分子生物学试验设计

分子生物学实验设计

田益夫（2013141241072）

唐子林（2013141241127）

（一）实验目的

获得发绿色荧光的细菌。

（二）实验概述

通过体外扩增目的基因eGFP并构建表达载体pET-28a-eGFP转入大肠杆菌BL21，涂板观察细菌中外源绿色荧光蛋白基因表达情况。（三）实验步骤及材料

1 实验准备与质粒提取

1.1 实验材料及试剂

含有pEGFP-N3质粒的大肠杆菌菌液和含有pET-28a质粒的大肠杆菌菌液（或pEGFP-N3质粒、pET-28a质粒及E.coli DH5α）；胰蛋白胨，酵母提取物，琼脂，去离子水，1N NaOH；溶液I, 溶液II, 溶液III;卡那霉素储存液（50mg/ml），工作浓度50μg/ml;氨苄青霉素储存液（100mg/ml）,工作浓度100μg/ml；饱和酚，氯仿，异戊醇；无水乙醇，含RNase的双蒸水。

1.2 实验仪器

恒温摇床，超净工作台，高温灭菌锅，10、200、1000μl移液器各一支及对应枪头各一盒，台式高速离心机，制冰机，混合漩涡器，EP管，三角瓶等常用玻璃仪器，琼脂糖凝胶电泳仪等。

1.4实验具体步骤

1.4.1 仪器准备与培养基的配置

（1）取两个250ml锥形瓶，各配置100ml固体/液体LB培养基，

（2）按照体系将以上物品分别加入两个烧杯中，加入80ml去离子水混匀溶解。加入琼脂的培养基在石棉网上加热溶解。

（3）用1N NaOH调节PH至7.5，倒入250ml锥形瓶中，与装好的平板一起放入高温灭菌锅内121℃灭菌20min。

（4）将包好的平板，枪头（10、100、1000μl），EP管，三角瓶等常用仪器放入高温灭菌锅内121℃灭菌30min。

（5）将灭菌后的常用仪器放置于干热灭菌箱内保存备用。

（6）取一支200μl移液枪，200μl枪头一盒，灭菌后的培养基、灭菌后的平板等放于紫外灯下照射30min。

（7）待培养基降温至50℃左右，各加入Kana霉素10μl。

（8）倒5个平板于4℃冰箱储存备用。

1.4.2 扩大培养及菌保

（1）取两个已经灭菌的50ml三角瓶，配好的LB(Kana)培养基，移液枪和一盒枪头（100μl）放入超净台中紫外灯下照射30min。

（2）向两个50ml三角瓶中分别加入已配好的约10mlLB（Kana）液体培养基，再用移液枪分别移取10μl带有pEGFP-N3质粒的菌液和10μl带有pET-28a质粒的菌液于恒温摇床上37℃、220rpm过夜培养。

（3）取已高温灭菌的EP管，LB（Kana）液体培养基，1000μl 枪头和移液枪，甘油于紫外灯下照射30min。

（4）向6个EP管（每种菌做3管甘油菌保存）各中加入800μl 摇好的菌液（呈浑浊）和200μl甘油配置20%的甘油菌于-20℃下菌保。

1.4.3 碱裂解法提取质粒

（1）取1.5ml菌液于1.5mlEP管中，10000rpm x 2min，弃去上清液，重复一次，弃去上清液。

（2）加入100μl溶液I，漩涡器上充分混匀，室温下放置10min。

（3）配制70%乙醇，酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）和氯仿/异戊醇（24：1）备用。

（4）向（2）中加入200μl新制溶液II，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5min。

（5）加入150μl预冷的溶液III，加盖后温和颠倒数次使之混匀，产生白色絮状物，冰上放置15min。

（6）10000rpm x 5min，取上清液于另一干净离心管中。

（7）向上清液中加入等体积（约400μl）酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡混匀，（10000rpm x 10min），将上清液转移至新的离心管中。

（8）加入等体积（约370μl）氯仿/异戊醇（24：1），混匀，离心2min，取上清液于新离心管中。

（9）向上清液中加入其2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。

（10）12000rpm x 5min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

（11）加0.8ml 70%乙醇，离心1min，倒去上清液，真空抽干或温室自然干燥30min。

（12）加入20μl含RNase的双蒸水，-20℃保存备用。

1.4.4 琼脂糖凝胶电泳鉴定

（1）称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mlxTAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。

（2）待胶液冷却至65℃，加入1μlGold view混匀，搅拌器上搅拌排除气泡。

（3）缓慢倒入事先准备好的制胶有机玻璃槽（插入样品模版梳子）内。静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子。

（4）胶板放入电泳槽中（样孔位于负极），注入1xTAE缓冲液淹没过胶板1mm，用取液器将提取的质粒DNA5μl与1μl Loading Buffer (6x)混匀，加入胶板上的样品孔内。

（5）将电泳槽于电泳仪接通，调节电压为100v左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm处，停止电泳。

（6）将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。

2 质粒酶切与连接

2.1 酶切位点分析和引物设计

2.1.1通过PCR扩增获得目的片段的方法：

EGFP基因序列：

ATG GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTG GACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCC ACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCC TGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCC GACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAG GAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAG TTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAG GACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTAT ATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAAC ATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGC GACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGC AAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCC GGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG TAA

EGFP酶切位点分析：

（http://users.unimi.it/camelot/tools/cut2.html）

The following endonucleases were selected but don't cut this：sequence:

………………

NgoAIV, NgoMI, ……………… VspI, XbaI,

选用引物：（用于后续菌落PCR检测等）

F-P1: 5’’

R-P2:5’’

Xho l

2.1.2通过直接没切质粒获得目的片段的方法：