次乌头碱配伍甘草次酸抗心肌缺血及抗心衰的作用及机制研究

次乌头碱配伍甘草次酸抗心肌缺血及抗心衰的作用及机制研究目的研究附子的主要有效成分次乌头碱(Hypaconitine,HA)及甘草的主要有效成分甘草次酸(Glycyrrhetinic acid,GA)不同配伍比例在缺氧缺糖(Oxygen Glucose Deprivation,OGD)模型H9c2心肌细胞的作用及相关机制;并建立大鼠慢性心衰模型,观察HA配伍GA对慢性心衰大鼠的抗心衰的相关作用及机制研究。为探讨附子甘草配伍的基础理论提供依据,并为临床应用附子甘草配伍治疗心肌缺血及慢性心衰等心脏病提供实验依据。

方法(1)HA、GA及阳性对照药地高辛对H9c2心肌细胞的最适作用浓度范围的研究:使用MTT法测OD值,根据细胞存活率公式测得各药物的非细胞毒性浓度范围。(2)HA配伍GA对OGD模型下心肌细胞的抗炎及抗细胞凋亡作用的最佳配伍比例的研究:建立H9c2心肌细胞的OGD模型,分为正常组、模型组、地高辛组(80μmol·L-1)、HA 组及 HA+GA 组:1:0.5 组、1:1 组、1:2 组(HA 为 120μmol·L-1,GA 分别为 60、120、240μmol·L-1),作用4h;观察各组H9c2心肌细胞形态学的变化情况,并应用ELISA法检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β及CK的含量并应用Western Blot法测定心肌细胞caspase-3、Fas及Fas-L蛋白的表达情况。

(3)HA与GA的最佳配伍比例对OGD模型下H9c2心肌细胞的抗心肌细胞凋亡的作用及机制研究:实验分为模型组,HA组、GA组、HA+GA组、LY294002(LY)组,HA+GA+LY 组(HA 为 120μmol·L-1,GA 为120μmol·L-1,LY 为10μmol·L-1),作用 4h;再应用Hoechst33342染色于荧光显微镜下观察各组细胞的形态变化,应用透射电镜观察细胞的超微结构变化情况,应用ELISA法检测细胞培养上清液中的LDH、CK-MB及AST的含量变化,应用流式细胞仪检测细胞早期凋

亡率,并应用WestemBlot法检测Akt、p-Akt、caspase-9、Bax及Bcl-2蛋白水平的含量变化。(4)HA配伍GA对慢性心衰大鼠的心肌细胞凋亡信号通路的影响的研究:建立大鼠慢性心衰模型,随机分为假手术(Sham)组、模型(Model)组、地高辛(Digoxin)组、HA组、GA 组、HA+GA 组(HA 为 2.07mg/kg,GA 为 25mg/kg,地高辛为 lmg/kg);每日灌胃给药1次,一周后,观察大鼠一般情况改变,计算死亡率,应用心脏超声检测EF、FS等参数;应用电子秤测大鼠体重及心脏重量;应用ELISA法检测血清BNP及cTnI的含量变化;应用免疫组织化学法检测心肌组织的Bax、Bcl-2及caspase-3表达的变化情况;并应用Western Blot法测定大鼠心肌组织的Bax、Bcl-2及caspase-3蛋白表达的情况。

结果(1)MTT实验结果显示:HA、GA及地高辛的非细胞毒性浓度范围分别为0-120μmol·L-1、0-240μmol·L-1 及 0-80μmol·L-1。(2)HA配伍GA不同比例对H9c2心肌细胞的作用结果:细胞形态学以配伍组(1:1)改善最明显;同时配伍组(1:1)明显减少TNF-α、IL-1β及CK的含量;并且配伍组(1:1)极显著性地减少caspase-3、Fas及Fas-L蛋白表达。

(3)HA配伍GA(1:1)对OGD心肌细胞的作用结果:Hoechst33342染色显示配伍组较其它各组更明显地改善细胞核及染色质形态;透射电镜显示配伍组显著改善细胞膜,线粒体肿胀及细胞核、染色质浓缩等现象;上清液的LDH、CK-MB及AST 含量变化,显示HA+GA配伍组明显减少其释放量;流式细胞仪检测结果显示HA+GA 配伍组能显著降低细胞早期凋亡率;Western Blot法检测结果显示,p-Akt/Akt 比值在HA+GA+LY组较HA+GA组显著下降;caspase-9及Bax含量在HA+GA+LY组较HA+GA组明显升高;Bcl-2蛋白含量在HA+GA+LY组较HA+GA组显著下降。(4)HA+GA组大鼠的一般情况改善最多,大鼠死亡率为15.56%;HA+GA组显著性降

低H/B比值;心脏超声结果显示HA+GA组可显著改善大鼠的心脏左心室重构的现象;配伍组显著降低血清BNP及cTnI的水平;免疫组织化学染色法及Western Blot法检查结果均显示HA+GA组明显降低Bax及caspase-3蛋白的表达情况,同时显著升高Bcl-2蛋白的表达及Bcl-2/Bax比值。

结论(1)附子与甘草的主要有效成分HA配伍GA作用于H9c2心肌细胞的最佳比例为(1:1)。(2)附子甘草的主要有效成分HA及GA配伍对H9c2心肌细胞的OGD 损伤有保护作用,其作用机制可能与抗炎和抗凋亡途径有关。

(3)附子与甘草的主要有效成分HA及GA配伍对OGD模型下的H9c2心肌细胞可产生保护作用;其保护作用机制与PI3K/Akt信号通路有关。(4)附子与甘草的主要有效成分HA及GA配伍可有效地改善慢性心衰过程中的心肌肥厚、心肌重构及心功能减弱等状态,其作用机制可能与抑制心肌细胞的凋亡有关。