实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
( 商品名: Sepharose , Bio- gel – A ) 商品名 温度, 对实验条件要求高 ( 温度 ＜40℃ ℃ pH ) 4.5- 9.0
工作的下限是葡聚糖凝胶工作的上限, 工作的下限是葡聚糖凝胶工作的上限 用于大分子物质的分离
C. 聚丙烯酰胺凝胶
商品名: 商品名 Bio – gel – P（生物胶 ） （生物胶P）
固体物质 / 固定于固体物质的成分 可以流动的物质： 可以流动的物质： 如水和各种溶媒
待分离混合物（ 、 ） 待分离混合物（A、B）随流动相通过固定相 由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、 由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、 溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（ 溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含 量对比） 量对比）不同 与固定相相互作用力越弱的组分， 与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时 越弱的组分 受到的阻滞作用小 移动速度快 受到的阻滞作用小，移动速度快
（3）层析技术的优点
分离效率高 分析速度快 具有极高的灵敏度 应用范围广
适用： 适用：
杂质多、含量少的复杂样品分析， 杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生 物样品的分离分析
3. 凝胶过滤层析法 （gel filtration chromatography） ） 原理： （1）原理：
根据分子大小的差别进行分离。每个凝胶颗 根据分子大小的差别进行分离。 粒好象一个筛子，小分子物质可以进入颗粒内部， 粒好象一个筛子，小分子物质可以进入颗粒内部， 大分子物质被排阻在外。 大分子物质被排阻在外。
分步收集流出液， 分步收集流出液，可得到样品中所含的各单一 组分，从而达到将各组分分离 分离的目的 组分，从而达到将各组分分离的目的
（2）层析法的分类 按两相所处状态分类
流动相 液体 液体 固定相 固体 液—液层析法 液层析法 液— 固层析法 气体 气—液层析法 液层析法 气— 固层析法
按层析原理分类
例： Sephadex G-50： ：
对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量 为 对多肽及蛋白质的筛分范围 分子量)为: 分子量 1500 – 30000
Sephadex G-200： ：
对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量 为 对多肽及蛋白质的筛分范围 分子量)为: 分子量 5000 – 80000
B. 琼脂糖凝胶wk.baidu.com
制备： 制备：
将干胶颗粒悬浮于5 将干胶颗粒悬浮于 ~ 10倍的蒸馏水或洗脱液中 倍的蒸馏水或洗脱液中 充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去 充分溶胀，
3. 凝胶装柱
①柱固定于架子上，垂直放置，关住出口 柱固定于架子上，垂直放置， 开始下沉， ②自顶部缓缓加入葡聚糖悬液，使G-50 开始下沉， 自顶部缓缓加入葡聚糖悬液， 至1 ~2cm时，打开出口 时 ③凝胶逐层上升，至顶部 2-3cm时，关闭出口 凝胶逐层上升， 时
按操作形式不同分类
名称 柱层析法 操作形式 固定相装于层析柱内， 固定相装于层析柱内，使样品沿着一个方 向前移而达分离的层析法， 向前移而达分离的层析法，包括一般柱层 析法、 析法、毛细管层析法和微粒填充柱层析法
平面层析法 层析过程在固定相构成的平面层内进行的 层析法，包括纸层析法、 层析法，包括纸层析法、薄层层析法和薄 膜层析法
三、实验操作
1. 柱的选择 直径： 直径： 1~5 cm 一般长度： 一般长度：直径 = 10：1 ~ 20：1 ： ： 本实验玻柱： 直径0.8~ 1.5cm 本实验玻柱： 直径 长度 17~ 20cm
2. 凝胶选择、制备 凝胶选择、 血红蛋白 溶菌酶 分离 （64500） （11400） ） ） 选择 Sephadex G-50 Sephadex G-50： ： 对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量 分子量)为 对多肽及蛋白质的筛分范围 分子量 为: 1500 – 30000
2. 层析技术（色谱技术） 层析技术（色谱技术）
是利用混合物中各组分的理化性质差异（ 是利用混合物中各组分的理化性质差异（吸附 力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲 溶解度、分子形状和大小、分子极性、 和力等）建立起来的技术。 和力等）建立起来的技术。
（1）层析系统的基本组成 ）
固定相 + 流动相
6. 洗脱
当此少量蒸馏水接近流干时， ① 当此少量蒸馏水接近流干时，反复多次加入蒸 馏水，进行洗脱， 馏水，进行洗脱，直到两带分开 ② 检查 在层析床中色带位置，待Hb洗脱完后， 检查Hb在层析床中色带位置 在层析床中色带位置， 洗脱完后， 洗脱完后 用试管分步收集洗脱液 ③ 10d/管，每管加 管 每管加NaOH 2d，CuSO4 2d ， 检查溶菌酶洗脱情况，若为紫色，则为（ ） ④ 检查溶菌酶洗脱情况，若为紫色，则为（+）
名称 原理 吸附层析法 固定相为固体吸附剂，利用各组分在吸附 固定相为固体吸附剂， 剂表面吸附能力不同而分离 分配层析法 各组分在流动相和固相中的分配系数不同 固定相是离子交换剂， 离子交换层 固定相是离子交换剂，各组分与离子交换 析法 剂亲和力不同而分离 亲和层析法 固定相只能与一种待分离组分专一结合， 固定相只能与一种待分离组分专一结合， 以此和无亲和力的其它组分分离 凝胶层析法 固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不 固定相是多孔凝胶， 同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同
实验一 凝胶过滤层析法分离蛋白质
一、 实验目的
1.掌握凝胶过滤层析法的基本原理； 掌握凝胶过滤层析法的基本原理； 掌握凝胶过滤层析法的基本原理 2.掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程。 掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程。 掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程
二、 实验原理
1. 常用生化实验技术
分光光度技术 电泳技术 离心技术 层析技术
生物化学与分子生物学实验
带教: 张学礼、 带教 张学礼、戴薇薇 龚张斌、 龚张斌、黎志萍
实验课要求
试剂用后及时归位 及时记录实验结果 按时完成实验报告 离开时做好清洁工作
实验报告的书写
标题日期 一、实验目的 二、实验原理 三、操作步骤 四、实验结果 五、分析讨论
实验基本操作
一、玻璃仪器的洗涤 二、吸量管及微量取样器的使用 三、溶液的混匀 四、离心机的使用
又名分子筛过滤， 又名分子筛过滤，排阻层析
（2）凝胶的特点
属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱， 属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条 件较温和，可在相当广的温度范围内进行， 件较温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要 有机溶剂，对于高分子物质有很好的分离效果。 有机溶剂， 交联葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶
双缩脲反应） 缩二脲反应 （双缩脲反应）
O
O CuSO4 碱性 紫 红色
H2N - C - NH - C - NH2
肽键
四、实验结果
绘制洗脱结果示意图， 绘制洗脱结果示意图，并分析所得结果
五、讨论
下次实验： 下次实验：
《碱性磷酸酶的提取及其比活性的测定》 碱性磷酸酶的提取及其比活性的测定》 时间： 月 日上午 日上午9： 开始 时间：4月18日上午 ：00开始
（3）凝胶的选择 多孔网孔结构 A. 葡聚糖凝胶 (商品名 Sephadex，Dextran) 商品名: 商品名 ， 型号: 型号: G-10 – G-200
吸水能力， 干胶吸水量的10倍 吸水能力，每g干胶吸水量的 倍 干胶吸水量的 数字愈小,交联度越大 被筛分物质的分子量也愈小 数字愈小 交联度越大,被筛分物质的分子量也愈小 交联度越大
注意点： 注意点：
垂直放置 防止气泡产生 防止柱的分层
4. 平衡
放置一段时间， 分钟（ 放置一段时间，约40分钟（使凝胶更好的压实） 分钟 使凝胶更好的压实）
注意： 注意：
防止床面干涸， 防止床面干涸，可适当补充蒸馏水
5. 加样
加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出， ① 加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出，正好露 出床面时，立即关闭出口（将干未干） 出床面时，立即关闭出口（将干未干） ② 用滴管将混合样品(0.6ml，即血红蛋白和溶菌酶 用滴管将混合样品 ， 各0.3ml)缓缓沿柱内壁小心加于床表面 缓缓沿柱内壁小心加于床表面 打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出, ③ 打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出 立即加入1~2倍于样品体积的蒸馏水 倍于样品体积的蒸馏水 立即加入
工作的下限是葡聚糖凝胶工作的上限, 工作的下限是葡聚糖凝胶工作的上限 用于大分子物质的分离
C. 聚丙烯酰胺凝胶
商品名: 商品名 Bio – gel – P（生物胶 ） （生物胶P）
固体物质 / 固定于固体物质的成分 可以流动的物质： 可以流动的物质： 如水和各种溶媒
待分离混合物（ 、 ） 待分离混合物（A、B）随流动相通过固定相 由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、 由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、 溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（ 溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含 量对比） 量对比）不同 与固定相相互作用力越弱的组分， 与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时 越弱的组分 受到的阻滞作用小 移动速度快 受到的阻滞作用小，移动速度快
（3）层析技术的优点
分离效率高 分析速度快 具有极高的灵敏度 应用范围广
适用： 适用：
杂质多、含量少的复杂样品分析， 杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生 物样品的分离分析
3. 凝胶过滤层析法 （gel filtration chromatography） ） 原理： （1）原理：
根据分子大小的差别进行分离。每个凝胶颗 根据分子大小的差别进行分离。 粒好象一个筛子，小分子物质可以进入颗粒内部， 粒好象一个筛子，小分子物质可以进入颗粒内部， 大分子物质被排阻在外。 大分子物质被排阻在外。
分步收集流出液， 分步收集流出液，可得到样品中所含的各单一 组分，从而达到将各组分分离 分离的目的 组分，从而达到将各组分分离的目的
（2）层析法的分类 按两相所处状态分类
流动相 液体 液体 固定相 固体 液—液层析法 液层析法 液— 固层析法 气体 气—液层析法 液层析法 气— 固层析法
按层析原理分类
例： Sephadex G-50： ：
对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量 为 对多肽及蛋白质的筛分范围 分子量)为: 分子量 1500 – 30000
Sephadex G-200： ：
对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量 为 对多肽及蛋白质的筛分范围 分子量)为: 分子量 5000 – 80000
B. 琼脂糖凝胶wk.baidu.com
制备： 制备：
将干胶颗粒悬浮于5 将干胶颗粒悬浮于 ~ 10倍的蒸馏水或洗脱液中 倍的蒸馏水或洗脱液中 充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去 充分溶胀，
3. 凝胶装柱
①柱固定于架子上，垂直放置，关住出口 柱固定于架子上，垂直放置， 开始下沉， ②自顶部缓缓加入葡聚糖悬液，使G-50 开始下沉， 自顶部缓缓加入葡聚糖悬液， 至1 ~2cm时，打开出口 时 ③凝胶逐层上升，至顶部 2-3cm时，关闭出口 凝胶逐层上升， 时
按操作形式不同分类
名称 柱层析法 操作形式 固定相装于层析柱内， 固定相装于层析柱内，使样品沿着一个方 向前移而达分离的层析法， 向前移而达分离的层析法，包括一般柱层 析法、 析法、毛细管层析法和微粒填充柱层析法
平面层析法 层析过程在固定相构成的平面层内进行的 层析法，包括纸层析法、 层析法，包括纸层析法、薄层层析法和薄 膜层析法
三、实验操作
1. 柱的选择 直径： 直径： 1~5 cm 一般长度： 一般长度：直径 = 10：1 ~ 20：1 ： ： 本实验玻柱： 直径0.8~ 1.5cm 本实验玻柱： 直径 长度 17~ 20cm
2. 凝胶选择、制备 凝胶选择、 血红蛋白 溶菌酶 分离 （64500） （11400） ） ） 选择 Sephadex G-50 Sephadex G-50： ： 对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量 分子量)为 对多肽及蛋白质的筛分范围 分子量 为: 1500 – 30000
2. 层析技术（色谱技术） 层析技术（色谱技术）
是利用混合物中各组分的理化性质差异（ 是利用混合物中各组分的理化性质差异（吸附 力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲 溶解度、分子形状和大小、分子极性、 和力等）建立起来的技术。 和力等）建立起来的技术。
（1）层析系统的基本组成 ）
固定相 + 流动相
6. 洗脱
当此少量蒸馏水接近流干时， ① 当此少量蒸馏水接近流干时，反复多次加入蒸 馏水，进行洗脱， 馏水，进行洗脱，直到两带分开 ② 检查 在层析床中色带位置，待Hb洗脱完后， 检查Hb在层析床中色带位置 在层析床中色带位置， 洗脱完后， 洗脱完后 用试管分步收集洗脱液 ③ 10d/管，每管加 管 每管加NaOH 2d，CuSO4 2d ， 检查溶菌酶洗脱情况，若为紫色，则为（ ） ④ 检查溶菌酶洗脱情况，若为紫色，则为（+）
名称 原理 吸附层析法 固定相为固体吸附剂，利用各组分在吸附 固定相为固体吸附剂， 剂表面吸附能力不同而分离 分配层析法 各组分在流动相和固相中的分配系数不同 固定相是离子交换剂， 离子交换层 固定相是离子交换剂，各组分与离子交换 析法 剂亲和力不同而分离 亲和层析法 固定相只能与一种待分离组分专一结合， 固定相只能与一种待分离组分专一结合， 以此和无亲和力的其它组分分离 凝胶层析法 固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不 固定相是多孔凝胶， 同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同
实验一 凝胶过滤层析法分离蛋白质
一、 实验目的
1.掌握凝胶过滤层析法的基本原理； 掌握凝胶过滤层析法的基本原理； 掌握凝胶过滤层析法的基本原理 2.掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程。 掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程。 掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程
二、 实验原理
1. 常用生化实验技术
分光光度技术 电泳技术 离心技术 层析技术
生物化学与分子生物学实验
带教: 张学礼、 带教 张学礼、戴薇薇 龚张斌、 龚张斌、黎志萍
实验课要求
试剂用后及时归位 及时记录实验结果 按时完成实验报告 离开时做好清洁工作
实验报告的书写
标题日期 一、实验目的 二、实验原理 三、操作步骤 四、实验结果 五、分析讨论
实验基本操作
一、玻璃仪器的洗涤 二、吸量管及微量取样器的使用 三、溶液的混匀 四、离心机的使用
又名分子筛过滤， 又名分子筛过滤，排阻层析
（2）凝胶的特点
属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱， 属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条 件较温和，可在相当广的温度范围内进行， 件较温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要 有机溶剂，对于高分子物质有很好的分离效果。 有机溶剂， 交联葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶
双缩脲反应） 缩二脲反应 （双缩脲反应）
O
O CuSO4 碱性 紫 红色
H2N - C - NH - C - NH2
肽键
四、实验结果
绘制洗脱结果示意图， 绘制洗脱结果示意图，并分析所得结果
五、讨论
下次实验： 下次实验：
《碱性磷酸酶的提取及其比活性的测定》 碱性磷酸酶的提取及其比活性的测定》 时间： 月 日上午 日上午9： 开始 时间：4月18日上午 ：00开始
（3）凝胶的选择 多孔网孔结构 A. 葡聚糖凝胶 (商品名 Sephadex，Dextran) 商品名: 商品名 ， 型号: 型号: G-10 – G-200
吸水能力， 干胶吸水量的10倍 吸水能力，每g干胶吸水量的 倍 干胶吸水量的 数字愈小,交联度越大 被筛分物质的分子量也愈小 数字愈小 交联度越大,被筛分物质的分子量也愈小 交联度越大
注意点： 注意点：
垂直放置 防止气泡产生 防止柱的分层
4. 平衡
放置一段时间， 分钟（ 放置一段时间，约40分钟（使凝胶更好的压实） 分钟 使凝胶更好的压实）
注意： 注意：
防止床面干涸， 防止床面干涸，可适当补充蒸馏水
5. 加样
加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出， ① 加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出，正好露 出床面时，立即关闭出口（将干未干） 出床面时，立即关闭出口（将干未干） ② 用滴管将混合样品(0.6ml，即血红蛋白和溶菌酶 用滴管将混合样品 ， 各0.3ml)缓缓沿柱内壁小心加于床表面 缓缓沿柱内壁小心加于床表面 打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出, ③ 打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出 立即加入1~2倍于样品体积的蒸馏水 倍于样品体积的蒸馏水 立即加入