白色念珠菌菌液制备
体外抑菌实验方案
体外抑菌实验方案一、实验目的1.探究不同抑菌剂对特定细菌的抑制效果。
2.优化抑菌剂的配方，提高抑菌效率。
3.为临床应用提供理论依据。
二、实验材料1.实验菌株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌等。
2.抑菌剂：酒精、碘伏、过氧化氢等。
3.实验器材：培养皿、移液器、酒精灯、生物安全柜等。
三、实验方法1.菌株活化：将实验菌株从冻存管中取出，接种至斜面培养基，37℃培养24小时。
2.制备菌液：将活化后的菌株用无菌生理盐水洗涤，调整菌液浓度为10^6CFU/mL。
3.抑菌剂配制：按照实验设计，配制不同浓度和配比的抑菌剂。
4.抑菌实验：在生物安全柜中，将菌液均匀涂布于培养皿，加入不同抑菌剂，置于37℃培养箱培养24小时。
5.观察结果：观察各培养皿中细菌生长情况，记录抑菌效果。
6.数据处理：统计分析各抑菌剂的抑菌效果，计算抑菌率。
四、实验步骤1.活化菌株：从冰箱取出金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌等菌株，接种至斜面培养基，放入37℃培养箱培养24小时。
2.制备菌液：将活化后的菌株用无菌生理盐水洗涤，调整菌液浓度为10^6CFU/mL。
3.配制抑菌剂：按照实验设计，配制酒精、碘伏、过氧化氢等抑菌剂的不同浓度和配比。
4.抑菌实验：在生物安全柜中，将菌液均匀涂布于培养皿，加入不同抑菌剂，放入37℃培养箱培养24小时。
5.观察结果：观察各培养皿中细菌生长情况，记录抑菌效果。
6.数据处理：统计分析各抑菌剂的抑菌效果，计算抑菌率。
五、实验结果1.不同抑菌剂对金黄色葡萄球菌的抑制效果：酒精浓度为75%时，抑菌效果最佳，抑菌率为99.99%；碘伏浓度为5%时，抑菌率为99.95%。
2.不同抑菌剂对大肠杆菌的抑制效果：过氧化氢浓度为3%时，抑菌效果最佳，抑菌率为99.99%；酒精浓度为75%时，抑菌率为99.90%。
3.不同抑菌剂对白色念珠菌的抑制效果：碘伏浓度为5%时，抑菌效果最佳，抑菌率为99.99%；过氧化氢浓度为3%时，抑菌率为99.95%。
霉菌计数用培养基的适用性检查
霉菌计数用培养基的适用性检查
1. 菌液制备
接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基上，培养24～48小时。
上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养5～7天，加入3～5ml含0.05﹪（ml／ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱。
然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05﹪（ml／ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu 的孢子悬液。
2．适用性检查
取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数。
同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
3、检查结果
霉菌培养温度____℃ 5天培养时间：
检验标准：被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。
判该培养基的适用性检查符合规定。
4结论：
按《中华人民共和国药典2010年版（二部）》附录微生物限度检查法计数培养基的适用性检查，结果_______________。
检验人：复核。
霉菌与酵母菌计数方法(2015版药典)
霉菌与酵母菌计数方法1试验菌液得制备与使用(以白色念珠菌为示例)白色念珠菌(0)代↓传代培养↓实验菌液得制备:沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基,培养温度20～２5℃,培养时间2~3天↓计数培养基适用性检查:胰酪大豆胨琼脂培养基,培养温度３0～3５℃,培养时间不超过5天,接种量不大于10０cｆu↓计数方法适用性试验:胰酪大豆胨琼脂培养基(ＭPＮ法不适用),培养温度３０～３5℃,培养时间不超过５天,接种量不大于10０cfu 注:当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌与酵母菌总数时,应进行培养基适用性检查,检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基1.１菌种试验用菌株得传代次数不得超过５代(从菌种保藏中心获得得干燥菌种为第0代),并采用适宜得菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株得生物学特性。
1。
2菌液制备(按表1规定程序培养各试验菌株)取白色念珠菌得新鲜培养物↓用pH7、0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得菌悬液取黑曲霉得新鲜培养物↓加入3～５ｍｌ含0.０５%聚山梨酯80得pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱↓采用适宜得方法吸出孢子悬液至无菌试管内↓用含0。
05％聚山梨酯80得pＨ7.０无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0。
９%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得黑曲霉孢子悬液菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在２~8℃,可在24小时内使用、稳定得黑曲霉孢子悬液可保存在2~８℃,在验证过得贮存期内使用、1。
３阴性对照为确认试验条件就是否符合要求,应进行阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长。
如阴性对照有菌生长,应进行偏差调查、2、培养基适用性检查按表1规定,接种不大于100cｆu得菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板↓置表１规定条件下培养↓每一试验菌株平行制备2管或2个平皿↓同时,用相应得对照培养基替代被检培养基进行上述试验↓被检固体培养基上得菌落平均数与对照培养基上得菌落平均数得比值应在0。
白色念珠菌与抑菌效力检查方法
表
类别
产品分类
药品
1 类 注射剂、其他非肠道制剂，包括乳剂、 注射剂、其他非肠道制剂，包括乳剂、 制剂、 耳用 制剂、无菌鼻用制剂及眼用制剂 2 类 局部给药制剂、非灭菌鼻用制剂及用于 局部给药制剂、 黏膜的乳剂 3类 口服非固体制剂（非抗酸制剂） 口服非固体制剂（非抗酸制剂） 4类 非固体抗酸制剂
抑菌剂效力测定 概述 1、抑菌剂效力检查法系用于测定灭菌、 、抑菌剂效力检查法系用于测定灭菌、 非灭菌制剂中抑菌剂的活性， 非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以评价最终 产品的抑菌效力， 产品的抑菌效力，同时也可用于指导生产 企业在制剂研发阶段抑菌剂的确定。 企业在制剂研发阶段抑菌剂的确定。 2、如果药物本身不含有充分的抗菌活性， 、如果药物本身不含有充分的抗菌活性， 那么应根据制剂特性（如水溶液制剂） 那么应根据制剂特性（如水溶液制剂）添 加适宜的抑菌剂， 加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常储存 和使用过程中可能发生微生物污染和大量 繁殖尤其多剂量包装的制剂， 繁殖尤其多剂量包装的制剂，避免因药物 微生物污染及对患者造成伤害。 微生物污染及对患者造成伤害。
2、如平板上生长的菌落与上述菌落形态特 、 征相符或疑似，应挑选2～ 个菌落分别接 征相符或疑似，应挑选 ～3个菌落分别接 种至念珠菌显色培养基平板上，培养24～ 种至念珠菌显色培养基平板上，培养 ～ 48小时（必要时延长至 小时）。若平 小时（ 小时）。 小时 必要时延长至72小时）。若平 板上无绿色或翠绿色的菌落生长， 板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试 品未检出白色念珠菌。 品未检出白色念珠菌。 3、若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色， 、若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色， 挑取相符或疑似的菌落接种于1%吐温 吐温80 挑取相符或疑似的菌落接种于 吐温 玉米琼脂培养基上，培养24～ 小时 小时。 玉米琼脂培养基上，培养 ～48小时。 取培养物进行染色，镜检及芽管试验。 取培养物进行染色，镜检及芽管试验。
白色念珠菌原生质体制备
白色念珠菌原生质体制备
白色念珠菌是一种常见的真菌，对人类健康产生了重要的影响。
为了研究白色念珠菌的基因组，需要制备白色念珠菌的原生质体。
本文介绍了一种简单有效的制备白色念珠菌原生质体的方法。
首先，采集白色念珠菌的新鲜菌丝，放入含有0.7 mol/L山梨酸钾(pH 5.5)的离心管中。
将离心管放入液氮中冷冻10 min，然后在37℃水浴中加热2 min。
重复以上步骤3次，然后将离心管转移到冰上。
接下来，用20%聚乙二醇4000(pH 8.0)缓慢滴加到离心管中，轻轻摇动2 min，然后离心10 min(12000 rpm)。
将上清转移到一个新的离心管中，加入等体积的丙酮，混合均匀后离心10 min(12000 rpm)。
将上清丢弃，沉淀用干燥的滤纸吸干，即为制备好的白色念珠菌原生质体。
通过上述方法制备的白色念珠菌原生质体可以用于进一步的基
因克隆、基因转染等实验。
这种方法操作简单，成本低廉，适用于实验室中大规模制备原生质体。
- 1 -。
15版20版药典无菌检查法对比
1. 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器械
——
料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
2. 单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒 单向流空气区、工作台面及受控环境应定期按医药工业洁净室
13. 0.1%无菌蛋白胨水溶液取蛋白胨 1.0g，加水 1000ml，微温溶解，滤清， 0.1%无菌蛋白胨水溶液取蛋白胨 1.0g，加水 1000ml，微温溶解，
——
调节 pH 值至 7.1±0.2，分装，灭菌。
必要时滤过使澄清滤清，调节 pH 值至 7.1±0.2，分装，灭菌。
14. pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾 3.56g，无水磷酸氢二钠 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾 3.56g，无水磷酸
——
5.77g，氯化钠 4.30g，蛋白胨 1.00g，加水 1000ml，微温溶解，滤清， 氢二钠 5.77g，氯化钠 4.30g，蛋白胨 1.00g，加水 1000ml，微
分装，灭菌。
温溶解， 必要时滤过使澄清滤清，分装，灭菌。
15. 根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲 根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、
冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于 100cfu 的试验菌，过滤。加硫 品总量， 按采用薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中 多大的改进，可操作性不
乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基至滤筒内。另取一装有同 加入小于不大于 100cfu 的试验菌，过滤。加硫乙醇酸盐流体培养 强。在最后一次冲洗液中
白色念珠菌原生质体制备
白色念珠菌原生质体制备
白色念珠菌的原生质体制备可以通过以下步骤实现：
1. 准备白色念珠菌的培养物，并在对数生长期收集细胞。
通常选择光密度（OD）为0.6至1之间的培养物。
2. 将细胞离心，并用冷洗涤缓冲液（例如10mM Tris-HCl pH 7.5，1mM EDTA，0.5M蔗糖）悬浮。
3. 加入蛋白酶抑制剂（例如PMSF），并在冰上振荡30分钟以使细胞壁破裂。
4. 转移混合物到新离心管中，并在低速离心下离心10分钟以除去残留的细胞碎片和细胞核。
5. 将上清液转移到高速离心管中，并在12,000×g的离心下离心20分钟，沉淀出原生质体。
6. 将原生质体沉淀重悬于适当的缓冲液中（例如10mM Tris-HCl pH
7.5，1mM EDTA）。
这些步骤将使您能够制备白色念珠菌的原生质体，供进一步实验使用。
2010版中国药典微生物限度检查法增补本适用培养基
2010版中国药典微生物限度检查法增补本适用培养基2010版2010增补本供试品制备M0008B-pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液M0911B-pH6.8磷酸盐缓冲液M0912B-pH7.6磷酸盐缓冲液M0008B-pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液M0001B-胰酪胨大豆肉汤M0911B-pH6.8磷酸盐缓冲液M0912B-pH7.6磷酸盐缓冲液细菌菌液制备M0005B-营养肉汤M0006B-营养琼脂0.9%无菌氯化钠溶液M0001B-胰酪胨大豆肉汤M0002B-胰酪胨大豆琼脂M0008B-pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液0.9%无菌氯化钠溶液白色念珠菌菌液制备M4101B-改良马丁培养基M4102B-改良马丁琼脂培养基0.9%无菌氯化钠溶液含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液M4109B-沙氏萄萄糖肉汤(SDB)M4108B-沙氏葡萄糖琼脂(SDA)M0008B-pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液0.9%无菌氯化钠溶液霉菌菌液制备M4102B-改良马丁琼脂培养基含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液M4108B-沙氏葡萄糖琼脂(SDA)M4110B-马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）M0076B-含0.05%聚山梨酯80的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液生孢梭菌菌液制备M5601B-硫乙醇酸盐流体培养基(FT)0.9%无菌氯化钠溶液M5604B-梭菌增菌培养基M0008B-pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液微生物计数法(细菌、霉菌及酵母菌计数) M0006B-营养琼脂（细菌）M4103B-玫瑰红钠琼脂(霉菌及酵母菌)M4101B-酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)(酵母菌)M0002B-胰酪胨大豆琼脂（需氧菌）M0001B-胰酪胨大豆肉汤（需氧菌-MPN法）M4108B-沙氏葡萄糖琼脂(SDA) (霉菌和酵母菌)M4182B-沙氏葡萄糖琼脂(含抗生素) (用于霉菌和酵母菌)M4103B-玫瑰红钠琼脂（用于霉菌和酵母菌）耐胆盐革兰氏阴性菌无M2007B-肠道菌增菌肉汤M2005B-紫红胆盐葡萄糖琼脂大肠埃希氏菌M1002B-乳糖胆盐发酵培养基M1003B-曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)M1004B-麦康凯琼脂培养基(MacC)M1006B-乳糖发酵培养基M2013B-麦康凯肉汤M2012B-麦康凯琼脂沙门氏菌M2002B-四硫磺酸钠亮绿培养基(TTB)基础M2004B-胆盐硫乳琼脂培养基(DHL)M2003B-沙门、志贺菌属琼脂培养基(SS)M1003B-曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)M1004B-麦康凯琼脂培养基(MacC)M0009B-三糖铁琼脂培养基(TSI)M2015B-RV沙氏增菌肉汤M2010B-木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂(XLD)M0009B-三糖铁琼脂培养基(TSI)铜绿假单胞菌M1001B-胆盐乳糖培养基(BL)M3001B-溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基M0006B-营养琼脂M3002B-绿脓菌素测定用培养基(PDP)基础(添加S0502)T010-氧化酶试纸M3003B-溴十六烷三甲铵琼脂基础（添加S0502）T010-氧化酶试纸金黄色葡萄球菌M0005B-营养肉汤(NB)S3401-亚碲酸钾溶液M3401B-卵黄氯化钠琼脂培养基基础(添加S3402)M3402B-甘露醇氯化钠琼脂M0006B-营养琼脂M3402B-甘露醇氯化钠琼脂M0006B-营养琼脂梭菌M5604B-梭菌增菌培养基M5602B-哥伦比亚琼脂培养基基础（添加S5601）T040-3%过氧化氢溶液M5604B-梭菌增菌培养基M5602B-哥伦比亚琼脂培养基基础（添加S5601）T040-3%过氧化氢溶液白色念珠菌M4105B-沙氏葡萄糖液体培养基M4106B-沙氏葡萄糖琼脂培养基M2509A-念珠菌显色培养基M4107A-1%吐温80-玉米琼脂培养基基础（添加S4101）M4109B-沙氏萄萄糖肉汤(SDB)M4108B-沙氏葡萄糖琼脂(SDA)M2509A-念珠菌显色培养基。
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验
首先用吸管吸取少许稀释后的单细胞悬液，从盖片 端滴一小滴（不宜过多），液体自行向内渗入，静置数 分钟后，再放在微镜下观察计数。
温育30min。
取1滴混合液置玻片上加盖玻片，在高倍镜下观察 计数。
高倍镜下观察计算： 吞噬率％=(吞噬白色念珠菌的巨噬细胞数/100个巨噬
细胞)×100％
吞噬指数％=100个巨噬细胞中吞噬白色念珠菌总数 /100个巨噬细胞
**(吞噬指数式中巨噬细胞为阳性吞噬细胞)
注意事项
1、菌与细胞混合后充分混匀非常重要。对于此实验，菌 与吞噬细胞之比10：1时吞噬作用容易观察和计数。但 是吞噬效果好，能真正反映实际情况又可被检测的比 例为1：1。
计数时，若细胞位于小方格的线上，应遵循“数上 线不数下线，数左线不数右线”的原则，以减少误差。 计数应重复3次，取其平均值。
数完毕后，依下式计算： 每1mL白细胞悬液细胞数＝（4个中方格细胞总数 /4） ×104× 稀释倍数
每1mL红细胞悬液细胞数＝（80个小方格细胞总数 /80） ×400×104× 稀释倍数
2、菌和细胞在摇床中作用的时间不超过30 min，如果在 37C 条件下作用时间过长，被吞噬的菌很快会被裂解， 也就不能计数为吞噬了菌的细胞。
3、滴片时加入的细胞数依细胞的大小而定，如果使用的 吞噬细胞是细胞系，细胞体积较大，那么加入的细胞 数就相应的少一点。
血球计数板计数法
血球计数板是由一块厚玻片特制而成，其中央有 两个计数室。每个计数室划分出9个大方格（见下图）， 每格面积1mm2，加盖玻片后的深度为0.1mm。因此， 每大方格容积为0.1mm3。
【CN109735459A】白色念珠菌适用性试验菌株及其制备方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910149191.0(22)申请日 2019.02.28(71)申请人 中国检验检疫科学研究院地址 100176 北京市大兴区亦庄经济技术开发区荣华南路11号(72)发明人 卢行安 吕涵阳 吴孝槐 瞿洪仁 单耕 赵红阳 孙英健 王静 (74)专利代理机构 大连博晟专利代理事务所(特殊普通合伙) 21236代理人 于忠晶(51)Int.Cl.C12N 1/16(2006.01)C12N 1/04(2006.01)C12Q 1/04(2006.01)C12R 1/725(2006.01)(54)发明名称白色念珠菌适用性试验菌株及其制备方法(57)摘要本发明属于药品微生物学检测方面的质量控制领域，特别涉及一种白色念珠菌适用性试验菌株及其制备方法。
白色念珠菌适用性试验菌株仅包含一定量的白色念珠菌。
本发明均匀性、稳定性符合适用性试验菌株要求，菌株所含菌数在适用性试验标准要求范围内，最大程度满足药品微生物检测过程中适用性试验、促生长试验等需要，样品的制备方法，工艺简单，成功率高。
权利要求书1页 说明书8页 附图1页CN 109735459 A 2019.05.10C N 109735459A1.白色念珠菌适用性试验菌株，其特征是：仅包含一种目标菌：白色念珠菌，目标菌的目标浓度为500～2000CFU/支，每支装有0.2g的冻干粉。
2.根据权利要求1所述的白色念珠菌适用性试验菌株，其特征是：所述样品属药品检查中适用性试验用菌株，应用于药品微生物检测过程中适用性试验。
3.根据权利要求1所述的白色念珠菌适用性试验菌株，其特征是：所述适用性试验菌株以海藻糖、明胶和无菌水为基质，其中海藻糖体积分数为10%、明胶体积分数为1%。
4.根据权利要求1所述的白色念珠菌适用性试验菌株的制备方法，其特征是：包括样品添加菌株的配制、冻干保护剂的配制、样品冻干、样品的均匀性和稳定性试验、样品定值五个步骤，其中样品冻干过程为：菌株复苏传代—增菌—菌液分装—菌悬液配制—冻干和包装—储存，具体过程为：（1）菌株复苏传代将标准菌株接种到营养琼脂斜面培养基中，在30~35℃下使其复苏和生长，并对复苏的菌株进行鉴定；（2）增菌目标菌培养至对数生长期末，从斜面刮取菌落，加到10mL的冻干保护剂中制成菌液；（3）菌液分装将上一过程得到的菌液与冻干保护剂混合，配制100mL菌液，将此菌液置于磁力搅拌器上不断搅拌下平均分装到菌液储存瓶中，每瓶5mL，共20瓶，置于液氮中保存备用；（4）菌悬液配制按目标菌的目标浓度500～2000 CFU/支，取适量上述5mL菌液与1500mL冻干保护剂混合，置于磁力搅拌器上不断搅拌下分装到西林瓶中，0.3mL/瓶，加上瓶塞，但要留有空隙，不要盖实；（5）冻干和包装将装有菌悬液的样品瓶开盖放入冻干机中，冷冻干燥40～50h，当样品冷冻干燥结束后，直接进行箱内加塞，关闭机器，样品瓶中样品为真空状态；（6）储存将样品放置在-18℃条件下避光保存，从全部样品中随机挑选样品发放给实验室或进行均匀性和稳定性试验。
2020版《中国药典》微生物限度计数—酵母菌及霉菌
2020版药典微生物限度计数—酵母菌及霉菌2020版本药典(1)菌液制备取白色念珠菌的新鲜培养物，用0.9%无菌氣化钠溶液制成103cfu/ml的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加5ml含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氣化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，使用移液枪吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氣化钠溶液制成103cfu/ml的黑曲霉孢子悬液。
菌液制备后保存在2℃冰箱，在24小时内使用。
(2) 计数培养基适用性检査接种不大于l00cfu的白色念珠菌和黑曲霉的菌液至胰酪大豆胨琼脂培养基平板，35℃条件下培养4天；接种不大于l00cfu的白色念珠菌和黑曲霉的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，25℃条件下培养4天。
每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。
同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
(3) 计数方法适用性试验1) 供试液制备取供试品10g，用胰酪大豆胨液体培养基制备成1:10供试液。
2) 接种和稀释按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。
所加菌液的体积不超过供试液体积的1%。
1、试验组取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每lml供试液中含菌量不大于l00cfu。
2、供试品对照组取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。
3、菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。
3) 供试品中微生物的回收取20ml温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，注人直径90mm的无菌平皿，凝固，制成平板，采用无菌操作台风干的方法使培养基表面干燥。
每一平板表面接种上述照“供试液的制备”和“接种和稀释”制备的供试液0.1ml。
胰酪大豆胨琼脂培养基平板在35℃条件下培养3天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在25℃条件下培养4天。
同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
抗菌 振荡法
抗菌性能评价——振荡法抗菌性能是指纺织品所具有的能抑制织物上的细菌生长繁殖的性能。
1.原理将试样与对照样分别装入一定浓度的试验菌液的三角瓶中，在规定的温度下震荡一定时间，测定三角烧瓶内菌液在震荡前以及震荡一定时间后的活菌浓度，计算抑菌率，以此评价试样的抗菌效果。
2.菌种革兰氏阳性细菌：金黄色葡萄球菌革兰氏阴性细菌：大肠杆菌白色念珠菌3.抗菌试验所需物品营养肉汤，营养琼脂培养基，沙氏琼脂培养基0.03mol/L PBS（磷酸盐）缓冲液由磷酸氢二钠2.84g，磷酸二氢钾1.36g定容至1000ml制得。
100ml三角瓶，250ml三角瓶，大、小试管，量筒，10ml枪头、1ml枪头，平板培养皿4.抗菌试验部分4.14.1.1样品洗涤取10g左右样品，试验条件为40℃±3℃，浴比1：30。
过程如下：洗衣机中加入热水3L，试样10g，洗涤剂6g，洗涤25分钟，排水，冲洗织物。
按要求不断重复以上步骤。
4.1.2三区画线将琼脂进行加热后，倒入平板，使其均匀覆盖平板内部，等待其凝固。
凝固后用接种针刮拭少量菌涂于平板二分之一位置，此为一区。
然后将平板旋转90度，用酒精擦拭接种针后用酒精灯灼烧接种针至针头烧红，降温后占取一区菌液左右刮拭，此为二区。
以此类推，即为三区。
4.1.3玻璃器皿的准备4.24.2.1制作菌悬液D、E细菌的菌悬液制备方法为，利用接种环从平板中挑出典型菌落，接种于20ml营养肉汤中，37℃±1℃，130r/min，振荡培养18h-20h，即为细菌菌悬液。
白色念珠菌菌悬液制备方法为，利用接种环从平板中挑出典型菌落，接种于沙氏琼脂培养基试管斜面，37℃±1℃。
4.34.3.1样品灭菌4.3.2菌液的制作D、E菌液的制作方法：从细菌悬液中吸取2-3ml，移入装有9ml 营养肉汤试管中，充分混匀。
吸取1ml移入装有9ml营养肉汤试管中，充分混匀。
吸取1ml移入装有9ml 0.03mol/L PBS缓冲液的试管中，充分混匀。
真菌菌悬液的制备
真菌菌悬液的制备1）白色念珠菌悬液的制备1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。
取含 5.0 ml～10.0ml 沙堡液体培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。
用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于沙堡琼脂培养基平板上，于37℃培养18h～24h。
挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于沙堡琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第 3 代培养物。
2）取第3代～14代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用 5.0 ml 吸管吸取 3.0 ml～5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。
随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲80次，以使白色念珠菌菌悬浮均匀。
3）菌悬液的含菌量和菌片制备按2.1.1.2 要求进行。
4）菌悬液保存在4℃冰箱内备用。
当天使用不得过夜。
5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。
菌落形态可直接用显微镜观察。
菌体形态可在涂片后直接用高倍显微镜观察，也可用墨水阴地法染色（将菌与黑墨水在玻片上混匀，推成薄膜）后观察。
（2）黑曲霉ATCC 16404 悬液或菌片的制备。
1) 在无菌操作下打开冻干菌种管，以毛细管吸取少量麦芽浸膏营养肉汤培养基加到菌种管中，轻轻吹吸，使菌种沉淀物融化分散。
取少许沉淀物悬液加到含 5.0ml 麦芽浸膏营养肉汤培养基试管中，置30℃±1℃培养42h～48h。
用接种环划线接种第 1 代培养物于MEA 培养基平板，置30℃±1℃培养箱中培养42h～48h。
取平板培养物中的典型菌落，接种于麦芽浸膏营养肉汤培养基，置30℃±1℃培养箱中培养42h～48h，即为第3代培养物。
2) 用10.0ml 吸管吸取5.0 ml～10.0ml 第 3 代培养物，接种罗氏瓶，并摇动使菌液布满MEA 培养基表面，然后将多余肉汤培养物液体吸出，置30℃±1℃培养42h～48h。
生物制药工艺学实验
3. 打孔注入无菌滤液
用直径为6毫米的无菌打孔器在平板上打4个孔 （呈十字排列），其中 2 孔注入无菌滤液，另 两孔注入空白培养基（经过于发酵液相同的处
理）。
4. 培养并测定抑菌圈直径
将平板置于37℃的培养箱，24小时后观察抑菌
效果，并测量抑菌圈直径。
四、实验作业
1、简述本实验的实验原理及流程。 2、简述本实验中有哪些无菌操作步骤。 3、实验结果及分析。
生物制药工艺学实验
一、实验目的
1. 掌握产抗生素微生物的培养流程。 2. 掌握抗生素抑菌活性测定方法。
二、实验材料
1.实验菌种：Bacillus oceanisediminis
平板照片
2.LB 培养基 （ Bacillus oceanisediminis 斜面和平板，
作液体种子培养基时不加琼脂即可 ） 胰蛋白胨 酵母提取物 氯化钠 10.0g 5.0g 10.0g
蒸馏水
pHபைடு நூலகம்
1.0 L
7.０
3.PDB培养基（Bacillus oceanisediminis 发酵培养基）
200g马铃薯切成小块，煮沸20分钟后过滤，加入20g 葡萄糖，补水至1L，调pH至中性。
4.沙堡氏培养基配方（培养白色念珠菌用，液体培
养基不加琼脂） 蛋白胨 10g 葡萄糖 40g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 调pH值至5.4～5.8，高压蒸汽灭菌115℃，30min。
5.无菌器具
平板、离心管、滤膜、打孔器等。
三、实验内容
培养基的制备 斜面的制备 发酵液的制备 发酵液预处理 抑菌活性测定 结果分析
培养基的制备
斜面培养基 种子培养基 发酵培养基 按照 配方 称量 分装 锥形瓶
白色念珠菌
8.附件：无
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工厂操作规程
河南利华制药有限公司HENAN LIHUA PHARMA. CO., LTD.
名称：白色念珠菌检验操作规程
编号：82*051
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1Hale Waihona Puke 目的：建立一个合理的、规范的梭菌的检测方法。
2.依据：中国药典2015版四部1106
6.3操作步骤：
6.3.1供试液的制备和增菌培养：
取相当于1g或1ml供试品的供试液2份，分别接种至2份100ml沙氏葡萄糖液体培养基中，其中1份加入阳性对照菌液，混匀，30-35℃培养3-5天。用等量稀释剂代替供试液按此方法检测。
6.3.2选择和分离：
取上述预培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，30-35℃培养24-48小时。
白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上生长的菌落程乳白色，偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬有褶皱。挑取疑似菌落接种至念珠菌显色培养基平板上，培养24-48小时（必要时延长至72小时），或采用其他适宜方法进一步鉴定。
6.3.3结果判断：
工厂操作规程
河南利华制药有限公司HENAN LIHUA PHARMA. CO., LTD.
名称：白色念珠菌检验操作规程
编号：82*051
2020版《中国药典》微生物限度计数—酵母菌及霉菌
2020版药典微生物限度计数—酵母菌及霉菌2020版本药典(1)菌液制备取白色念珠菌的新鲜培养物，用0.9%无菌氣化钠溶液制成103cfu/ml的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加5ml含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氣化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，使用移液枪吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氣化钠溶液制成103cfu/ml的黑曲霉孢子悬液。
菌液制备后保存在2℃冰箱，在24小时内使用。
(2) 计数培养基适用性检査接种不大于l00cfu的白色念珠菌和黑曲霉的菌液至胰酪大豆胨琼脂培养基平板，35℃条件下培养4天；接种不大于l00cfu的白色念珠菌和黑曲霉的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，25℃条件下培养4天。
每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。
同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
(3) 计数方法适用性试验1) 供试液制备取供试品10g，用胰酪大豆胨液体培养基制备成1:10供试液。
2) 接种和稀释按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。
所加菌液的体积不超过供试液体积的1%。
1、试验组取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每lml供试液中含菌量不大于l00cfu。
2、供试品对照组取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。
3、菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。
3) 供试品中微生物的回收取20ml温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，注人直径90mm的无菌平皿，凝固，制成平板，采用无菌操作台风干的方法使培养基表面干燥。
每一平板表面接种上述照“供试液的制备”和“接种和稀释”制备的供试液0.1ml。
胰酪大豆胨琼脂培养基平板在35℃条件下培养3天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在25℃条件下培养4天。
同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
抗菌性试验方法
抗菌性试验方法
一、试验菌
细菌：金黄色葡萄球菌（ATCC6538），酵母菌：白色念珠菌（ATCC10231）
二、菌液制备
0.03mol/L的磷酸盐缓冲液（以下简称PBS）配制：无钙镁离子磷酸缓冲盐水（PBS）
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
Na2HPO4 2.30g
KH2PO4 0.4g
将上述试剂依次溶于1 000ml去离子水中，完全溶解后，115℃高压灭菌10min-15min，
存在4℃冰箱中备用。
取试验菌株3-14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（24h），用5ml0.03mol/L的磷酸盐缓冲液（以下简称PBS）洗下菌苔，使菌悬浮均匀后用上述PBS稀释至合适浓度.
三、操作步骤
取被试样液和对照样液(不含抗菌材料，且经灭菌处理)各4管(每管5ml)，分别加入100UL 上述菌悬液，均匀混合，并开始计时，在2，5，10，20min分别取样液0.5 ml放入含5mLPBS 的试管内，充分混匀，并做适当稀释，取其中2-3个稀释度，分别吸取0.5mL于两个平皿，用凉至40-45摄氏度的营养琼脂（细菌）或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15mL作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35±2摄氏度培养48小时（细菌）或72小时（酵母），作活菌菌落计数。
四、抗菌率计算：
抗菌率=（A-B）/A×100%
五、评价标准：
抗菌率≥50%，产品有抗菌活性。
抗菌率≥90%，产品有较强抗菌活性。
抗菌率＜50%，产品无抗菌活性。
培养基适用性检查记录
培养基适用性检查记录质量部培养基名称：沙氏葡萄糖琼脂培养基来源：批号：对照培养基：来源：批号：检验依据：检验人：检验日期：一、实验菌种：白色念珠菌[CMCC(F)98 001]第代黑曲霉[CMCC(F)98 003]第代二、菌液制备将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养5～7天；取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液。
将黑曲霉接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养5～7天。
加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液。
三、培养基适用性检查取5个无菌平皿，分别接种白色念珠菌、黑曲霉各2皿，每皿接种1ml菌液（含菌适宜浓度），另一皿接种1ml PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液作为空白对照，倾注对照沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀。
凝固后倒置培养，20-25℃培养5天计数。
被检培养基同法操作。
四、结果判断五、结论本品按《中国药典》2015年版“非无菌产品微生物检查：微生物计数法”及培养基适用性检验操作规程检验，结果：□符合规定□不符合规定。
培养基名称：胰酪大豆胨琼脂培养基来源：批号：对照培养基：来源：批号：检验依据：检验人：检验日期：一、实验菌种：金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]第代铜绿假单胞菌[CMCC(B)10 104]第代枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]第代白色念珠菌[CMCC(F)98 001]第代黑曲霉[CMCC(F)98 003]第代二、菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24 小时；取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液。
将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养5～7天；取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液。
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白色念珠菌菌液制备：接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～28小时；取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml ，采用10倍递增稀释法稀释至10-6～10-7，制成每1ml含菌数50～100cfu 的孢子悬浮液。
黑曲菌菌液制备：接种黑曲菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸至无菌试管中，取1ml加无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6，制成每1ml含菌数50～100cfu的孢子悬液。
供试液的制备无抑菌活性的供试品供试液的制备稀释剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液液体供试品：供试品10ml置锥形瓶中，加90ml稀释剂，混匀，作为供试液（1：10）固体、半固体、粘稠性供试品：称取供试品10g置锥形瓶中，加稀释剂至100ml，混匀后，作为供试液（1：10）。
具有抑菌活性的供试品试液的制备当供试品具有抑菌活性时，须先消除抑菌活性，其方法如下：培养基稀释法：取供试液2ml，每0.2ml的供试液注一皿或每0.1ml的供试液注一皿；或取供试液1ml每0.5ml的供试液注一皿，倾注15ml的培养基，测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数，混匀，凝固，培养。
每1ml供试液所注的平皿生长的菌数之和即为1ml的菌落数。
计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法技术规则报告菌数。
控制菌检查时可加大增菌液的用量。
离心沉淀集菌法：取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。
薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释剂供试液，过滤，冲洗吗，按薄膜过滤法测定其菌落数。
中和法：选取适宜的中和剂消除供试品的抑菌活性后测定。
菌液组：测定所加的试验菌数。
采用平皿法，取试验用的1ml菌液（约50～100cfu）分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。
1.5试验组平皿法：取试验可能用的最低稀释级1ml供试液和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。
1.5.2培养基稀释法（平皿法）：取试验可能用的最低稀释级1ml供试液分别注入N个平皿中，每个平皿再注入50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平均制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。
1.5.3薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌落数。
至少要一张膜。
1.5.4离心沉淀集菌法：取规定量试验可能用的最低稀释剂供试液，如供试液含许多药渣，先以500转/分钟离心3～5分钟，取全部上清液，再以3000转/分离心20分钟，取下面1ml液体，并用稀释剂洗地管底，将洗涤液与1ml液体一起采用平皿法或薄膜过滤法计数。
1.6供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数（方法和试验组相同）稀释剂对照组若供试剂需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤法额、等处理时，应增加稀释剂对照组。
用稀释剂代替供试品，加入试验菌。
最终浓度为每1ml供试液含50～100cfu，按试验组的供试液制备方法和技术方法计算。
回收率计算试验组回收率计算试验组的菌回收率=菌液组的平均菌落数数供试品对照组平均菌落验组的菌回收率 100%稀释剂对照组回收率计算试验组的菌回收率=菌液组的平均菌落数数稀释剂对照组平均菌落×100%计数方法验证至少应进行3次独立平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
1.9.在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数占菌液组的品均菌落数的百分率）≥70%，应采用自然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证，是试验组菌回收率大于70%控制菌检验方法与验证当建立药品的微生物限度检查时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查方法测定。
若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检验方法应进行重新验证。
验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。
验证用菌株大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型付伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌为验证用菌株，菌株传代次数不得超过5代。
菌液制备大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型付伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，35～37℃培养18～24小时；分别取培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，制成每1ml含菌数10～100cfu的菌悬液。
阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。
方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查方法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。
阴性对照菌不得检出。
试验组常规法大肠埃希菌：取相当于1g或1ml供试品的供试液至100m l胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照组加入大肠埃希菌10～100cfu，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培养18～24小时，取此培养物按《微生物限度检测标准操作规程》大肠埃希菌项下规定检查。
2.4.1.2大肠菌群：取含适量（不少于10ml）的胆盐乳酸发酵培养基管3支，分别加入含供试品1g或1ml、0.1g或0.1ml、含供试品0.001g或0.001ml的供试液，阳性菌对照加入大肠埃希菌10～100cfu，阴性菌对照计入近换色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培养18～24小时，按《微生物限度检测标准操作规程》大肠菌群项下规定检查。
2.4.1.3沙门菌：取供试品10g或10ml，直接或处理后接种至适量（不少于200ml）的营养肉汤培养基中，用均浆仪或其他适宜方法混匀，阳性菌对照加沙门菌10～100cfu，阴性菌对照加入近换色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培养18～24小时。
按《微生物湖南金旺稀贵药业有限公司G M P管理文件限度检测标准操作规程》沙门菌项下规定检查。
2.4.1.4铜绿假单胞菌：取相当于1g或1ml供试品的供试液至100ml胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入铜绿假单胞菌10～100cfu，阴性菌对照加入大肠埃希菌10～100cfu35～37℃培养18～24小时。
按《微生物限度检测标准操作规程》沙门菌项下规定检查。
2.4.1.5金黄色葡萄球菌：取相当于1g或1ml供试品的供试液至100ml胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入铜绿假单胞菌10～100c f u，阴性菌对照加入大肠埃希菌10～100cfu35～37℃培养18～24小时。
按《微生物限度检测标准操作规程》金黄色葡萄球菌项下规定检查。
2.4.2培养基稀释法：供试品有抑菌作用，放大培养基量由1：100放大到1：300、1：500或1：1000，由于容器提及限制，一般放大到500ml或1000ml，本法适用于抑菌作用不签的样品。
2.4.3薄膜过滤法：采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，取全部上清液，再以3000转/分离心20分钟取下面液体，并将适量的稀释剂洗涤管底的洗涤液一并移入同瓶增菌液中，培养，本法适用于中等抑菌作用的样品。
2.4.4中和法：在供试品溶液中加入相应的中和剂一减除供试品中抑菌成份的作用，中和剂应对微生物无毒性，与抑菌成份结合后的产物应对微生物无毒性，或有毒性但不影响待检菌的检出。
2.5结果判断至少进行3次独立平行试验。
阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。
若试验组检出试验菌，按照该供试液制备方法和控制菌检查法进行该供试品控制菌的检查；若试验组未检出试验菌，应采用自然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
3.验证的实施3.1细菌、霉菌、酵母菌计数方法验证记录及控制菌检验方法验证记录（见附录）。
3.2分析数据，综合整个验证过程，得出验证结论。
3.3验证过程中发生的异常情况，按照《偏差处理程序》进行处理。
4.在验证4.1验证时的检验条件爱你发生改变可能影响检验结果时。
5. 附录。