分子克隆技术实验指导

分子克隆技术

DNA重组技术是在分子水平对基因进行体外操作，因而也称为分子克隆（Molecular Cloning）或基因克隆，是在体外对DNA分子按照既定的目的进行人工重组，并导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA 分子大量复制，并使受体细胞获得新的遗传特征的过程。

其基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）经过特定限制性酶切割以及与目标载体连接，组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将这种质粒（重组质粒）转入大肠杆菌体内，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质，并且来源于一个菌株的质粒是一个分子克隆，而随质粒复制出的外源基因也就是一个分子克隆。

分子克隆技术的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。

实验前准备

实验开始前，需准备好所需的试剂，如PCR扩增及酶切，连接所需酶类试剂及相应的buffer，均为TaKaRa产品分装，Buffer、dNTP、引物试剂等需要从-20℃取出至室温融化、涡旋震荡混匀离心后使用，酶类试剂从-20℃取出瞬时离心（小于4000 rpm）放置冰浴中备用。

还有各项实验所需的药品（如琼脂糖），以及配置好培养基，抽提质粒用的溶液一、二、三等试剂。

本次实验所涉及的常规仪器及耗材有：Thermo Scientific Arktik PCR仪，水平电泳槽，超净工作台，恒温水浴锅，紫外照胶仪，赛默飞公司提供的F1，F2和F3一系列量程的单道移液器等仪器，1.5ml离心管，玻璃试管，赛默飞公司提供的QSP盒装吸头及15ml离心管等。

接下来进入实验部分，本实验操作流程为：首先在GenBank中查询目的基因序列，然后根据得到的序列进行酶切位点分析及引物的设计，通过RT-PCR获取目的基因，酶切以及与载体连接，转化进入宿主菌中，针对得到的菌落进行菌落PCR快速筛选，得到初步的阳性克隆，最后通过质粒提取及鉴定，得到的阳

性克隆，测序分析及得到正确的重组质粒。

GenBank查询目的基因序列

打开NCBI主页，在搜索栏中输入β-Actin的登录号NM_007393，点击search。选择核酸数据库，进入搜索结果界面，可见β-Actin的相关信息。在CDS选项中，找到编码区所在位置，β-Actin的CDS位点为80-1207，点击复制编码序列，并保存为.seq格式。

根据CDS序列设计引物

打开DNAstar的MapDraw软件，点击File，下拉菜单中打开CDS.seq，点击ok后可见CDS的酶切位点。点击工具栏中的Map，选择Absent Sites，可见该片段所缺少的酶切位点。结合本次实验所用载体pET-28α的图谱分析，确定上游引物的酶切位点为Bam HⅠ，下游引物的酶切位点为Hin dⅢ。

打开Primer Premier5软件，点击File，选择New，DNA Sequence。在弹出的Gene Tank窗口中，粘贴入β-Actin的基因全长序列，选择As is，ok确定.

点击Primer进入Primer Premier窗口，点击Search，在Search Criteria窗口选择PCR Primer，search type选项中选择Pairs。还可以设定搜索区域及产物长度。由于CDS的位置是80-1027，上游引物搜素区域为1-80bp；下游则为1027-1885bp；产物长度为900-1300bp；引物长度一般为18-30bp，无需修改。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，设置完毕后，点击ok开始搜索引物。

搜索结束后，在Search Progress窗口点击ok。弹出Search Result窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序。点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。

选择评分最高的引物，简单查看一下引物情况，避免出现一下情况：3’不要出现连续3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配；T m 应该在55～70度之间，上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好；GC％应该在45％～55％间。

选中上游引物，点击Edit Primer。在引物编辑窗口的编辑栏中，5’端添加入

Bam HⅠ的序列（GGATCC）,点击Analysis.根据结果添加合适的保护碱基。再次分析后，点击Primer。如符合条件，点击OK，将编辑好的引物输送到序列上。

同样的方法设置下游引物，在编辑栏中5’端添加入Hin dⅢ的序列（AAGCTT）和保护碱基，注意：此时应该从3’端到5’端输入序列。分析好各种参数后，点击OK，接受引物。

最后在Primer Primer窗口查看该对引物的各种参数，可用BLAST将设计好的引物与β-Actin序列进行比对分析。如果新引物参数不够理想，可重新选择符合条件的另一对引物进行编辑及分析。

引物确定后，进行Blast分析，一般来说，都会找到一些其他基因的同源序列，此时，只要没有交叉的其他基因的同源序列即可。

RT-PCR获取目的基因

设计好引物后，通过RT-PCR钓取目的基因

首先配制PCR体系，在PCR管中加入2μl 10× Taq buffer、1.2μl的25mM MgCl2、0.2μl 10mM dNTP、上下游引物各0.3μl、0.3μl Taq酶，经过反转录获得的cDNA 模板2μl，最后加RNA酶纯水调整至20μl。

短暂混匀后，瞬时离心将所有溶液收集到管底。

PCR反应是使用Thermo Scientific Arktik PCR仪进行扩增反应，PCR仪程序设置为95°C预变性5 min，95°C变性30s，55°C退火40s，然后72°C延伸30s ，72°C 2min, 扩增循环数为28个循环，最后在12 °C保温。

注意，每对引物的退火温度不一样，实验前需进行反应条件的优化。延伸时间需根据产物长度及Taq酶的扩增效率决定时间的长短。

程序设定好后，放入PCR管，盖上热盖，旋紧旋钮，点击run按钮，选择设定好的程序，按START开始运行。

扩增结束后，取出PCR管，扩增产物于1%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测

琼脂糖凝胶电泳

制备1%琼脂糖凝胶，在锥形瓶中加入0.3g的琼脂糖和30ml的TAE缓冲液，加热时应盖上封口膜或保鲜膜，以减少水份蒸发，微波炉加热至琼脂糖全部融化。