分子克隆技术实验指导

分子克隆技术DNA重组技术是在分子水平对基因进行体外操作，因而也称为分子克隆（Molecular Cloning）或基因克隆，是在体外对DNA分子按照既定的目的进行人工重组，并导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA 分子大量复制，并使受体细胞获得新的遗传特征的过程。

其基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）经过特定限制性酶切割以及与目标载体连接，组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将这种质粒（重组质粒）转入大肠杆菌体内，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质，并且来源于一个菌株的质粒是一个分子克隆，而随质粒复制出的外源基因也就是一个分子克隆。

分子克隆技术的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。

实验前准备实验开始前，需准备好所需的试剂，如PCR扩增及酶切，连接所需酶类试剂及相应的buffer，均为TaKaRa产品分装，Buffer、dNTP、引物试剂等需要从-20℃取出至室温融化、涡旋震荡混匀离心后使用，酶类试剂从-20℃取出瞬时离心（小于4000 rpm）放置冰浴中备用。

还有各项实验所需的药品（如琼脂糖），以及配置好培养基，抽提质粒用的溶液一、二、三等试剂。

本次实验所涉及的常规仪器及耗材有：Thermo Scientific Arktik PCR仪，水平电泳槽，超净工作台，恒温水浴锅，紫外照胶仪，赛默飞公司提供的F1，F2和F3一系列量程的单道移液器等仪器，1.5ml离心管，玻璃试管，赛默飞公司提供的QSP盒装吸头及15ml离心管等。

接下来进入实验部分，本实验操作流程为：首先在GenBank中查询目的基因序列，然后根据得到的序列进行酶切位点分析及引物的设计，通过RT-PCR获取目的基因，酶切以及与载体连接，转化进入宿主菌中，针对得到的菌落进行菌落PCR快速筛选，得到初步的阳性克隆，最后通过质粒提取及鉴定，得到的阳性克隆，测序分析及得到正确的重组质粒。

GenBank查询目的基因序列打开NCBI主页，在搜索栏中输入β-Actin的登录号NM_007393，点击search。

选择核酸数据库，进入搜索结果界面，可见β-Actin的相关信息。

在CDS选项中，找到编码区所在位置，β-Actin的CDS位点为80-1207，点击复制编码序列，并保存为.seq格式。

根据CDS序列设计引物打开DNAstar的MapDraw软件，点击File，下拉菜单中打开CDS.seq，点击ok后可见CDS的酶切位点。

点击工具栏中的Map，选择Absent Sites，可见该片段所缺少的酶切位点。

结合本次实验所用载体pET-28α的图谱分析，确定上游引物的酶切位点为Bam HⅠ，下游引物的酶切位点为Hin dⅢ。

打开Primer Premier5软件，点击File，选择New，DNA Sequence。

在弹出的Gene Tank窗口中，粘贴入β-Actin的基因全长序列，选择As is，ok确定.点击Primer进入Primer Premier窗口，点击Search，在Search Criteria窗口选择PCR Primer，search type选项中选择Pairs。

还可以设定搜索区域及产物长度。

由于CDS的位置是80-1027，上游引物搜素区域为1-80bp；下游则为1027-1885bp；产物长度为900-1300bp；引物长度一般为18-30bp，无需修改。

在Search Parameters里面，可以设定相应参数。

一般若无特殊需要，参数选择默认即可，设置完毕后，点击ok开始搜索引物。

搜索结束后，在Search Progress窗口点击ok。

弹出Search Result窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序。

点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。

选择评分最高的引物，简单查看一下引物情况，避免出现一下情况：3’不要出现连续3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配；T m 应该在55～70度之间，上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好；GC％应该在45％～55％间。

选中上游引物，点击Edit Primer。

在引物编辑窗口的编辑栏中，5’端添加入Bam HⅠ的序列（GGATCC）,点击Analysis.根据结果添加合适的保护碱基。

再次分析后，点击Primer。

如符合条件，点击OK，将编辑好的引物输送到序列上。

同样的方法设置下游引物，在编辑栏中5’端添加入Hin dⅢ的序列（AAGCTT）和保护碱基，注意：此时应该从3’端到5’端输入序列。

分析好各种参数后，点击OK，接受引物。

最后在Primer Primer窗口查看该对引物的各种参数，可用BLAST将设计好的引物与β-Actin序列进行比对分析。

如果新引物参数不够理想，可重新选择符合条件的另一对引物进行编辑及分析。

引物确定后，进行Blast分析，一般来说，都会找到一些其他基因的同源序列，此时，只要没有交叉的其他基因的同源序列即可。

RT-PCR获取目的基因设计好引物后，通过RT-PCR钓取目的基因首先配制PCR体系，在PCR管中加入2μl 10× Taq buffer、1.2μl的25mM MgCl2、0.2μl 10mM dNTP、上下游引物各0.3μl、0.3μl Taq酶，经过反转录获得的cDNA 模板2μl，最后加RNA酶纯水调整至20μl。

短暂混匀后，瞬时离心将所有溶液收集到管底。

PCR反应是使用Thermo Scientific Arktik PCR仪进行扩增反应，PCR仪程序设置为95°C预变性5 min，95°C变性30s，55°C退火40s，然后72°C延伸30s ，72°C 2min, 扩增循环数为28个循环，最后在12 °C保温。

注意，每对引物的退火温度不一样，实验前需进行反应条件的优化。

延伸时间需根据产物长度及Taq酶的扩增效率决定时间的长短。

程序设定好后，放入PCR管，盖上热盖，旋紧旋钮，点击run按钮，选择设定好的程序，按START开始运行。

扩增结束后，取出PCR管，扩增产物于1%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测琼脂糖凝胶电泳制备1%琼脂糖凝胶，在锥形瓶中加入0.3g的琼脂糖和30ml的TAE缓冲液，加热时应盖上封口膜或保鲜膜，以减少水份蒸发，微波炉加热至琼脂糖全部融化。

待混合物冷却至50-60℃时，将其倒入胶槽中。

待凝胶凝固后，轻轻拔去梳子，将胶放入电泳槽中，并倒入适量的TAE缓冲液。

假如适量的6× Loading Buffer，混匀后即可上样。

分别将样品全部加到上样孔中，并点上2μl marker。

注意：上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

加样完成后，盖上电泳槽盖，90V恒压电泳，指示剂迁移至凝胶的2/3处，即可停止电泳。

取出凝胶，置于EB中浸泡20min后凝胶扫描仪下查看电泳结果。

胶回收及DNA的纯化在紫外下，将特异电泳带用刀尽可能切下放入到1.5ml的离心管中，称琼脂糖带的重量。

在含琼脂糖带的离心管中分别加入相应比例体积的Buffer GM，于55到65℃水浴中温浴，每2-3 min摇动混合物至凝胶完全融化，将离心柱装在收集管内，把获得的DNA熔胶液全部转移至离心柱中，静置1min，12000rpm室温离心2min，弃收集管中的滤液，将离心柱套回收集管内。

若DNA凝胶溶液体积超过700μl，重复以上操作，将剩余DNA凝胶溶液转移到离心柱中。

弃收集管中的滤液，将离心柱套回收集管内。

加700μl已含无水乙醇的Buffer WB至离心柱中。

12000rpm室温离心2min。

注意：Buffer WB在使用之前必须确定是否已加入合适比例的无水乙醇。

重复用700μl Buffer WB洗涤离心柱一次。

最后弃收集管中的滤液后重新将离心柱放回收集管内。

室温下,12000rpm离心2 min以除去离心柱基质上残余的液体。

把离心柱装在一个干凈的1.5ml离心管上，加入30μl的Elution Buffer到柱基质上，室温放置1min, 12000rpm离心1min以洗脱DNA。

回收得到的DNA 溶液放在-20℃保存或直接进行下一步的酶切。

酶切目的基因和载体酶切前确定待切样品的浓度, 并选择合适的限制性内切酶和配套Buffer。

在扩增产物组标记为T，载体组标记为C的PCR管中加入如下成分：2μl 10x 酶切缓冲液，6μl的蒸馏水，Bam HⅠ和Hin d Ⅲ各1μl。

T组加入PCR扩增产物10μl，C组加入10μl pET-28α载体10μl。

混匀后，用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底，37°C酶切3-4h，酶切结束后，65°C保温5-10min以终止酶切及防止DNA末端退火，取出后置冰浴骤冷，酶切产物可直接进行连接反应。

目的基因和载体连接反应连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。

在实验组标记为T的PCR管中加入4μl DNA酶切产物，1.5μl pET-28a载体，1μl 10x T4连接buffer，0.5μl T4 DNA连接酶，加水补足到10μl。

在阴性对照组标记为C的PCR管中加入1.5μl pET-28α载体，1μl 10x T4连接Buffer，0.5μl T4 DNA连接酶，加水补足到10μl。

对于有效的连接体系来说合适的载体和目的基因分子数比值控制在一定范围内是有必要的，这个比值为1：3-1：10，较大的片段可适当提高比值。

连接时，PCR产物浓度可以尽可能的大，轻混反应物，并在16℃连接12-16h，也可以置于4℃连接过夜。

转化及筛选转化前，需进行大肠杆菌感受态细胞的制备接种10μl大肠杆菌DH5α甘油菌至含有2ml LB液体培养基的试管中，37℃每分钟180-200rpm振荡培养过夜。

以1%的接种量将甘油菌种20μl接种到2ml LB 培养基中，37℃振荡培养，使菌液OD 600达到0.3～0.4，此过程大约需要3h。

菌液在4°C条件下，以5000rpm离心2min，回收菌体；在超净工作台里用枪头小心移去上清，将菌体重新悬浮于400μl预冷的0.1M CaCl2溶液，重悬时操作要轻，加入适量无菌甘油，混匀，冰浴放置20min，分装制备得到的感受态置于-80°C储存备用，也可将感受态置于冰上12-24h后，可以直接进行转化。

整个操作中细胞保持在冰冷的状态。