生物信息学序列分析生物信息学常用软件及其使用优秀课件

❖ 引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右，当然由于模 板序列本身的组成决定其Tm值可能偏低或偏高，可根据具 体情况灵活运用。
❖ ΔG值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个重要的引 物评价指标。
❖ 一般情况下，在Oligo 5.0软件的ΔG值窗口中，引物的ΔG值 最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间部分ΔG值较高，而3’端 ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对 值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。
DNA的一类内切酶。即一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸 序列的DNA水解酶。
是细菌内存在的保护性酶。分为I、II、III三类。
其中的II类限制性核酸内切酶是重组DNA技术中的重 要工具酶。
II类酶识别序列特点为回文结构，大多为 4~6 bp 回 文结构（palindrome sequence），
❖ 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生 引物二聚体带，且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能 进行。
❖ 对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别 序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识 别序列，以有利于以后的工作。
（四）、引物设计软件的使用
生物信息学序列分析生物信息学常用 软件及其使用
一、DNA 序列片断拼接
（电子基因克隆）
❖ 获得感兴趣的EST，在dbEST数据库中找出EST的最有途径是寻 找同源序列，标准：长度≥100bp，同源性50%以上、85%以 下。
❖ 然后将检出序列组装为重叠群（contig），以此重叠群为被检 序列，重复进行BLAST检索与序列组装，延伸重叠样系列，重 复以上过程，直到没有更多的重叠EST检出或者说重叠群序列 不能继续延伸，有时可获得全长的基因编码序列。
Hind Ⅰ Hind Ⅱ Hind Ⅲ Hind Ⅳ
常用的限制性核酸内切酶酶切序列
限制酶 识别序列及切口 限制酶 识别序列及切口
Alu Ⅰ AG/CT
TC/GA
Hind Ⅲ A/AGCTT
TTCGA/A
BamHⅠ G/GATCC
CCGAG/G
SalⅠ G/TCGAC
CAGCT/G
BglⅠ A/GATCT
TCTAG/A
SmaⅠ CCC/GGG
GGG/CCC
EcoRⅠ G/AATTC
CTTAA/G
sticky end
5’
3’
EcoRⅠ GAATTC
CTTAAG
3’
5’
blunt end
5’
3’
SmaⅠ CCCGGG
GGGCCC
3’
5’
5’
3’
5’
3’
G
AATTC
CTTAA
G
3’
5’
3
5’
5’
3’ 5’
如EcoRI 识别序列：
n5’GAATTC 3’ 3’CTTAAG 5’
5’GGATCC 3’ 3’CCTAGG 5’
限制性核酸内切酶命名
❖Smith和Nathame命名原则（1973）
属名 + 种名 + 株名 + 流水 例如： 流感噬血杆菌d株
（Haemophilus influengae d）
（包括杂交探针设计）
（一）引物设计的原则 引物要跟模板紧密结合； 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在； 引物不能在别的非目的位点引起高效DNA聚合反应(即错配)。
（二）引物设计需要考虑的因素
❖ 引物长度（primer length）， ❖ 产物长度（product length）， ❖ 序列Tm值 (melting temperature)， ❖ ΔG值(internal stability)， ❖ 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）， ❖ 错误引发位点（false priming site）， ❖ 引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物 进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。
❖ 再与GeneBank核酸数据库进行相似性检测，假如有精确匹配 基因，将EST序列数据据EST六种阅读框翻译成蛋白质，接着 与蛋白质序列数据库进行比较分析。
v Vector NTI 5.2 中的contig Express v Contig Express软件： v Sequencer软件：
ftp:///pub/SequencherPC.zip
（三）引物设计要点
❖ 一般引物的长度为15-30bp，常用的长度为18-24bp，过长 或过短都不合适。
❖ 引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发 效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一 些。
❖ 引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反 应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
3’
CCC GGG
GGG CCC
3’
5’ 3’
5’
v利用NEB Lab在线免费软件分析：
/NEBcutter2/index.php
❖DNAStar、DNAClub、DNATool 等其他商业软件均能分析。 以DNAClub为例说明。
四、PCR 引物设计
❖ 推荐使用自动搜索软件（商业软件）： Primer Premier 5.0
❖ 推荐使用引物评价软件（商业软件） ：Oligo 6 网址：
OLIGO 6.0 PCR 引物设计
设计引物的免费在线软件Pr Chromas软件：
.au/chromas230.exe
三、限制性核酸内切酶位点的分析
（一）定义：
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链
❖ 其原理，引物与模板应具有较高的结合能量，这样有利于引 物与模板序列的整合，因此5’端与中间段的ΔG值应较高，而 3’端ΔG值影响DNA聚合酶对模板DNA的解链，过高则不利 于这一步骤。
❖ 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相 似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要 高过100，最好没有错误引发位点，如此可以保证不出非目的 产物的假带。