清洗酶标板，去除未结合的物质。
4.样本加入：将待测样本加入酶标板孔中，与固定化的抗体发生特异性结合。
5.洗涤：再次洗涤酶标板，以去除未结合的物质。
6.酶标二抗加入：将第二种特异性抗体（detection antibody）与酶标记结合，形成酶标二抗。
将酶标二抗加入酶标板孔中，与目标蛋白发生特异性结合，形成“抗体夹心”。
7.洗涤：洗涤液清洗酶标板，去除未结合的物质。
8.显色反应：加入底物溶液，发生显色反应。
若目标蛋白存在，则呈现颜色变化。
9.终止反应：加入终止液，停止显色反应。
10.吸光度测定：用酶标仪测定各孔的吸光度值（通常在450nm处测量），根据吸光度值判断目标蛋白的含量。
四、实验结果根据实验数据，绘制标准曲线图和散点图，分析待测样品中目标蛋白的含量。
通常，标准曲线图横坐标为蛋白浓度，纵坐标为吸光度值。
通过将待测样品的吸光度值与标准品进行比较，计算出待测样品中目标蛋白的浓度。
五、实验总结本实验通过ELISA双抗体夹心法成功检测了待测样品中目标蛋白的含量。
实验过程中需注意保持操作环境的清洁和干燥，避免影响实验结果。
elisa双抗体夹心法临床应用
elisa双抗体夹心法临床应用ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种广泛应用于生物医学领域的实验技术，可以用于检测特定抗体或抗原的存在。
在ELISA实验中，常用的检测方法之一就是双抗体夹心法。
本文将介绍ELISA双抗体夹心法在临床应用中的重要性和优势。
一、ELISA双抗体夹心法原理ELISA双抗体夹心法是一种通过两种抗体反应来检测目标分子的方法。
首先，在试验板上吸附抗原，然后加入第一种对抗原特异的抗体，使其与抗原结合。
接着，加入第二种与第一种抗体不同的抗体，这第二种抗体常被标记有酶等物质，以便后续检测。
通过测量酶的底物反应程度，可以确定目标分子的存在量。
二、ELISA双抗体夹心法在临床诊断中的应用1. 疾病诊断：ELISA双抗体夹心法可以用于检测患者体液中特定抗原或抗体的存在，帮助医生进行疾病的早期诊断。
例如，在HIV感染的诊断中，ELISA双抗体夹心法有着很高的敏感性和特异性，可以快速准确地检测出HIV抗体的存在。
2. 肿瘤标记物检测：ELISA双抗体夹心法也常用于检测患者体液中的肿瘤标记物，帮助筛查和监测肿瘤患者的疾病进展。
通过检测血清中特定肿瘤标记物的水平，医生可以及早发现肿瘤的复发或转移。
3. 药物检测：在药物治疗过程中，ELISA双抗体夹心法可以帮助医生监测患者体内药物浓度的变化，确定药物的治疗效果，以及调整治疗方案。
三、ELISA双抗体夹心法的优势1. 敏感性高：ELISA双抗体夹心法可以检测非常低浓度的抗原或抗体，具有较高的敏感性。
2. 特异性好：通过选择特异性较好的抗体，可以确保ELISA双抗体夹心法对目标分子的检测具有较高的特异性。
3. 操作简便：ELISA双抗体夹心法操作简单，不需要复杂的仪器设备，适合临床快速检测的需求。
总结：ELISA双抗体夹心法作为一种重要的生物医学检测技术，在临床应用中发挥着重要作用。
其高敏感性、良好特异性和操作简便性，使其成为临床诊断和治疗中不可或缺的工具，有助于提高疾病的早期诊断率和治疗效果，促进患者的健康管理。
ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原
ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原临床ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原对于含多个抗原决定簇的大分子蛋白，使用双抗体夹心ELISA模式测定相当简便，现有的商品试剂盒基本上都采用此种测定模式。
具体测定方法如下：1．首先以双抗体之一于碳酸盐缓冲液中4℃下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。
2．加入含待测物的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测抗原就会与固相上特异抗体反应而吸附于固相上。
3．加入酶标记的双抗体之二，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产物。
4．加入酶底物，温育显色测定(图2—1)。
在该测定模式中，有两步温育和板孔洗涤步骤，如果将上述测定步骤2和3并为一步，即将待测样本和酶标抗体同时加入，从而仅有一步温育和洗板过程，即为通常所说的“一步法”。
最初的双抗夹心ELISA试剂盒，均采用两步法。
后来，人们为了节省时间，简化操作步骤，试剂生产厂家逐步推出了“一步法”试剂盒。
目前在我们的临床实验室中，测定大分子抗原如HAg、。
FP和hCG等，基本上都采用一步法。
一步法相比于两步法，虽然操作简单‘但有其固有的缺陷，处理不好，对ELISA测定结果有严重影响。
在通常的两步温育洗涤方法中，抗原抗体反应将遵循下述规律，即在第一步中加入的待测标本中抗原(Ag)浓度逐步增加时，将使固相抗体(Ab)与抗原的结合逐步达到饱和[(1)式]，这样当随后加入一定浓度的酶标抗体(Ab’)后，a复合物的形成将直接与在第一步中形成的b复合物相关[(2)式]，因此，待测抗原浓度的逐步增加导致了显色的逐步加深，当抗原浓度增加到一定程度时，反应显色达到平台，而呈S形变化曲线。
而一步法双抗夹心ELISA的反应曲线则为钟形曲线。
也就是说测定显色随着待则标本中抗原浓度的增加而升高至一定程度后，测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直至不显色，即所谓的“钩状效应”(hook eHect)，也就是我们在免疫沉淀试验中所称的“带现象”(zonephen。
酶联免疫吸附双抗体夹心法
性抗体作用。显色。
结合在固相载体表面的抗原（或抗体）仍保持其免疫学活性。
固相(包被)抗体Ab + 样品(抗原Ag) + 酶标抗体Ab * ELISA的三条基本原理
这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要与包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异
性抗体作用。
这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位， 加入封闭蛋白溶液以封闭载体
这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要与包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异
性载抗体体 连作接用形。成因固相为抗体其一端要与包被于固相载体上的抗体作用，而另一端
则要与酶标记特异性抗体作用。 由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
酶联免疫吸附双抗体夹心法
优选酶联免疫吸附双抗体夹心法
一、实验目的 1 掌握酶联免疫吸附实验（ELISA）的原理 2 熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法
二、实验原理
❖ 基础知识
1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者 Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发 展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法， 即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA现在 已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是 一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术 ( immunoenzymatic techniques ) 的基础上 发展起来的一种新型的免疫测定技术。
双抗体夹心elisa方法的原理
双抗体夹心elisa方法的原理
宝子，今天咱来唠唠双抗体夹心ELISA方法的原理哈。
ELISA呢，就是酶联免疫吸附测定，这双抗体夹心ELISA可有意思啦。
它就像是给抗原这个小坏蛋设了个包围圈。
有两种抗体参与哦。
一种是捕获抗体，就像一个小陷阱，先被固定在检测板上，就等着抗原上钩呢。
这个捕获抗体的形状和抗原的某个部分特别匹配，就像一把钥匙配一把锁一样。
然后呢，咱们要检测的抗原就大摇大摆地来了，它一头就扎进了捕获抗体这个小陷阱里，紧紧地结合在一起啦。
这时候，另一种抗体，也就是检测抗体就登场啦。
检测抗体也是专门针对抗原的，它从另一个方向和抗原结合，就像给抗原来了个前后夹击。
这个检测抗体还带着特殊的标记呢，就像是它的小标签。
这个标记可以是酶之类的东西。
接下来就更有趣啦。
当我们加入底物的时候，因为检测抗体上带着酶标记，这个酶就像一个小工匠，它会对底物进行加工。
底物被加工之后呢，就会发生一些变化，比如说变色啦。
我们就可以根据这个变化的程度来判断抗原的量。
如果颜色变得很深，那就说明抗原的量比较多；要是颜色浅，那抗原的量就少啦。
双抗体夹心ELISA方法可厉害了，它能够很灵敏地检测出抗原。
在医学上呀，它能检测出身体里是不是有病毒或者细菌的抗原，帮助医生判断病情。
在食品检测里呢，也能检测出有没有有害的微生物抗原，保障我们的食品安全。
反正这双抗体夹心ELISA方法就像一个小小的侦探，在微观的世界里，把抗原这个小目标给找出来，然后告诉我们它的情况呢。
是不是很神奇呀，宝子？ 。
双抗原抗体夹心法的原理
双抗原抗体夹心法的原理
双抗原抗体夹心法（Sandwich ELISA）是一种常用的酶联免疫吸附试验方法，用于检测具有两个抗原表位的物质，如蛋白质。
该方法的原理是，在试验板上固定一种特异性抗体，使其与待测物质中的目标抗原结合。
然后，通过洗涤步骤去除非特异性结合物质。
接下来，在试验板上加入第二种特异性抗体，这种抗体与目标抗原的另一个表位结合，与第一种抗体形成"夹心"结构。
然后，再次进行洗涤步骤，以去除非特异性结合物质。
最后，加入带有酶标记的二抗，这种二抗能够与第二种抗体结合，形成夹心结构，并且带有酶标记的二抗能够与底物反应，产生可检测的信号。
通过测量底物的反应产物的颜色或发光强度，就可以确定目标抗原的存在量。
双抗原抗体夹心法的优势在于能够提高检测的灵敏度和特异性，因为需要两个特异性抗体结合目标抗原才能形成夹心结构，减少了非特异性结合的干扰。
这种方法广泛应用于生物医学研究和临床诊断中，用于检测各种蛋白质、肽、细胞因子等分子的含量。
elisa双抗夹心法实验原理
elisa双抗夹心法实验原理Elisa双抗夹心法是一种用于检测目标物质的方法，广泛应用于生物医学研究、医学诊断和药物开发等领域。
该方法的原理基于对特定抗原和抗体之间的特异性结合反应进行检测。
Elisa双抗夹心法的原理主要包括以下几个步骤：1.修饰固体基质：首先，需要将特定的抗原结合到固体基质（例如酶标板）。
这可以通过直接吸附、共价结合或通过间接的亲和结合等方法来实现。
2.样品处理：样品（例如血清、细胞上清液等）中的目标物质将通过特定操作被加入到修饰后的固体基质上。
3.加入第一抗体：在样品中加入特异性的第一抗体。
这个第一抗体具有与样品中目标物质结合的能力。
4.洗涤步骤：将未结合的物质（如非特定结合的蛋白质、细胞等）洗涤掉，以减少干扰因素。
5.加入第二抗体：在第一抗体识别的目标物质上加入与其结合的第二抗体。
这个第二抗体上标记有荧光素、酶素等可以用于检测的信号物质。
6.洗涤步骤：将未结合的第二抗体洗涤掉。
7.加入检测物质：将适当的荧光素、酶素底物等添加到样品中。
8.信号检测：通过荧光检测、色素反应观察、光谱读取等方法，确定目标物质的存在与否。
这种双抗夹心法的原理在于，目标物质被检测之前会首先与固体基质上的抗原结合，然后在样品中与第一抗体特异结合。
第一抗体与目标物质结合后，样品经过洗涤步骤，以移除非特异性结合的物质。
接下来加入与第一抗体特异结合的第二抗体，第二抗体可以标记有信号产生物质。
经过洗涤步骤，未与第二抗体结合的物质将被去除。
最后，通过观察标记的信号物质的产生（如荧光强度的变化或酶底物的反应），可以确定目标物质的存在与否。
Elisa双抗夹心法的优点是：检测灵敏度高，特异性好，可以同时测定多个样品。
并且，该方法适用于不同种类的目标物质，如蛋白质、抗体、病毒等。
但也需要注意的是，该方法具有较长的操作时间，且需要复杂的实验步骤和设备。
在实验过程中，对温度、洗涤缓冲液pH值、洗涤次数等条件要求严格，实验结果的准确性一定程度上取决于实验操作的细节。
双抗体夹心法
1.双抗体夹心法双抗体夹心法,属于非竞争结合测定.它是检测抗原最常用的ELISA,适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原,而不能用于小分子半抗原的检测.其基本工作原理是:利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合,形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物.由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比(在方法可检测范围内).测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值),即可确定待测抗原含量. 若固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同的抗原决定簇结合,则属于双位点夹心法.若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合,则是双抗原夹心法.操作步骤:⑴将特异性抗体包被固相载体McAb.孵育一定时间,使形成固相抗体,洗涤除去未结合的抗体和杂质.⑵加待检标本,孵育,使标本中的抗原与固相载体上的抗体充分反应,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质.⑶加酶标抗体,孵育,使形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体夹心复合物.洗涤除去未结合酶标抗体.⑷加底物显色.固相上的酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗原的量.现多采用针对单一抗原决定簇特异性的单克隆抗体做固相化和酶标抗体,则受检样品和酶标抗体可一次性加入,简化流程,缩短反应时间.若标本中待测抗原浓度过高,抗原可分别与酶标抗体和固相抗体结合而不形成上述夹心复合物(类似于免疫沉淀反应中抗原过剩时的后带现象),使最终结果低于实际含量(钩状效应),甚至出现假阴性现象.因此对此类标本应适当稀释后再测定.另外,当血清中存在类风湿因子(RF)时,类风湿因子(RF)可充当抗原,而形成固相抗体-类风湿因子-酶标抗体夹心复合物,从而出现假阳性结果.2.间接法此法是测定抗体最常用的方法,属非竞争结合试验.其原理是将抗原连接到固相载体上,样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物,再用酶标二抗(针对受检抗体的抗体,如羊抗人IgG抗体)与固相免疫复合物中的抗体结合,形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物,测定加底物后的显色程度,确定待测抗体含量.操作步骤⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原.洗涤除去未结合的抗原及杂质.⑵封闭:用高浓度无关蛋白封闭,阻止待检血清中非特异IgG吸附固相.⑶加待检血清,孵育,使固相抗原和待检抗体充分结合,洗涤除去未结合的非特异抗体及其他血清成分.⑷加酶标抗体或酶标SPA,孵育,形成固相抗原-待检抗体-酶标抗抗体(或酶标SPA)复合物.⑸加底物显色.间接法由于采用的酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子(如抗人IgG),因此该法只需要换固相抗原,即可用一种酶标二抗检测各种与抗原相应的抗体,具有更广泛的通用性.3.竞争法竞争法ELISA可用于抗原和半抗原的定量测定,也可对抗体进行检测.其方法和特点是:①酶标记抗原(抗体)与样品或标准体中的非标记抗原或抗体具有相同的与固相抗体(抗原)结合的能力;②反应体系中,固相抗体(抗原)和酶标抗原(抗体)是固定限量,且前者的结合位点少于酶标记与非标记抗原(抗体)的分子量和;③免疫反应后,结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原(抗体)的量(酶活性)与样品或标准品中非标记抗原(抗体)的浓度成反比.操作步骤⑴将已知抗体包被载体,形成固相抗体.洗涤除去未结合物.⑵加入待检标本和酶标抗原,孵育,使两者与固相抗体竞争结合.洗涤除去未结合到固相上的游离酶标抗原及其他未结合物.⑶加底物显色.颜色深浅与待测抗原量成反比.同理,也可用固相抗原和酶标抗体作试剂,使固相抗原和标本中的待检抗原竞争结合酶标抗体.待检抗原竞争抑制酶标抗体和固相抗原结合,即待检抗原越多,显色越浅.以抗原测定为例,先将特异性抗体连接于固相载体,分别设置对照管和样品测定管;对照管中仅加酶标抗原,加样后,无非标记抗原竞争,酶标抗原即与固相抗体充分结合;而测定管抗原与后者的结合受到抑制而减少.加酶底物显色后,对照管因固相抗体上结合的酶标抗原多,显色深,测定管则依被检抗原和酶标抗原竞争结合固相抗体程度不同而显色深浅有异:被检抗原多,酶标抗原与固相抗体结合少,底物显色反应弱,色浅;反之呈色深.即结合于固相的酶标抗原量与样品中被检抗原浓度负相关.计算测定管与对照管颜色深度(OD值)之差,即可确定被检抗原量.4.捕获法捕获法(亦称反向间接法)ELISA,主要用于血清中某种抗体亚型成分(如IgM)的测定.以目前最常用的IgM测定为例,因血清中针对某种抗原的特异性IgM和IgG同时存在,则后者可干扰IgM的测定.因此捕获法的工作原理设计为:先将针对IgM的第二抗体(如羊抗人IgMμ链抗体)连接于固相载体,用以结合("捕获")样品中所有IgM(特异或非特异),洗涤出去IgG等无关物质,然后加入特异抗原与待检IgM结合;再加入抗原特异的酶标抗体,最后形成固相二抗- IgM-抗原-酶标抗体复合物,加酶底物作用显色后,即可对样品中待检IgM是否存在及其含量进行测定.5.其他ELSAELSA法由于测定灵敏,特异,操作简便,易于自动化,且无放射性污染等诸多优点,使其不仅成为目前应用最广而且发展最快的一种免疫测定技术.而且在方法学上的改进和衍化,使其不断有各具特点的新测定法问世,如应用生物素-亲和素放大系统(biotin-axidin system,BAS)的ELISA;利用酶催化底物发荧光的酶联免疫荧光测定(enzyme linked immunofluorecence assay,ELFIA),斑点-ELISA(dot-ELISA)和酶联免疫电转移印迹法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB)以及酶联免疫化学发光测定(enzyme linked immunochemiluminescence assay,ELICLA)等.新方法不仅进一步提高了测定灵敏,特异性,而且使ELISA技术在提高自动化程度的同时,也便于单份样本测定和简化设备条件,尤其试用于急诊,社区诊所及家庭化验.膜载体的酶免疫测定固相膜免疫测定(solid phase membrane-based immuoassay )与固相酶免疫测定(ELISA)相类似,其特点是以微孔膜作为固相.标记物可用酶和各种有色微粒子,如彩色乳胶,胶体金,胶体硒等,以红色的胶体金最为常用.固相膜的特点在于其多孔性,像滤纸一样.固相膜可被液体穿过流出,液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行.利用这种性能建立了两种不同类型的快速检测方法.常用的固相膜为硝酸纤维素(nitrocellulose,NC)膜.一斑点酶免疫吸附试验斑点-ELISA(dot-ELISA)实验原理与常规的ELISA相同,不同之处在于斑点-ELISA所用载体为蛋白质具有极强吸附力(近100%)的硝酸纤维素(NC)膜,此外酶作用底物后形成有色的沉淀物,使NC染色实验方法为:加少量(1~2μl)抗原于膜上,由于NC膜吸附能力强,故需在干燥后进行封闭;然后滴加样品血清,其中的待检抗体即与NC膜上抗原结合;洗涤后再滴加酶标二抗,最后滴加能形成不溶有色物的底物溶液(如HRP标记物,常用二氨基联苯胺);阳性者即可在膜上出现肉眼可见的染色斑点.斑点-ELISA的优点为:NC膜吸附蛋白力强,微量抗原吸附完全,故检出灵敏度可较普通ELISA高6~8倍;试剂用量教ELISA节约约10倍;操作简单,实验及结果判断不需特殊设备条件;吸附抗原(抗体)或已有结果的NC膜可长期保存(-20℃可长达半年),不影响其活性.二免疫渗滤实验免疫渗滤实验(IFA)的基本原理是:一硝酸纤维素(NC)膜为载体,利用微孔滤膜的可滤过性,使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成.免疫渗滤实验最初是从斑点ELISA基础上发展建立起来的,应用的结合物是酶标记的.20世纪90年代初发展了以胶体金为标记物的金免疫渗滤实验(GIFA),省却了酶对底物的反应,更加简单,快速.渗滤装置是IFA中的主要试剂成分之一,由塑料小盒,吸水塑料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分著称.塑料小盒可以是多种形状的,盒盖的中央有一直径约为0.4~0.8cm的小圆吸孔,盒内垫放吸水塑料,NC膜片安放在正对盒盖的圆孔下,紧密关闭盒盖,是NC膜片贴紧水塑料.如此即制备成一渗滤装置.整个反应过程都在渗滤装置中进行,因此又常称位扁平长方形渗滤装置为反应板.以双抗体夹心HCG为例,于小孔内滴加标本1~2滴,待完全渗入.此时标本中的HCG 与NC膜上的抗βHCG相结合.再于小孔内滴加结合物试剂1~2滴,待完全渗入,金标记的抗αHCG抗体与NC膜上的HCG形成双抗体夹心复合物.因胶体金为红色,在NC 膜上出现红色斑点.在膜中央有清晰的淡红色或红色斑点显示者判断为阳性反应;反之,则为阴性反应,斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度.有将包被斑点由圆点式改成短线条式的:质控斑点横向包被成横线条,如"-"'反应斑点纵向包被成竖线条,如"│";两者相交成"+".这样,阳性反应结果在膜上显示红色的正号(+),阴性结果则为负号(-),目视判断直观,明了.三免疫层析实验免疫层析实验(ICA)是继IFA之后反站起来的另一种膜固相免疫测定.与IFA利用微孔膜的过滤性能不同,ICA中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用向另一端移动,犹如层析一般.移动过程中被分析物与固定于膜上某一区域的抗原或抗体结合而被固相化,无关物质则越过该区域而被分离,然后通过标记物的显色来判定实验结果.以胶体金为标记物的实验称为金免疫层析实验(GICA).ICA中所用的试剂全部为干试剂,它们被组合在一试剂条上.试剂条的底版为一单面胶塑料片,A,B两端粘贴有吸水材料.加样端A为样品垫,可用的材料有滤纸,多孔聚乙烯和玻璃纤维等,按分析物和试剂的不同选择合适的材料.B端为吸水垫,材料则为吸水性强的滤纸为佳.G处为结合物垫,胶体金结合物干燥固定在玻璃纤维膜等材料上.G,B之间粘贴吸附有抗原或抗体的硝酸纤维素膜,抗原或抗体往往以直线的形式包被在膜上.一双抗体夹心法测HCG为例.试条中G处为金标记的抗αHCG,NC膜上T处包被抗βHCG,C处包被抗小鼠IgG抗体.测试时在A端加尿液(或将A端浸入尿液中),通过层析做HCG-HCG复合物;移行至T区,形成金-抗α-HCG-HCG-抗βHCG复合物,在T区显示红色线条,为阳性反应.多余的金标记抗αHCG移行至C区时被抗小鼠IgG抗体捕获,而显示出红色对照线条.如尿液中不含HCG,在T区不出现红色线条,仅在C区出现红色线条,实验结果为阴性.如C区无红色线条出现,表示实验无效.双抗体夹心法⑷加底物显色.固相上的酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗原的量.双位点一步法操作步骤⑴将1个McAb与固相载体联结,形成固相McAb.洗涤除去未结合物.⑵同时加入待测标本和酶标McAb,孵育,使待检抗原和固相McAb及酶标McAb反应形成双抗体夹心复合物.洗涤除去未结合物.⑶加底物显色.间接法操作步骤⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原.洗涤除去未结合的抗原及杂质.⑵封闭:用高浓度无关蛋白封闭,阻止待检血清中非特异IgG吸附固相.⑶加待检血清,孵育,使固相抗原和待检抗体充分结合,洗涤除去未结合的非特异抗体及其他血清成分.⑷加酶标抗体或酶标SPA,孵育,形成固相抗原-待检抗体-酶标抗抗体(或酶标SPA)复合物.⑸加底物显色.双抗原夹心法操作步骤⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原.洗涤除去未结合物.⑵加入待检标本,孵育,使待检抗体和固相结合.洗涤除去未结合物.⑶加入酶标抗原,孵育,形成固相抗原-待检抗体-酶标抗原复合物.洗涤除去未结合物.⑷加底物显色.竞争法操作步骤⑴将已知抗体包被载体,形成固相抗体.洗涤除去未结合物.⑵加入待检标本和酶标抗原,孵育,使两者与固相抗体竞争结合.洗涤除去未结合到固相上的游离酶标抗原及其他未结合物.⑶加底物显色.颜色深浅与待测抗原量成反比.同理,也克用固相抗原和酶标抗体作试剂,使固相抗原和标本中的待检抗原竞争结合酶标抗体.待检抗原竞争抑制酶标抗体和固相抗原结合,即待检抗原越多,显色越浅.。
双抗体夹心法elisa原理
双抗体夹心法elisa原理小伙伴，今天咱们来唠唠这个双抗体夹心法ELISA的原理，可有趣啦。
ELISA呢，就是酶联免疫吸附测定的简称，这双抗体夹心法ELISA就像是一场抗体的“三明治”制作大赛。
你看啊，咱们要检测的那个东西，比如说某种抗原，就像是三明治中间那块美味的肉。
那抗体呢，就是面包片啦。
先来说说这个抗体。
在这个检测里，有两种抗体哦。
第一种抗体是被固定在检测板上的，就像把一片面包稳稳地放在盘子里一样。
这个检测板就像是一个特殊的舞台，抗体就站在上面等着抗原的到来。
这个固定的抗体有个特殊的本领，它能特异性地识别咱们要检测的抗原。
什么叫特异性识别呢？就好比一把钥匙开一把锁，这个抗体就只能和咱们要检测的那种抗原紧紧结合，对其他乱七八糟的东西可没兴趣。
当咱们把含有抗原的样本加到这个有固定抗体的检测板上的时候，就像是把肉放在了面包片上。
抗原就会和固定的抗体来个亲密接触，它们紧紧地抱在一起，这个过程就像是命中注定的相遇一样。
这时候，抗原就被固定在检测板上啦。
接下来呢，第二种抗体就该登场啦。
这第二种抗体也是针对咱们要检测的抗原的，它就像是另一片面包，要把抗原夹在中间。
这个抗体可自由啦，在溶液里游来游去，当它发现检测板上已经被固定住的抗原的时候，就会迅速地结合上去。
这就形成了抗体 - 抗原 - 抗体这样的一个“三明治”结构。
是不是超级酷？但是呢，这还没完事儿哦。
咱们怎么知道这个“三明治”已经做好了呢？这就需要一点小魔法啦，这个第二种抗体上面还连接着一种酶呢。
这个酶就像是一个小信号员，它可以催化一种化学反应。
当我们加入一种特殊的底物的时候，这个酶就开始工作啦。
在酶的催化下，底物会发生变化，这个变化我们是可以看到的。
比如说，会产生颜色变化，就像变魔术一样，从无色变成有色。
颜色的深浅就和抗原的量有关系啦。
如果抗原很多，那形成的“三明治”就多，酶催化底物产生的颜色就深；要是抗原少呢，“三明治”少，颜色就浅。
你看，这个双抗体夹心法ELISA就像是一场精心编排的小剧场。
ELISA双抗体夹心法检测癌胚抗原
操作步骤
（1）加样：依次加入6个标准品（0、5、10、20、 40、80ng/ml）、样品1、样品2，每孔100ul， 混匀；
★ OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高 吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。
癌胚抗原CEA
(1) CEA最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，故名癌胚抗原。 CEA升高常见于大肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、甲状腺髓 样癌等。但吸烟、妊娠期和心血管疾病、糖尿病、非特异性 结肠炎等疾病，15%～53%的病人血清CEA也会升高，所以CEA 不是恶性肿瘤的特异性标志，在诊断上只有辅助价值。
包被
将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。
蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质 分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种 物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影 响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更 易吸附到固相载体表面。
DEPARTMENT OF IMMUNOLOGY
ELISA双抗体夹心法检测癌胚抗原
操作步骤
（1）加样：依次加入6个标准品（0、5、10、20、 40、80ng/ml）、样品1、样品2，每孔100ul， 混匀；
（2）温育：37℃，30分钟； （3）洗板：弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，
静置10秒，甩干，重复4次后，拍干； （4）加酶：加入酶标抗体，每孔100ul，混匀； （5）温育：37℃，30分钟； （6）洗板：同步骤3 （7）显色：加入显色剂A、B，每孔各一滴，混匀，
ELISA的类型 ★ 双抗体夹心法 ★ 竞争法 ★ 间接法
双抗体夹心法
检测抗原最常用的方法
elisa双抗体夹心法实验报告
elisa双抗体夹心法实验报告Elisa双抗体夹心法实验报告引言：Elisa（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学实验技术，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
本实验旨在通过Elisa双抗体夹心法检测特定抗原的存在与浓度。
本文将详细介绍实验的步骤、原理和结果分析。
实验步骤：1. 准备样品：收集待测物质样品，如血清或细胞上清液，并进行必要的预处理，如离心、稀释等。
2. 涂布抗体：将特异性抗原抗体溶液均匀涂布在微孔板的孔底，使其吸附在固相上。
3. 阻断：加入适量的阻断剂（如牛血清蛋白）封闭孔底未被抗体吸附的部分，以防止非特异性结合。
4. 样品加入：将处理好的样品加入微孔板中，与固相上的抗体发生特异性结合。
5. 洗涤：用洗涤缓冲液多次洗涤微孔板，去除未结合的物质。
6. 检测抗体：加入与待测物质特异性结合的检测抗体，形成夹心复合物。
7. 二抗结合：加入与检测抗体结合的酶标记二抗，形成二抗-检测抗体-待测物质的三重夹心复合物。
8. 底物添加：加入底物溶液，使酶标记二抗催化底物发生显色反应。
9. 反应终止：加入反应终止液，停止底物的反应。
10. 读取结果：使用酶标仪测量吸光度值，根据标准曲线计算待测物质的浓度。
实验原理：Elisa双抗体夹心法基于特异性抗原抗体的结合反应，通过将待测物质夹在两个特异性抗体之间，实现对待测物质的定量检测。
该方法的关键在于使用两个不同特异性的抗体，一个用于固定在微孔板上，另一个用于检测抗体结合。
在实验过程中，首先将特异性抗原抗体固定在微孔板上，形成固相。
然后加入待测物质样品，样品中的特定抗原与固相上的抗体发生特异性结合。
接着，加入检测抗体，该抗体与待测物质上的特异抗原结合。
最后，加入酶标记的二抗，该二抗与检测抗体结合，形成夹心复合物。
通过加入底物和反应终止液，可以测量底物反应产生的吸光度值，从而计算待测物质的浓度。
结果分析：根据实验结果，通过测量吸光度值，可以得到待测物质的浓度。
ELISA双抗体夹心法
ELISA双抗体夹心法摘要：ELISA双抗体夹心法(enzyme linked immunosorbent assay——sandwich technique)的原理是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检血清中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。
以检测HbsAg为例。
找产品，上生物帮>> >>相关专题生物帮之抗体制备【原理】ELISA双抗体夹心法(enzyme linked immunosorbent assay——sandwich technique)的原理是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检血清中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。
以检测HbsAg为例。
【材料】酶标抗体(HRP-抗HBs-IgG)、抗HBs-IgG、待检血清包被液 pH9.5 0.05 mol/L CB稀释液 pH7.4 0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液底物液0.1 mol/L Na2HPO4(Na2HPO4·12H2O 35.8 g/L)5.14 ml，0.05 mol/L枸橼酸(10.5g/L)4.86 ml混匀，加入邻苯二胺(OPD)4 mg，置棕色小瓶中，临用时加30% H2O2 4.0μl，混匀。
终止液 2 mol/L H2SO4温箱、酶标反应板、酶标分光光度计【方法】1. 包被取包被液适当稀释的抗HBS-Ig 0.1 ml，加到聚苯乙烯反应板各孔中。
加盖，4℃ 24h。
次日用洗涤液充分洗涤3次，甩干。
2. 各孔内加不同稀释倍数的待检血清0.1 ml，同时加阳性和阴性对照血清，置43℃温箱60 min，移去液体。
同前法洗涤3次，甩干。
3. 各孔内加稀释HRP-抗HBs-IgG 0.1 ml，置43℃温箱60 min。
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ELISA双抗体夹心法
点击次数：320 作者：百奥迈科发表于：2009-03-13 16:18转载请注明来自丁香园
1、原理
ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
加入酶标记的抗原或抗体，通过反应也结合在固相载体上。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
2、特点
某些分泌型蛋白，用siRNA 干扰后可以用ELISA 进行检测。
3、ELISA 实验流程示图（以双抗体夹心法为例）
4、试剂与耗材
（1）包被缓冲液（pH 9.6 0.05 M 碳酸盐缓冲液）：
（2）洗涤缓冲液（pH 7.4，0.15 M PBS）：
（3）稀释液：
（4）终止液（2 M H2SO4）：
（5）底物缓冲液（pH 5.0）：
（6）四甲基联苯胺（TMB）使用液：
（7）2，2’-连氮基-双-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺（ABTS）使用液：
（8）抗原、抗体和酶标记抗体：按说明书处理。
（9）标准品：用稀释液稀释成梯度浓度溶液。
（10）96 孔聚苯乙烯塑料板（酶标板）。
2、实验步骤（双抗体夹心法）：
（1）包被：用包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1-10 μg/mL。
在酶标板反应孔中加0.1 mL，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。
（2）加样：加一定浓度稀释的待检样品（同时做空白对照，阴性对照孔及阳性对照）0.1 mL 于上述已包被的反应孔中，置湿盒中，37℃， 1 hr。
用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。
（3）加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。
37℃，0.5 - 1 hr，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。
（4）加底物液显色：于各反应孔中加入现配的TMB 底物溶液0.1 mL，37 ℃，10 - 30min。
（5）终止反应：于各反应孔中加入终止液0.05 mL。
（6）结果判定：将酶标板在酶标仪上，于450 nm （若ABTS 显色，读410 nm），读数，输出到Excel 中。
（7）以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，生成标准曲线和直线回归方程式，根据公式计算未知样品的浓度，并记录。