生物物理试验方法PPT精品课件

f）振动驰豫：高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振
动弛豫的时间10 -12 s。
2021/3/1
4
2）荧光的应用
荧光发光分为内源荧光和外源荧光。
外源荧光应用很广，如染料结合作为荧光探针与蛋 白质结合后吸附在大分子上可以提供微区极性、疏水区 大小、粘性、分子间距离等。
荧光寿命和量子产率：
荧光猝灭：
电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如
能级图l 2 ,l 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重
态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光
(如l
‘ 2
)。
c. 镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状
一样2）021/成3/1 镜像对称关系。
8
镜像规则的解释
基态上的各振动能级分布与第 一激发态上的各振动能级分布类似 （振动波函数一样）；
基态上的 零振动能级与 第一激发态的 二振动能级之 间的跃迁几率 最大，相反跃 迁也然。
2021/3/1
9
3 .荧光光谱仪及使用 技术
1）荧光光谱仪
光源
激发单色器
样品池
检测器
发射单色器
检测器
荧光是散射谱，所以一般在垂直入射方向接收。背
景是没有入射光，是“暗背景”，因此灵敏度更高。
2021/3/1
10
荧光寿命方程：
FF0et/
公式中的τ即为荧光寿命
2021/3/1
14
荧光寿命和量子产率示意图
Q
kn r 1
2021/3/1kn r
Q为量子产率，为荧光发射速率，knr为
非辐射转移速率,τn为荧光自然寿命.通常
量子效率和波长相关，但生化的荧光通常 和波长无关。
n 1/
15
（ 2). 荧光各向异性
2）荧光强度和溶液浓度的关系
I0
薄层吸收的光强为：
dF
d I 0 I [ e k c e x k (x c d )]x I 0 k k c d cx e x
溶液发出的荧光光强正比于吸收光强。
F A d A I 0 k I k c d c A x e x 0 [ 1 e k k ] c Il
2021/3/1
2
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l3
l 2021/3/1 1
l 2 l 2
3
a)光吸收：荧光物质从基态跃迁到激发态，过程约10-15s。此时， 荧光分子处于激发态。
b)内转换：处于电子激发态的分子由于内部的作用，以无辐射 跃迁过渡到低的能级。
c)外转换：处于电子激发态的分子由于和溶剂以及其他分子的 作用，以及能量转移，过渡到低的能级
d)荧光发射：如果不以内转换的方式回到基态，处于第一电子 激发态最低振动能级的分子将以辐射的方式回到基态，平均寿命 约为10ns左右。
e)系间转换：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 如 电子自旋改变，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
荧光：某些物质受到照射后发出能量较低的光，一 旦光照停止，光线也立即消失，称为荧光。入射光 和发射光频率之差称为斯托克频移。
满足上述条件即为荧光。因此荧光范围比较宽， 从X射线到红外光谱区仍然是荧光。
其他的能量如（化学反应、加热、生物代谢等） 也会有荧光。生活中很多现象都与荧光相关。如： 钞票防伪，日光灯管，萤火虫发光。
原因：溶剂猝灭剂和荧光物质之间发生相互作用而引起 荧光效率降低或激发态寿命缩短，导致强度降低。
荧光能量共振转移：
时间分辨荧光光谱： 荧光各向异性：
荧光量子点标记，转基因荧光标记
双2光021子/3/1 荧光光谱
5
2.常用荧光光谱
荧光光谱有瞬态荧光光谱和稳态荧光光谱两类。 通常荧光光谱指的是稳态荧光光谱。 1）荧光的激发光谱，发射谱
激发谱：固定测量波长(选最大发射波长),化合物发
射的荧光强度与激发光波长的关系曲线 。
16
5. 荧光实验方法及其用途
荧光猝灭 荧光各向异性 荧光能量共振转移 时间分辨荧光光谱 荧光标记 双光子荧光光谱
2021/3/1
17
1）.荧光猝灭
荧光猝灭泛指任何可以减低样品荧光强度的过程。 狭义主要指那些由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶 质分子的相互作用所引起的荧光强度降低的情况。
2021/3/1
12
3）.荧光光谱的环境效应
2021/3/1
13
4. 荧光光谱参数
1）荧光光谱参数：
（1) 荧光寿命和荧光量子产率
去掉激发光以后，荧光强度并不是立即消失，而是以 指数形式衰减。定义荧光强度降低到激发状态最大荧光强 度的1/e所需要的时间称为荧光寿命。荧光寿命是个很重 要的参数，可以不再对荧光的绝对强度进行测量。
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多 ，荧光强度最大；
荧光的发射谱：固定激发波长，发射强度与发射波
长的关系。
2021/3/1
6
2021/3/1
7
2).荧光光谱的特征 a.Stokes位移
激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波
长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
b.发射光谱的形状与激发波长无关
荧光偏振： 荧光偏振（参数）： p=(F∥ -F⊥)/ (F∥ +F⊥) 荧光各向异性: γ=(F∥ -F⊥)/ (F∥ +2F⊥) p和同时描述荧光偏振。 从对称性考虑，Fx=Fy, 通常用描述荧光偏振
各向异性与偏振度转换：
2021/3/1
μaμe Z
X
I
Y
F∥ F⊥
p 3r 2 2r
r 2p 3p
第3讲 荧光光谱
1. 荧光是怎么产生的？有什么用途？ 2. 常用荧光光谱有哪些？荧光光谱有哪些特征？ 3. 荧光强度和物质浓度是什么样的关系?还有哪
些因素会影响到荧光强度？ 4. 荧光光谱的有哪些光谱参数？ 5. 有哪些实验方法？各种荧光测量方法有什么
用途？
2021/3/1
1
1.荧光介绍
1）荧光产生及其物理机制
如果kcl<<1，进行展开，有
2021/3/1
e kc 1 l k c ( kl)2 c ( k l ) 3 c • l • • 1 kc
Leabharlann Baidu
2 ! 3 !
11
样品池长度通常为1cm，因此荧光强度为
F 'K ' I0c
荧光随着浓度增高，强度反而减小，称为浓度猝灭。 原因可能是： a 浓度增加，分子碰撞机会增加，增加了非辐射损耗。 b 溶液中其他杂质吸收发出的荧光。（内滤光） c 吸收谱和发射谱重叠，荧光又被吸收。（自吸收） d 仪器原因