枯草杆菌摇瓶发酵生产α-淀粉酶实验方案

枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验

一、实验原理

以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。

淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有 6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。

二、实验材料

（一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌

（二）培养基：

1、种子培养液：葡萄糖1% 、胰蛋白胨：1%, 、酵母提取物：0.5%、NaCl(氯

化钠)：1%

调pH7.2 ，若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。

2、产淀粉酶发酵培养液：玉米粉 2 .0 % 、蛋白胨1 .5% 、CaCl

2

0 .02 % 、

MgSO

40 .02% 、NaCl 0 .25% 、K

2

HPO

4

0 .2% 、柠檬酸钠0 .2% 、硫酸铵0 .075% 、

Na

2HPO

4

0 .2 %

调节pH 值7 .0

（三）0.02M磷酸缓冲液（pH6.0）

（四）实验仪器

离心机、水浴锅、250mL三角瓶、试管

三、实验过程

1、分别按培养基配方配制种子培养基和发酵培养基。

2、种子斜面及种子液准备

A.挑取单菌落从平板转接于新鲜种子斜面培养基，37℃，24h作菌种（3支/组）。

B.将配好的种子培养液按每瓶50mL分装于250mL三角瓶中灭菌（ 100KPa 20min ）。

C.在无菌操作条件下，将活化的菌株接种于以上培养液中（每支斜面接两瓶），37℃ 120r／min振荡培养16h作种子液。（6瓶/组）

3、发酵培养

A、按15-20％的接种量接种于装有50mL已灭菌菌发酵培养基的250ml三角瓶中。37℃培养48h。

B、在无菌操作条件下，每4h取样2mL，测定酶活。40-48h酶活降低后结束实验。

4、发酵结束后，用显微镜检查是否染菌。

5、待测酶液的制备：

称取1g~2g酶粉(精确至0.000 1 g)或准确吸取酶液1.00 mL，用少量磷酸缓冲液充分溶解，将上清液小心倾入容量瓶中，若有剩余残渣，再加少量磷酸缓冲液充分研磨，最终样品全部移入容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液待用。

注:待测中温a-淀粉酶酶液酶活力控制酶浓度在3.4 u/mL~4. 5 u/mL范围内，待测耐高温淀粉酶活力控制酶浓度在60u/mL~65u/mL范围内。

6、酶活力的测定

吸取10.0 mL可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液2.5 mL，摇匀后，置于60℃±0.2℃(耐高温α-淀粉酶制剂置于70℃±0. 2℃)恒温水浴中预热8 min；加入0.5 mL稀释好的待测酶液，立即计时，摇匀，准确反应5 min；

立即用移液管吸取1.0 mL反应液，加到预先盛有0.5 mL盐酸溶液和5.00mL 稀碘液的试管中，摇匀，并以0.5 mL盐酸溶液和5.00 mL稀碘液为空白，于660 nm波长下，用10mm比色皿迅速测定其吸光度(A)。根据吸光度查表A.1，求得测试酶液的浓度。

7、酶活力计算

（1）中温α-淀粉酶制剂的酶活力按下式计算:X1 = c× n

式中:

X

—样品的酶活力，u/mL或u/g

1

c—测试酶样浓度，u/mL或u/g

n—样品的稀释倍数（可通过反应时间和加入固定化酶的量来控制）。注：所得结果表示至整数。

允许差：平行试验相对误差不得超过5%

（2）耐高温α-淀粉酶制剂的酶活力按下式计算:X2 = c×n×16.67

式中:

X

—样品的酶活力，u/mL或u/g

2

c—测试酶样浓度，u/mL或u/g

n—样品的稀释倍数

16.67 —根据酶活力定义计算的换算系数。

注：所得结果表示至整数。

允许差：平行试验相对误差不得超过5%