花粉、花药培养及胚胎培养
植物组织培养技术 四
（二）离体胚形态发生及影响因素
1. 离体胚形态发生 （1）正常胚胎发育：成熟胚在适宜的培养条件下，
维持胚的生长进行正常的胚胎发育过程，直至 形成再生植株。 （2）胚性发育：幼胚生长增大至正常胚大小甚至 超过正常胚，但不能萌发成幼苗。可通过提高 培养基渗透压进行调整，也可以用生长素或天
（3）早熟萌发 ：幼胚在培养中越过正常胚发育阶 段，在未达到生理和形态成熟时迅速萌发长成幼 苗，这一现象称为早熟萌发。这样产生的苗往往 畸形、细弱、难易成活。因此，幼胚培养应防止 早熟萌发。
• 花粉培养来说，需制备花粉外植体： ①自然释放法。 ②研磨过滤收集法。 ③机械游离法。 ④磁拌法。
二、植株再分化 （一）脱分化培养
1. 培养方式的选择 2. 基本培养基的选择 3. 培养温度的选择 4. 生长调节物质的选择 5. 碳源的选择 6. 其他添加成分
1. 培养方式的选择
（1）固体平板培养：固体培养基上进行培养 （2）液体培养：在液体培养基表面进行培养 （3）双层培养 ：在固体——液体双层培养基进行
内发发育时不见光的，但是到萌发时器需要光。 光有利于胚芽生长，黑暗有利于胚根生长，因此， 以光暗交替培养更佳。 （4）培养材料
材料基因型不同，胚培养的难易程度也不同。 发育阶段以越幼嫩的胚越难以培养。 （5） 胚乳的看护培养
三、植物胚乳培养
（一）胚乳培养方法和培养后代特 征
1. 胚乳培养方法
（1）外植体取材：取待胚乳细胞的种子（或果实） 表面灭菌后，无菌条件下剥离胚乳组织接种。
3. 染色体数目鉴定 采用涂片法(或压片法)和去壁低渗法，通过检
查根尖或茎尖染色体数目，排除嵌合体的干扰， 可同时对根尖以外的细胞，如嫩叶细胞、花粉母 细胞等的染色体进行观察。
第六章植物的花药与花粉培养
三、单倍体育种的应用 ① 缩短育种年限，加速F1代杂合体的纯化。 ②利用单倍体易于检测突变和恢复重组，发现隐性突变体， 研究遗传分析的良好技术。 ③对于二倍体植物加倍变成四倍体或倍数更高的多倍体，可 以改善原来植物的某些经济性状，满足人类的要求。 ④对异花授粉植物的单倍体植株进行加倍，可迅速获得自交 系，免去人工自交的过程，节省大量的时间和人力。
孤雌生殖：由胚囊中未受精的卵细胞发育成胚，进一步发育成单倍体 植物。
孤雄生殖：在传粉后卵细胞退化消失，由精细胞单性发育成为单倍体 植物。
无融合生殖：由胚囊中卵细胞以外的其它细胞，发育成的 单倍体植株。如反足细胞、助细胞等。 人工诱发单倍体： 途径：
1966年前: 人工生产单倍体方法，有激素处理、远缘杂交、 延迟受粉、用照射花粉授粉。 B. 目前: ⑴离体花粉或花药培养，诱发小孢子单性发育成单倍体植物。 ⑵离体培养未受精的子房和胚珠，诱导卵细胞单性发育成植物 体。
一、花药和花粉培养的概念
1. 花药培养的概念：是指将花粉发育到一定
阶段的完整花药接种到培养基上，诱导形成
单倍体再生植株的技术。
2. 花粉培养的概念：是指将离体的花粉粒接 种到培养基上，诱导形成单倍体再生植株的 技术。
二、 花药和花粉培养的意义
研究减数分裂，花粉生长机制的生理、生化、遗
传等基础理论的最好方法
快速获得纯合二倍体植株（纯系） 有利于尽早淘汰隐性的有害个体，筛选出具有优
良性状的个体
第二节 单倍体的概念及发生方式
一、植物单倍体的概念
1、单倍体（Haploid）： 指具有配子体染色体组的孢子体。 2、单倍体细胞： 具有体细胞一半染色体的细胞。 3、单倍体植株： 单倍体细胞在离体条件下进行培养，使其发育成植株。 二、单倍体的发生方式
花药和花粉培养课件
合理使用
合理使用实验成果，避免侵犯他人的知识产 权，确保实验成果的合法使用和传播。
应用领域拓展
花药和花粉培养技术的应用范围将进一步 拓展，不仅局限于育种领域，还可应用于
生物制药、生物能源等领域。
遗传稳定性研究
将深入研究遗传稳定性问题，寻求解决染 色体变异的有效方法，获得遗传一致的纯 种。
政策支持
随着科技的不断进步和社会对生物技术的 关注度提高，政府将出台更多政策支持花 药和花粉培养技术的发展和应用。
发展历程与现状
发展历程
花药和花粉培养技术自20世纪50年代开始发展，经过多年的研究和实践，技术不断改 进和完善。目前，该技术在许多植物中已经获得成功应用，并取得了一系列重要的研究
成果。
现状
目前，花药和花粉培养已经成为植物繁殖和育种的重要手段之一。在许多领域，如园艺 、农作物、林业等，该技术已经得到了广泛应用。同时，随着基因组学、分子生物学等 学科的发展，花药和花粉培养技术也在不断改进和创新，为植物的遗传改良和新品种的
花药和花粉培养课件
目录
CONTENTS
• 花药和花粉培养的基本概念 • 花药和花粉培养的技术与方法 • 花药和花粉培养的应用与实例 • 花药和花粉培养的挑战与前景 • 实验设计与操作技巧 • 相关法律法规与伦理问题
01 花药和花粉培养的基本概 念
定义与分类
定义
花药和花粉培养是指通过人工方法，将植物的花药和花粉进行离体培养，使其 发育成单倍体植株的过程。
濒危植物保护
利用花药和花粉培养技术，成功保存了濒危植物的种质资源，为植物多样性的保 护和可持续利用提供了有效途径。
04 花药和花粉培养的挑战与 前景
当前面临的挑战
技术难度大
第6章 花粉与花药的培养
花粉的培养
一、材料的预处理
花粉经过预处理不但有利于改变正常的发育途径，而 且还可以促进花粉植株的形成。 处理方法： 处理方法： 1. 低温处理 花蕾剪下放入水中，在4~5℃下保持3~4d。 2. 重力的作用 在烟草花粉培养中，在从花蕾中取出花药 前1h，在5℃条件下进行低温离心机离心，可提高单倍体 的诱导率。
花药的培养
第二节 花药培养 一、培养基的选择 二、花药材料的选择 三、材料的处理与培养 四、花粉发育途径
花药的培养
一、培养基的选择
基本培养基： MS、N6、B5等 诱导愈伤组织的培养基：添加2，4-D(1~3mg/L ) 。 诱导愈伤组织的培养基： 分化培养基： 分化培养基：添加6-BA ( 2~3mg／L )和IAA (0.2~0.5mg／L) 生根培养基： 生根培养基：单独添加生长素(0.5~lmg／L)。
第二节 花粉的培养
花粉培养是指把花粉从花药中分离出来， 花粉培养是指把花粉从花药中分离出来， 以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。 以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。 由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤 组织或胚状体发育成的植株都是单倍体植株。且 不受花药的药隔、药壁、花丝等体细胞的干扰。 但缺点是培养难度大。
花药的培养
四、花粉的发育过程
1. 营养细胞发育途径 由营养细胞经多次分裂增生形成愈伤组织或胚状体， 由营养细胞经多次分裂增生形成愈伤组织或胚状体， 进而分化成再生植株。 进而分化成再生植株。 2. 生殖细胞发育途径 由生殖核经多次分裂发育形成愈伤组织或胚状体， 由生殖核经多次分裂发育形成愈伤组织或胚状体， 进而分化成再生植株。 进而分化成再生植株。
花粉的培养
三、培养基成分 基本培养基选用Nitsch培养基 培养基 基本培养基选用 培养基中可添加一些物质，诸如硝酸钙、 硫酸、柠檬酸铁、酵母浸出液和椰子胚乳等， 有促进生长的作用。
11.6 花粉和花药培养的比较
花粉和花药培养的比较花药和花粉培养：指在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化、最终发育成完整植株。
该发育途径被称为“花粉孢子体发育途径”或“雄核发育”。
小麦花药胚状体发生一、植物花药和花粉培养的概念（一）花药培养通过无菌操作技术，把发育到一定阶段的花药，接种在人工培养基上，进行诱导、分化，最终形成完整植株的技术。
草莓花药愈伤组织,花药植株（二）花粉培养将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养，也叫小孢子培养。
1964年：Guha&Maheshwari南洋金花花药培养发育成胚；1967年：Bourgin&Nitsch花药培养获得烟草植株；1973年：我国首次报道了小麦花药培养获得再生植株；目前：许多农作物及经济植物通过花粉培养都能诱导成植株。
二、花药培养历史通过花药培养育成的甜椒新品种：海花三号相同点：培养目的相同，均获得小孢子植株。
不同点：（一）花药培养离体操作技术简单，而且，药壁组织有时可作为条件因子促进小孢子的发育。
辣椒花药吊竹花粉粒三、两者的异同点花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产量高。
但技术更复杂。
（二）花药培养属于组织培养；而花粉培养属于细胞培养。
1.花药培养容易受药壁、花丝、药隔等体细胞组织的影响，再生的植株中会出现不同倍性的个体，所以花药培养在诱导单倍体方面有一定的局限性，而分离的花粉粒培养可以克服这一不足。
2.由于去除了药壁和其它连接组织的干扰，因此能更好地调节控制雄核发育的各种因子，而且能直接从单细胞开始观察整个雄核发育的过程。
四、花粉培养的优点3.花粉是真正的单细胞单倍体，均能匀质地接受各种化学的、物理的因子处理，是突变体筛选及外源基因导入研究的有用材料，对育种有很大的意义。
4.一个花药中就有成千上万个小孢子，从花粉培养能得到更多的花粉植株。
七叶树花粉粒思考题1.简述花粉和花药培养的概念；2.花粉培养的特点是什么？3.花药培养的特点是什么？参考文献与网站Thank You!。
教学目的：掌握花药培养和花粉培养技术，掌握花药和花粉培养在单倍
教学目的：掌握花药培养和花粉培养技术，掌握花药和花粉培养在单倍体育种中的重要应用，了解我国单倍体育种成就。
职业教学技能点：具有进行花药培养和花粉培养的基本能力，具有单倍体育种认知，初步具备查阅资料收集信息基础能力。
教学时间：4学时教学重点：花药培养方法，花粉培养方法，单倍体育种上应用教学难点：花药培养与花粉培养的取材时期，单倍体植物缩短育种年限教学内容：第一节花药培养和花粉培养技术一、概念1．概念花药培养其外植体是植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。
花粉培养的精确定义是：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养。
有时花粉培养也称为小孢子培养(microspore culture)。
从培养方法和技术方面来讲，它属于细胞培养的范畴。
二、花药培养首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者Guha、Maheshwari (1964, 1966)。
目前已有250多种植物花药培养成功。
目前，花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用。
花药培养可诱导花粉发育形成单倍体，快速获得纯系；缩短育种周期，利于隐性突变体筛选、提高选择效率；与二倍体融合成体-配杂种。
花药培养的基本程序是：外植体选择－外植体(花蕾)预处理—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培养（一）花药培养方法1、材料的选取：大多数植物的花药培养，成功率最高的是单核期或单核中晚期。
花粉发育时期的检测一般将植物的花药置于载玻片上压碎，加醋酸洋红1～2滴染色，再进行镜检以确定花粉发育时期。
水稻等植物的花粉，处于单核期时尚未积累淀粉，在进入三核期后的花粉开始积累淀粉，因此可用碘—碘化钾染色鉴定。
花粉发育时期与花蕾或幼穗大小、颜色等特征之间有一定的对应关系。
花药培养的成功与供试材料的遗传背景、供试材料的生理状态、花粉的发育时期有关。
花粉发育时期图示如下：四分体—小孢子—单核花粉—双核花粉最适期2、材料与处理与灭菌3-5℃低温处理3-10天-（大花蕾将萼片剥掉）-酒精几秒-0.1%升汞10min-无菌水冲洗。
第五章花药和花粉培养
第五章花药和花粉培养一、概况1.概念花粉培养：指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉作为外植体培养，形成花粉胚或愈伤组织，最终发育成花粉植株（单倍体）的技术.花药培养:指应用植物组织培养技术，把花粉发育到一定时期的花药接种到人工培养基上，以改变花药内花粉的发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，随后由胚状体直接发育成植株或由愈伤组织分化形成植株的培养方式异同点区别: 花药培养属于器官培养范畴，花粉培养属于细胞培养范畴共同点:在培养过程中都是花粉发育，均可获得单倍体细胞系或单倍体植株2.发展概况1964年印度Gula和Maheshwari成功地从毛叶曼陀罗花药培养获得许多胚状体，并证明胚状体直接起源于花粉粒，最终从胚状体进一步发育得到单倍体植株日本、法国、丹麦、德国等相继开展花培研究工作，目前已有10个科，24个属、34个种、250多种高等植物的花药培养获得成功花粉培养始于50年代，Tulecke首先培养银杏的成熟花粉粒得到愈伤组织，随后人们进行了很多研究，在许多植物上进行花粉培养，同时随着培养技术的逐步完善（看护培养、条件培养…)，获得愈伤组织、胚状体、有的还获得单倍体植株我国花培发展概况始于70年代，将花培与传统育种手段相结合，先后培育出一大批具有研究和应用价值的品种。
如烟草、小麦、玉米、甜椒等花培新品系、品种1974年，中科院植物所与山东烟草研究所合作，成功育成烟草新品种，并大面积推广，这是世界上第一个用单倍体方法培养出来的新品种国际公认，我国的花培工作处于国际领先水平。
我国有30多种植物进行花培试验，20多种获得了花粉植株，有一大部分是我国首创，同时在花培方法，机理等方面作了深入研究德著名学者Melchers：“花药培养起始于印度，而首先却在中国广泛应用，就花药培养的单倍体育种的应用而言，中国在世界上处于领先地位”3.意义a.基础理论研究方面研究减数分裂，花粉生长机制的重要方法用来进行生理、生化、遗传等基础理论的研究花粉粒体积小，数量多，形状、内含物成份基本一致，是比较均一的起始材料，便于在人工控制条件下研究它们的生长、分化、遗传等变化过程b.遗传育种=单倍体育种中的意义可获得纯合二倍体，大大缩短育种周期具有选择效率高的优点用于远缘杂交育种，克服杂种不育性便于隐性突变体的筛选，大大提高突变育种的工作效率二、培养方法1.途径愈伤组织再分化形成植株(脱分化到再分化，变异率提高，混倍现象明显取决于培养基中激素的种类、浓度配比) 花粉植株通过胚状体形成植株花粉植株()2.花粉培养优点:不存在体细胞干扰，没有混倍现象缺点:培养技术难度大花粉分离自然散落法：机械挤压法：优点⏹操作简便⏹适于双子叶植株，不适于禾谷类，易损伤花粉粒缺点⏹花粉中易混有体细胞⏹悬浮液中花粉密度不易控制注意：液体培养基中加蔗糖或甘露醇，调节渗透压，避免花粉吸水胀裂三、影响花培成功的因素有些难培养植物诱导频率很低，有些植物（裸子植物）至今没有获得真正的花培植株花药培养虽然是一项成功的技术，但要获得良好的效果，还需克服许多困难诱导植株成功与否以及诱导频率受多种因素影响（一）供试材料1.材料的基因型材料的遗传背景不同，诱导难易程度不同茄科番茄、蔓陀罗、烟草易成功禾本科水稻优于小麦亚种水稻粳亚种(40-80%)优于籼米亚种(2%)花药培养力是可以遗传的，且为显性或超显性2.植株的生理状态和年龄年幼植株花培成功率高开花始期成功率高烟草开花始期时花药比开花后期的更易产生花粉植株烟草开花期第6天，诱导率最高与植株的营养和生长条件有关N饥饿>高N水稻高温，高N下，诱导率下降，白化苗提高3.花粉发育时期——是影响花培成败的最关键因素之一四分体时期单核期---早、中、晚期双核期三核期#不同植物最适诱导期不同曼陀罗、烟草属、水稻---单核早期、双核期均可诱导，以单核中、晚期效果最好小麦、玉米---只有单核中期才能诱导大麦---单核晚期最佳一般采用单核中-晚期的花粉培养不同植物花培的合适花粉发育时期处于单核期的花粉培养最有利于诱导成苗小孢子发育第三期是胚胎形成的临界期，超过了这一时期胚状体就不能形成在小孢子发育过程，花药内激素水平正在不断改变，由于花药的成熟使激素平衡变得不适合，或为花粉发育所必需的其他一些养分已经耗尽，从而影响了诱导率培养前应确定花粉发育时期镜检：醋酸-洋红、I-KI染色（禾本科、茄科）、焙花青-烙矾法（木本、番茄）利用相应的形态学指标对于花培没有成功的植物最好选取花粉发育各个时期的花粉进行培养，确定最佳时期4.材料的预处理——试验证明，有几种预处理方法能有效提高诱导率低温预处理烟草：7-9℃，7-14天番茄：6-8 ℃，8-12天水稻：10℃，2-14天小麦、黑麦：1-3 ℃，2-20天常温下N饥饿预处理乙烯、高糖、离心预处理（二）培养基1.基本培养基MS应用最多，N6、B5、Nitsch也有应用不同植物种类，适用的培养基不同双子叶：Nitsch、MS十字花科、豆科：B5水稻等禾谷类：N62.碳源蔗糖应用最广，既是最好的碳源，又起调节渗透压的作用不同植物种类、不同诱导时期最适碳源浓度不同，通常以2-5%为宜烟草：2%诱导胚状体小麦：8-10%愈伤；5-8%分化水稻：4-6%愈伤；2-3%分化玉米：12-15%愈伤3.激素关键决定于激素种类、浓度、配比实例小麦：2mg/L 2.4-D 愈伤；< 2mg/L 胚状体4.其它添加物有机附加物、水解乳蛋白、水解酪蛋白、酵母提取物、肌醇、谷氨酰胺等活性炭（0.5-1%)吸附了琼脂中不利于细胞生长的某些杂质吸附了培养基高压灭菌蔗糖产生5-羟甲基糠醛吸附了激素，降低了激素水平（三）培养方法和培养条件1.材料的接种保证完全无菌条件、注意接种密度（104-105粒/ml为好），花药组织分泌的活性物质相互作用有利于诱导密度太高，养分消耗太快；密度太低，诱导率下降。
植物组织培养第五章 花药和花粉培养
殖，它的花粉给不育系授粉，能使不育系当代结实
并在F1代恢复育性正常的品系。是杂交种子的父本。
不育系（母本）×同型保持系（父本） ↓ 不育系（母本）×恢复系（父本） ↓
F1代种子—生产上杂交种子
1、克服后代分离、缩短育种年限 常规育种中，杂交F2代起会出现性状分离，到 F6代才开始选择，育成一个品种需8-10年。单倍 体育种将F1或F2代花药进行培养，对所获得的单 倍体植株进行加倍处理，获得稳定的纯合二倍体， 下一代植株性状基本稳定，育种只需3-5年。
（二）花粉培养
1．取材时期的确定 四分体—单核早期—单核晚期—双核早期—双核晚期—三核期 小孢子 花粉培养 花粉粒 花药培养
2、花粉预处理
低温处理花蕾，或单核后期离心预处理。
3、花粉分离
适合的花蕾-消毒-取出花药-烧杯壁中挤压花 药-尼龙网过滤-花粉液离心-花粉粒沉淀-培养基 稀释-纯净花粉群体。
C途径：在获得的花粉植株群体中，除单倍 体外，常有相当比例的二倍体、三倍体、四倍 体、非整倍体等非单倍体植株，即小孢子培养 过程中自发加倍现象。此途径中，生殖核与营 养核共同参与了花粉植株的形成。`Fra bibliotek2、B途径
小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成两个 大小相近的细胞（或游离核）。以后，由这两个细 胞连续分裂产生单一类细胞组成的多细胞花粉或多 核花粉。 （二）雄核发育的启动机理（不讲）
（一）花药培养方法 1、材料的选取
大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的是
单核期或单核中晚期。
花粉的发育时期：
四分体 — 小孢子 — 单核花粉 — 双核花粉
最适期
2、材料与处理与灭菌
3-5℃低温处理3-10天-（大花蕾将萼片剥掉） -酒精几秒-0.1%升汞10min-无菌水冲洗。 3、接种培养 镊子剥去花瓣-花药均匀接种于培养基上，常 用培养基MS、N6和马铃薯培养基。 蔗糖5-10%，20-30℃，光照12h。
花粉与花药的培养
湿度调节
保持培养环境适宜的湿度，防 止培养基干燥或过于潮湿影响
花粉的生长。
培养方法
将处理好的花粉均匀撒在培养 基表面，然后进行密封培养， 定期观察并记录生长情况。
生长过程观察与记录
生长情况观察
定期观察花粉的萌发、生 长情况，包括萌发率、生 长速度、生长形态等指标。
数据记录与分析
详细记录观察结果，对数 据进行统计分析，了解花 粉生长的规律及影响因素。
湿度对培养的影响及优化策略
湿度对花粉萌发的影响
01
适宜的湿度可以促进花粉萌发，过高或过低的湿度则会抑制花
粉萌发。
湿度对花药开裂的影响
02
适宜的湿度可以促进花药开裂，释放花粉，但过高的湿度也会
导致花粉失活。
优化策略
03
根据植物种类和生长环境，调整培养湿度，使其处于适宜花粉
萌发和花药开裂的范围内。
其他因素对培养的影响及优化策略
生长异常处理
如发现花粉生长异常或污 染等情况，及时进行处理 并调整培养条件，以保证 实验的顺利进行。
03
花药培养
花药来源与选择
适宜的花药来源
选择健康、无病虫害的植物作为 花药来源，确保花药的遗传品质 和生理活性。
花药的选择时期
在植物生长的适宜时期采集花药 ，通常是花朵刚开放或即将开放 时，此时花药内的花粉发育成熟 ，易于培养。
培养基的配制
按照一定比例将各种成分混合均 匀，调节pH值至适宜范围，然后 进行灭菌处理。
培养条件与方法
01
02
03
04
温度控制
保持适宜的培养温度，一般为 25℃左右，避免过高或过低的 温度对花粉生长产生不良影响。
光照条件
园艺植物育种学(9.13)--植物离体培养育种
第八章 植物离体培养育种一、名词解释1.植物离体培养：即广义的植物组织培养（Plant tissue culture），是指通过无菌操作，将植物的组织、器官、细胞以及原生质体等接种于人工配制的培养基上在人工控制的环境条件下进行培养，以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他生物产品的一种技术。
2．组织培养：以植物各部分组织为外植体的离体培养技术。
如分生组织、形成层组织、表皮组织、薄壁组织等。
3.器官培养：以植物的某一器官的全部或部分或器官原基作为外植体的离体培养技术。
如根尖、茎尖、茎段、叶片等。
4.花粉培养：指以未成熟花粉作为外植体的离体培养技术。
又称游离小孢子培养。
5.花药培养：指以未成熟花药作为外植体的离体培养技术。
6.单倍体植物：指具有配子染色体数的植物。
7.细胞培养：指以能保持较好分散性的单细胞或很小的细胞团作为外植体的离体培养技术。
8.原生质体培养：指以除去细胞壁而获得的原生质体作为外植体的离体培养技术。
9.体细胞杂交：指使不同的原生质体相互融合形成杂种细胞，再经过人工培养诱导杂种细胞分化形成植株的过程。
二、问答题1.植物离体培养有哪些主要类型？（1）胚胎培养 （embryo culture）（2）组织培养（tissue culture）（3）器官培养（organ culture）（4）花粉培养与花药培养（pollen and anther culture）（5）细胞培养（cell culture）（6）原生质体培养（protoplast culture）2.试述植物离体培养技术在园艺植物育种上的应用。
（1）扩大变异范围；（2）克服远缘杂交的一些障碍；（3）获得体细胞杂种；（4）倍性控制；（5）突变的诱导和立题选择；（6）加速亲本材料的纯化；（7）快速无性繁殖；（8）获得脱毒苗；（9）种质资源的试管保存；（10）可作为外源基因转化的受体系统。
3.试述植物组织培养的步骤和方法。
（1）无菌培养的建立（2）营养繁殖体的增殖（3）生根（4）试管苗移栽大田4. 简述单倍体在园艺植物育种上的应用。
第六章花药和花粉培养
可能机理：细胞均等分裂 保持花粉活力
离心预处理（Tanaka 1973） 乙烯利处理（Bennett， Hughes 1972） 高温处理（Chuong， Bersdorf 1985） 甘露醇处理（卫志明 1986） 射线处理
预处理目的：
是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子 体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜 力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加。
二、单倍体植物在生产实践中的价值
1. 筛选到纯合二倍体，后代性状不分离。提高常规育种的 选择效率，缩短育种年限，提高育种效率。
2. 单倍体植株中由隐性基因控制的性状，虽经染色体加倍, 但由于没有显性基因的掩盖而容易显现
3. 转基因技术中单倍体植株用作受体，可获得稳定的转基 因植株
4. 有单倍体获得的纯合二倍体可用于遗传变异规律的研究， 基因定位，性状分子标记等
组。如果原物种本身为多倍体，那么它的单倍体 的体细胞中含有的染色体组数一定多于一个。如 四倍体水稻的单倍含两个染色体组，六倍体小麦 的单倍体含三个染色体组。
• 单倍体育种：指将具有单倍染色体的植株， 经人工染色体加倍，使其成为纯合二倍体， 从中筛选出优良个体，直接繁育出新品种， 或选出单一优良性状的个体，作为杂交育 种的原始材料。
• 2、影响花药培养成功率的因素 ① 供体的基因型 ② 供体植株的生理状况
开花早期、长势好、长期氮饥饿、高海拔、高纬度情况 下花粉的培养成功率高，
③ 花粉的发育时期
多数植物单核中、晚期花粉最易诱导
不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期
发育时期
物种
减数分裂期
草莓、番茄
园艺植物组织培养
器官发生型(organogenesis type)：
▪ 诱导器官外植体产生愈伤组织，经分化培
养形成芽、根再生成植株的方式。 ▪ 技术关键：外植体诱导产生的愈伤组织要早
期挑选，使其来源尽量一致。 ▪ 特点：繁殖速度快；培养经愈伤组织阶段再
生成植株，遗传性不稳定，易产生变异。
芦荟、烟草、油菜等
无菌母株制备
▪ 优点：繁殖率高，速度较快；遗传性稳定。
三倍体无籽西瓜、甘蔗、香蕉、香石竹、 丝石竹等
原球茎型(protocorm type)
▪ 兰属特有的方式， 即外植体经培养产 生原球茎，再直接 长成植株。
▪ 原球茎：兰科植物组织培养中形成的一种 特殊的中间繁殖体，是呈珠粒状、由胚性 细胞组成、基部生假根、类似嫩茎的器官。 圆球茎可以增殖形成原球茎丛。
▪ 在试管内形成小鳞茎需较长时间
百合
郁金香
孢子型
▪ 用成熟或未成熟的孢子进行培养
▪ 孢子繁殖最困难的是表面消毒，萌发时 间较长
▪ 地钱
狼尾蕨
根茎型
▪ 蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为 组织培养的最佳外植体。
▪ 根状茎上产生蕨叶及根，繁殖速度较孢 子型快
▪ 肾蕨等
微枝扦插型
▪ 带芽的小插条在试管内进行无菌扦插 ▪ 为木本植物进行快速繁殖的主要方式 ▪ 葡萄、杨树
合子胚与体胚比较
合 子 心 型 胚 正 在 萌 发 的 体 胚
针叶松体细胞胚及体胚萌发生长
花椰菜体胚发育的不同阶段
菊花花瓣体细胞胚胎发生及体胚发育过程的扫描电镜观察
不定芽型（adventitious bud type)：
▪ 选取具有顶芽和腋芽的短枝 无菌培养，诱导芽萌发成苗 或增殖产生许多不定芽发育 成苗，将新萌生的枝条再转 接继代，重复芽到苗的增殖 过程，最后使其生根形成植 株的方式。
第八章 花药和花粉培养
2、物种进化研究
可探索亲本染色体组的构成。分析单倍体植 物减数分裂时，形成二价体的数目和形状，能确 定染色体组内是否存在同源染色体。
3、遗传分析
单倍体植株中基因不受显隐性的影响，每一个
基因的作用均能表现出来。能用来研究基因的性质
及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。
4、构建连锁图谱
双单倍体（DH）群体是永久性群体，能有效 地用于遗传图谱的构建。
单倍体 二倍体 AB------ --------------------> AABB aB----------------------------> aaBB Ab----------------------------> AAbb ab-- --------------------------> aabb
80年代后期到90年代期间，花培技术迅速发展。许多作物小孢子
培养已经成功。十字花科、麦类、水稻、玉米等。 90年代，一些先前被认为是不易进行小孢子培养的基因型也相续
成功Konzak (1999) 。
通过 花药 培养 育成 的甜 椒新 品种 ： 海花 三号
三、花药和花粉培养的应用
1、作物育种
1)诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期；
3、其它
包括γ射线、离心、磁场等。
（四）培养基
1.基本培养基 主要为N6和MS培养基。 MS和H培养基：适合双子叶植物花药培养； B5培养基：适合豆科和十字花科花药培养； N6培养基：适合禾谷类作物的花药培养。 Nitsch培养基:适合芸薹属和曼陀罗属。 高浓度的NH4+显著抑制花粉愈伤组织形成。 铁盐对花粉胚状体发育很重要。活性炭促进胚状体发育。
花粉离体培养时，雄核发 育最适宜的时期一般是第 一次有丝分裂或之前。
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雄配子体的发育
花粉粒形态：
花粉粒即雄配子体。为2细胞花粉或3细胞花粉
2--细胞花粉 3--细胞花粉
2、花粉发育时期的检测：
外部形态观察：在水稻中，一般叶枕距为515cm，颖片淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长 度的1/2时，可能为单核靠边期的花粉。 压片染色法：是检测花粉发育时期的简便有 效方法，常用染色剂为醋酸洋红。
1、自然加倍：花粉细胞核有丝分裂或核融合，染色体可 自然加倍，获得纯合二倍体。 2、人工加倍：用秋水仙素溶液浸苗、处理愈伤组织和用 含0.4%秋水仙素的羊毛脂涂抹单倍体植株的顶芽、腋 芽，可得到能结实的二倍体植株。 3、创伤法加倍：愈伤组织反复继代培养，可得到二倍体 植株。
五、花药和花粉培养的应用 ----单倍体植株育种
在幼苗期根据植株形态在田间用目测方法选出大部分的 单倍体。另外在解剖学上观察叶片表皮气孔、保卫细 胞的大小和数目，也可以区分单倍体和二倍体。 3.结实性：单倍体开花但不结实。
4.分子标记：AFLP（扩增片段长度多态性）、SSR（简单 重复序列）等
四、单倍体植株染色体加倍的方法
与正常植株相比，单倍体植株细弱、矮小，不 能正常授粉结实，基本是高度不育。 但是，单倍体植株一旦染色体加倍，即可恢复 正常的形态、解剖结构、遗传与生理机能，并 可获得遗传上纯合二倍体的后代，是快速培育 优良纯合系的好方法。
四、胚培养的应用
1)在远缘杂交育种中:克服杂种胚不能正常发育 2)缩短育种周期,提高育种效率 3)克服种子的自然不育性 4)提高休眠种子的萌发率 5)理论研究中的应用
果皮 糊粉层
胚乳培养
胚乳培养是指将胚乳从母体上 分离出来，在无菌的环境条件 下培养，使其生长发育形成幼 苗的过程。
胚乳
一、胚乳培养过程
胚乳培养
胚珠和子房培养
种子组成： 包括胚、胚乳和种皮三部分 胚：来源于受精卵，由胚芽、胚根、胚轴和 子叶四部分所组成。种子萌发后，胚根、胚轴
和胚芽分别形成植物的体的根、茎、叶及其过
渡区。
胚的发育
种子的结构
胚培养
胚培养：采用人工的方法将胚从种子、子房或胚珠 中分离出来，再放在无菌的条件下，让其进一步 生长发育，以至形成幼苗的过程。
二、培养基与培养条件
培养基
培养条件
三、胚乳再生植株的染色体倍数
稳定型：三倍体 畸变型：除少数是三倍体，多数是由多种倍性 细胞组成的嵌合体
四、胚乳培养的应用
1、胚乳培养可得到三倍体植株，产生无籽 果实。或加倍形成六倍体植株进行育种。 2、胚乳培养可得到倍性不同的愈伤组织， 可分离和筛选各种类型的非整倍体植株。
本章小结：
(1)花药培养是器官培养，花粉培养属细胞培养。 (2)花药培养一般选择花粉的单核期进行接种。
(3)胚胎培养包括：幼胚培养、成熟胚培养、胚珠
培养、子房培养和胚乳培养等。
(4)胚胎的培养的意义。
三倍体无籽西瓜
胚珠和子房培养
一、胚珠培养
定义：是指将胚珠从母体上 分离出来，在无菌的人工环 境条件下培养，使其生长发 育形成幼苗的过程。
倒生胚珠
胚珠培养类型：
1、受精胚珠的培养
2、未受精胚珠的培养
示胚珠的位置
（一） 胚珠培养的基本过程：
（二） 培养基：White,Nitsch,MS （三） 胚珠的发育：
第十二章 花粉、花药培养及胚胎培养
单倍体：细胞中含有正常体细胞的一半染色体数， 即具有配子染色体数目的个体。
思考题：单倍体是不是就是一倍体？ 水稻是二倍体,其单倍体是一倍体(n=x=12) 普通烟草是异源四倍体，单倍体是二倍体 （n=2x=Ts=24） 普通小麦是异源六倍体, 单倍体是三倍体 （n=3x=ABD=21）
1）玉米种子消毒 2）在黑暗条件下，将种子放在无菌湿润的含滤纸的 培养皿中培育6hr。 3）将吸涨的种子在无菌培养皿内将胚分离出来 4）无菌水冲洗3次 5）在MS培养基中暗培养。 6）观察：2d出现胚根，3-4 d出现胚芽，10d长成 幼苗。 玉米成熟胚的培养
三、培养基与培养条件
1、培养基 1）无机盐 2）糖类 3）附加成分 2、培养条件： 1）温度 2）光照 3）培养方式： 幼胚培养适于液体培养， 成熟胚适于固体培养
梯度离心前 （小孢子形态、活力不一致）
30%蔗糖梯度离心后
（获得均一的小孢子群体）
花粉培养方式
1、平板培养：花粉置琼脂固化培养基上培养。 2、液体培养：花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。 3、双层培养：花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方法： 先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。 4、看护培养：利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小 孢子发育。 5、微室培养：利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养
1、自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法) : 将花药接种在 预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。 2、挤压法：在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培 养。
3、机械游离
（1）磁搅拌法： 用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花 粉游离出来； （2）超速旋切法：通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、 穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。 4、小孢子纯化：对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过 筛、梯度离心处理纯化小孢子
本章主要内容： 花粉和花药培养技术 胚胎培养
本章教学目的与要求
(1)掌握花药培养和花粉培养的区别； (2)了解花药最佳接种时期；
(3)掌握花药培养的大致过程；
(4)掌握花粉发育的四种途径； (5)掌握胚培养和胚乳培养的操作步骤； (6)了解胚珠培养和子房培养的操作步骤。
第一节 花药和花粉培养技术
单倍体产生方法
雄核发育(Androgenesis)或孤雄生殖：卵细胞不受精，卵 核消失，或卵细胞受精前失活，由精核在卵细胞内单独发 育成单倍体，因此只含有一套雄配子染色体。这类单倍体 的发生频率很低。 雌核发育(Gynogenesis)或孤雌生殖：精核进入卵细胞后 未与卵核融合而退化，卵核未经受精而单独发育成单倍体。 无配子生殖：胚囊中卵细胞以外的细胞不经受精而发育形 成胚的生殖方式，由助细胞、反足细胞或极核等非生殖性 细胞发育成胚的现象。 人工诱发：花药、花粉（雄配子）、未授粉的子房胚珠 （雌配子）的培养。
无菌水洗3次
10％漂白粉10 min
用接种环接种 到培养基上
培养5天，花药变褐，20天后花药裂 开，长出淡黄色的花粉愈伤组织， 先长芽，后长根，形成幼苗。
花药培养脱毒技术
1974年日本：花药培养可以脱除草莓病毒； 花药采取时期
单核期：花蕾4-6mm，花药1mm 花药诱导愈伤组织培养基 MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L 增殖分化培养基 MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L 生根培养基 1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭3g/L+蔗糖20g+琼脂7g/L
（二）培养基:N6,MS
（三）培养子房的发育：
性细胞（卵细胞、助细胞、极核、反足细 胞）----胚状体或愈伤组织----单倍体植株；
体细胞（珠被、子房壁）---胚状体或愈伤 组织----二倍体植株；
三、胚珠和子房培养的应用
（一）胚珠培养的应用 1、受精胚珠培养目的： 一是打破种子的休眠； 二是挽救胚的发育，以获得杂交种。 2、未受精胚珠培养目的：获得单倍体植株。 （二）子房培养的应用 1、授粉子房培养目的：挽救杂种胚 2、未授粉子房培养目的：获得单倍体植株。
1、诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种 周期； 2、有利于筛选隐性突变体，提高选择效率; 3、有利于隐性基因控制性状的选择 4、快速获得自交系的超雄株
大大缩短育种周期
第二节 胚胎培养
胚胎培养是指将植物的胚胎与母体分离，培 养在人工的培养基上形成幼苗的过程，包括 幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培 养以及子房培养。 胚培养 本节内容
A 受精胚珠：一是形成种子；二是形成愈伤组织 B 未受精胚珠：形成单倍体植株。
雌蕊与子房的类型
二、子房培养
定义：子房培养是指将子房从 母体上分离出来，在无菌的 人工环境条件下培养，使其 生长发育形成幼苗的过程。 授粉子房的培养
类型
未授粉子房的培养
Hale Waihona Puke （一）子房培养的培养过程
1、制备外植体：在开花前后适宜时期取子房 或幼花，消毒 2、子房培养：固体或液体培养均可
（二）激素种类和浓度
细胞分裂素可促进胚状体形成； 生长素可诱导愈伤组织形成。 细胞分裂素与生长素比值高时可诱 导愈伤组织分化苗
（三）蔗糖浓度
较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织； 较低 浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗。
三、单倍体鉴定
1.细胞生物学方法：染色体计数 2.形态学和解剖学方法
一、培养类型
1、幼胚培养
2、成熟胚培养
二、培养过程：
1、幼胚培养过程：
取子房 常规表面消毒 解剖镜下，取胚珠、去珠被、取出完整幼胚。 固体培养 幼胚的发育方式： 1）胚性发育； 2）早熟发育； 3）产生愈伤组织
双组分培养基培养
2、成熟胚培养过程---以玉米成熟胚培养为例
6、条件培养基培养：利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取
物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。
二、培养基
蔗糖浓度
基本培养 基
激素种类 和浓度
（一）基本培养基：