绿色荧光蛋白及其应用

1 绿色荧光蛋白发展简史
1962 年，Shimomura 等［1］ 从 维 多 利 亚 多 管 水 母 ( Aequorea victoria) 中分离纯化生物发光蛋白质———水 母蛋白( aequorin) ，并观察到一个在紫外光下发出“非常 明亮，浅绿色荧光”的副产物。1974 年，Shimomura 等［2］ 纯化得到 了 这 种 自 发 荧 光 的 蛋 白 ( 即 GFP) 。1985 年 Prasher 等［3］构建维多利亚多管水母的 cDNA 文库，用于 克隆水母蛋白的编码基因，并得到含有 GFP 片段的蛋 白。1992 年 Prasher 等［4］克隆到编码全长 GFP 的 cDNA。 但直到此时人们对 GFP 的应用前景还不甚了解。1994 年，Chalfie 等［5］首次在原核的大肠杆菌和真核的秀丽隐 杆线虫( Caenorhabditis elegans) 中表达了具有荧光性的 GFP，证明 GFP 的荧光产生不需要水母中特异组分的参 与。同年，钱永健及其同事［6］提出 GFP 中 Ser65-Tyr66Gly67 氨基酸残基形成 4-对羟基苯甲基-5-咪唑啉酮［4( p-hydroxybenzylidene) -5-imidazolinone，p-HBI］生色团发 光的机制，并表明生色团的形成不需要任何酶或辅助因 子的参与，而只需分子氧的存在。此后对 GFP 的研究进 入了高潮，并在 1996 年解析了其晶体结构［7-8］。基于已 有知识和晶体结构，人们通过突变的方法得到许多不同 荧光性质的 GFP。同时，受 GFP 启发，人们开始在其它 生物中寻找类似的荧光蛋白，并相继在珊瑚、海葵、水螅、
3 绿色荧光蛋白生色团成熟和荧光产生机理
p-HBI 生色团的成熟过程经历 GFP 多肽骨架折叠 和生色团形成两个阶段，期间 4 个保守氨基酸残基发 挥着特殊的功能作用［10］。
2011，31( 1)
邓 超 等: 绿色荧光蛋白及其应用
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图 1 野生型 avGFP 的结构 Fig． 1 The structure of wild type avGFP
( a) ． Secondary structure ( UniProt accession P42212) ; ( b) ． Side view: the tripeptide of chromophore locates in the center of β-barrel; ( c) ． To Pview; ( d) ． the tripeptide of chromophore ( uncyclized) ; ( e) ． The microenvironment surrounding the chromophore． ( b) ～ ( d) are generated from a subunit of wild type avGF来自百度文库P( PDB IGFL) ; ( e) ． from ref［10］
3． 1 多肽链的折叠 生色团形成之前，GFP 多肽链需折叠成一个近乎
完整的十分稳定的 β 圆柱结构。该结构的微环境对下 一步生色团的形成十分重要［图 1( e) ］。同时，多肽链 的折叠又受 生 色 团 三 肽 的 影 响，折 叠 过 程 虽 然 比 较 缓 慢，但不是生色团成熟的限速步骤［10］。 3． 2 生色团的形成
收稿日期: 2010-10-25 修回日期: 2010-11-17 * 通讯作者，电子信箱: fpsong@ ippcaas． cn
甲壳类动物甚至低等脊索动物中发现了 GFP 样蛋白［9］， 荧光谱覆盖蓝色到远红光，使得荧光蛋白的使用范围不 断扩大，极 大 地 促 进 了 生 命 科 学 和 医 药 科 学 的 发 展。 2008 年，诺 贝 尔 化 学 奖 授 予 Osamu Shimomura，Martin Chalfie 和 Roger Tsien( 钱永健) ，以表彰他们因“发现和 发展了绿色荧光蛋白”所做的巨大贡献。
2 绿色荧光蛋白的结构
从维 多 利 亚 多 管 水 母 中 分 离 出 来 的 野 生 型 GFP ( avGFP ) 由 238 个 氨 基 酸 残 基 组 成，分 子 质 量 约 27kDa，二级结构包括 11 个 β 折叠链( β-sheet strand) ， 8 个螺旋( helix) ，3 个转折( turn) ［图 1 ( a) ］，三维结构 ( PDB 登录号 1EMA 和 1GFL，1GFL 为二聚体) 为 42 × 24 ( 高 × 直径) 的 β 圆柱( β-barrel) ，圆柱两端由一 些较短的 α 螺旋盖住，圆柱中央是几段 α 螺旋，生色团 的三肽( Ser65-Tyr66-Gly67) 位于圆柱中央［图 1 ( b) ～ ( d) ］。该结构性质稳定，圆柱内部的微环境对维持生 色团的正确构象从而产生荧光以及保护生色团不被氧 气淬灭等都有重要作用［10］［图 1( e) ］。
中国生物工程杂志 China Biotechnology，2011，31( 1) : 96-102
绿色荧光蛋白及其应用
邓 超1 黄大昉2 宋福平1*
( 1 中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室 北京 100193) ( 2 中国农业科学院生物技术研究所 北京 100081)
摘要 随着对绿色荧光蛋白( green fluorescent protein，GFP) 研究的不断深入，人们对其结构、荧光 产生机理等已有较为全面的认识。近年来利用 GFP 及其它荧光蛋白( FPs) 发展了诸如荧光互补 技术( FC) 、荧光共振能量转移技术( FRET) 和超分辨成像( super-resolution imaging) 等一系列新技 术，极大地促进了生物学、医药科学的研究。主要介绍了荧光蛋白的结构，荧光产生的机理，不同 类型的荧光蛋白和基于荧光蛋白产生的新技术等方面的最新研究进展。 关键词 绿色荧光蛋白( GFP) 生色团 荧光产生机理 荧光蛋白的应用 中图分类号 Q946． 1