变性梯度凝胶电泳.
变性梯度凝胶电泳
变性梯度凝胶电泳《变性梯度凝胶电泳》是一种有效的分离技术，它可以帮助科学家快速有效地分离不同类型的分子。
它和其他分离技术相比，有着独特的优势和不可替代的优势。
变性梯度凝胶电泳（DGGE）采用特殊的凝胶在不同变性环境中电泳，以有效地分离不同类型的DNA片段和蛋白质。
正常情况下，由于更多的低能量的片段的存在，特定的变性环境会吸引这些较低能量的片段，并且它们走的路程也会比较短，而其他高能量的片段则会走的路程会更长。
因此，将凝胶改变到一种低能量的片段可以吸引，而走得路程更长的片段，则可以有效地将这些片段分离开来。
DGGE的优点是它可以有效分离不同片段的DNA和蛋白质，并且可以更快地分离出更多的细小片段。
此外，由于DGGE有一个独特的低能量环境，它可以更好的区分不同的片段，而不会受到其他分离技术的限制。
另外，DGGE是一种半定量的分离技术，可以让研究者比较不同片段之间的相对含量。
除了上述优势，DGGE还具有一些缺点。
首先，由于梯度凝胶电泳系统搭建起来比较复杂，使用它来进行分离技术需要比较复杂的实验技术。
其次，由于梯度凝胶电泳系统比较复杂，对系统的调整和控制非常复杂，只有熟练的实验室人员才能处理好这些技术。
变性梯度凝胶电泳的应用非常广泛，它可以用来分离和分析不同类型的DNA片段和蛋白质，甚至可以用来检测细菌的抗药性。
它也可以用来研究基因的多样性，用于癌症和免疫系统的研究，以及对特定疾病的诊断。
最后，它也可以作为一种植物鉴定技术，用于比较不同植物类型间的分子差异。
总之，变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种有效的分离技术，它可以用于研究不同类型的DNA片段和蛋白质，还可以用于分析肿瘤细胞的分子结构，对特定疾病的诊断和植物鉴定。
它具有独特的低能量环境，可以更好的区分不同的片段，而不会受到其他分离技术的限制。
它具有快速、高效和半定量的优势，是研究DNA分子和蛋白质的有效分离技术。
变性梯度凝胶电泳技术及其在人工湿地及养殖水体中应用的研究进展
（ １ ． 南京农业 大学无锡渔业学院 ， 江苏无锡 ２ １ ４ ０ ８ １ ；
２ ． 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心／ 农业部 淡水渔业和种质资源利用重点实验室， 江苏无锡 ２ １ ４ ０ ８ １ ）
摘要 ： 简要 介绍了 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ技术的基本原理及技术路线 ， 概述 了该技术在检测 中存在 的主要优缺点并对其存在的主 要缺点进行 了技术优化 ， 重点综述了 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ技术在人工湿地及养殖水体微 生物群落 多样 性和动态性 研究 中的最新进
Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ技术是所有可 以不依赖培养指 纹技术 中应用最广
泛 的技术之一 ， 它经 常被用 来评估环境样 品 中的微 生物群落 结构， 并且 随着 相应 的环 境变 化来 决定 微生 物群 落 的动态 性 。所采 用的 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ技术与以往 的电泳技 术不 同， 它不是
将分子量不 同的 Ｄ Ｎ Ａ分 子分开 ， 而是将序列 不 同的 Ｄ Ｎ Ａ分 子分开 ， 该Ｄ Ｎ Ａ分子在 聚丙烯酰胺凝胶电泳中根据变性剂浓 度梯度 的不 同彼此之 间相 互分离 。该技术 的主要原理如 下 ： 当双链 Ｄ Ｎ Ａ分子 在含梯度 变性剂 （ 尿 素、 甲酰胺 ） 的聚丙烯
的微生物群落 ， 然后开发微生物制剂 。研究发现 ， 微生物群落 对有机物质 的矿化 和 氮、 硫、 磷 等物 质 的移 除 至关 重 要 。
一
稳定 和提高提供理论基础 ， 而此是 一个值得研 究的课题 。本
文简要概述 了 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ相 关 的原 理及 技 术路 线 ， 重 点介 绍 了 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ技术在人工湿地和养殖池塘中应用 的最新研究进展。
目前 ， 关于湿地科学 的研 究主要集 中在湿地资 源的开发
变性梯度凝胶电泳
变性梯度凝胶电泳摘要：变性梯度凝胶电泳（DenaturingGradientGelE1ectrophoresiS，DGGE）是由Fisher 和Lerman发明用于检测DNA突变的技术，其主要是基于突变型和野生型棱酸序列的不同而导致其变性浓度的差异，利用变性梯度凝胶进行分离, 该手段分辨率达一个碱基。
恒定变性凝胶电泳(CDGE)、瞬时温度梯度电泳(TTGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)是由DGGE经改进而成。
它们在突变分析上都有着重要的作用。
关键词：变性梯度凝胶电泳、恒定变性凝胶电泳、瞬时温度梯度电泳、温度梯度凝胶电泳1、前言：随着结构基因组计划接近尾声，人类基因神秘的面纱已逐步揭开，GenBank中已知基因的数目也与日俱增，各种遗传病的相关基因也了解得越来越多。
但是，在找到了候选基因后，还需要在相关的遗传病病人中进行突变检测，只有找到了相应的突变。
才能真正确定该基因与疾病的关系，从而服务于临床。
变性梯度凝胶电泳就是一种很有实用价值的突变分析方法。
该方法经改进，又发展出了恒定变性凝胶电泳(constant denaturant gel elec—trophoresis，CDGE)、瞬时温度梯度电泳(temporaltemperature gradient electrophoresis，TTGE)和温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel elec—trophoresis，TGGE)。
现在上述方法已经广泛应用于遗传病的诊断、突变分析和肿瘤相关基因的筛查等许多方面。
2、基本原理2.1变性梯度凝胶电泳由Fisher和Izrman口3于1983年创立，以后该技术和PCR技术相结合被广泛应用于各种突变分析。
它主要是利用梯度变性胶来分离DNA片段。
电泳开始时，DNA在胶中的迁移速率仅与分子太小有关，而一旦DNA泳动到某一点时，即到达该DNA变性浓度位置时，使得DNA双链开始分开，从而大大降低了迁移速率。
DGGE实验
DGGE的基本原理DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis变性梯度凝胶电泳)不是将分子量不同的DNA分开,而是通过PAGE(聚丙烯酰胺)凝胶中变性剂浓度梯度的不同,将序列不同的DNA分开。
该方法的原理是根据DNA 的解链特性,不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所要求的变性剂浓度不同,混合双链DNA在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶电泳时,当泳动到与DNA变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时,相对应的DNA发生解链变性,导致电泳迁移速率降低。
由于泳动受阻DNA分子在凝胶中的停留位置不同,从而使不同DNA分子得以分离。
根据变性剂梯度方向的不同, DGGE可分为:垂直DGGE,即变性剂梯度与电场方向垂直,常用于试验决定分离型、野生型和变异型的最佳变性剂梯度范围;平行DGGE,其变性剂的梯度和电场方向平行,主要用于解链范围明确的DNA片段的检测。
DGGE实验一．1.制胶：使用梯度胶制备装置，分别制备30%和60%的变性胶。
DGGE制胶参数制胶30%变性胶的配置20（ml）60%变性胶的配置20（ml）40%丙烯酰胺（Bis-Acr）5ml 5ml50×TAE 400ul 400ulFormamide去离子甲酰胺 2.4ml 4.8ml尿素（urea） 2.52g 5.04gDdH2O 定容至20ml 定容至20ml最后加（几分钟内凝固）10%AP(APS) 100ul 100ul TEMED 20ul 20ul试剂配方：40%丙烯酰胺（Bis-Acr）：Acrylamide 丙烯酰胺 38.93gBis-acylamide 双丙烯酰胺 1.07g蒸馏水定容至100ml50×TAE：TrisBase 242.0g冰醋酸 57.1mlEDTA o.5M PH 8.0 100ml去离子水定容至1000ml。
10%APS； Ammonium persulfate 过硫酸铵 0.1g，蒸馏水定容至1.0ml.2.灌胶具体步骤见设备说明3.点样缓冲液加热至60℃后准备点样。
TGGE变性梯度凝胶电泳DGGE-Equl
变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）变性梯度凝胶电泳（DGGE）产品说明DGGE变性梯度凝胶电泳系统包括内置式温度控制系统、可编程控电源、梯度凝胶生成器、内置式缓冲液循环泵及搅拌桨、电泳槽、梯度生成器、制胶配件及玻璃板等。
DGGE介绍：变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。
基本原理基于当双链DNA 在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。
由于变性梯度凝胶电泳法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。
DGGE原理：变性梯度凝胶电泳系统(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)的原理是使用一对特异性引物，PCR扩增微生物自然群体的16s rRNA基因，产生长度相同但序列有异的DNA片段的混合物。
然后用变性梯度凝胶电泳分离产物混合物。
变性梯度凝胶电泳DGGE胶是在6％聚丙烯酰胺胶中添加线性梯度的变性剂，变性剂的浓度由上到下，从低到高成线性梯度。
在一定温度下，在同一浓度的变性剂浓度下，序列不同的产物，其部分解链程度也不同，而产物解链程度又直接影响其电泳迁移率，结果不同的产物在凝胶上分离开来。
在引物的5’端加上40个碱基左右的G-C串可使变性梯度凝胶电泳DGGE对序列差异的分辨率提高到近100％。
所以变性梯度凝胶电泳法可用于微生物群落结构的研究、微生物种群动态的分析、富集培养物及分离物的分析、核糖体RNA同源性的分析。
DGGE操作步骤
变性梯度凝胶电泳（DGGE）的溶液配制、操作步骤及注意事项一、实验试剂及配置1、40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（37.5：1）试剂用量丙烯酰胺38.93g双丙烯酰胺 1.07gMilliQ 水加到100mL 溶液采用0.45µm滤膜过滤，储存在4℃2、0％的变性储存液凝胶梯度6％8％10％12％40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL 20mL 25mL 30mL 50×TAE缓冲液2mL 2mL 2mL 2mL MilliQ 水83mL 78mL 73mL 68mL总容积100mL 100mL 100mL 100mL3、100％的变性储存液凝胶梯度6％8％10％12％40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL 20mL 25mL 30mL 50×TAE缓冲液2mL 2mL 2mL 2mL去离子甲酰胺40mL 40mL 40mL 40mL 尿素42g 42g 42g 42g MilliQ 水加到100mL 加到100mL 加到100mL 加到100mL4、50×TAE缓冲液试剂用量终浓度Tris碱242.0g 2M冰乙酸57.1 1M 0．5M EDTA，pH8.0 100.0mL 50mM MilliQ 水加到1000.0mL将溶液混合溶解，121℃下蒸汽灭菌20-30min,储存在室温5、银染液的配制:原液：8×固定液（250 ml）：乙醇200 ml冰乙酸10mlMilliQ 水40ml（A）：1×固定液（400 ml）：8×固定液50mlMilliQ 水350ml（B）银染溶液(400ml)：AgNO3 0.8 g8×固定液50mlMilliQ 水350ml（C）：显影剂（500ml）：NaOH 7.5gMilliQ 水500 ml甲醛 1.5ml6、10％过硫酸铵（AP）：过硫酸胺0.3g超纯水 3.0ml溶解后使用0.45µm微孔滤膜过滤，4℃保存，保存时间为1周。
(完整)PCR-DGGE技术
PCR-DGGE技术一、实验原理变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最早是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变 .Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究。
后来又发展出其衍生技术,温度梯度凝胶电泳(TGGE）。
该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。
双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为取决于其分子大小和电荷.不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样,因此不能被区分.DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。
一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。
一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基组成。
当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链.当变性剂那浓度再升高依次达到其他解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。
不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域和解链区域的解链浓度也是不一样的。
当进行DGGE电泳时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样.然而一旦DNA片段迁移到一特定位置,其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。
部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧下降。
因此同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓度,因此它们会在胶中不同的位置分开.然而，一旦变性剂浓度达到DNA片段最高的解链区域变性剂浓度时，DNA片段会完全解链，成为单链DNA分子,此时他们又能在胶中继续迁移.因此如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。
变性梯度凝胶电泳技术在微生物实验教学中的应用
物多样性的Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 检测结果的重要 因素 ， 学生通过 比较不 同提取 方 法对 Ｄ Ｎ Ａ 产量 和纯 度 的影 响 ，确 定 了针 对不 同的 实验样品（ 土壤或污泥 ） 的最佳提取方法 ， 在这一过程中加 深 了对Ｄ Ｎ Ａ 提取原理和方法的认识 。通过Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 图谱的分 析 ，学 生可 以直 观地 了解 到 污染胁 迫 等环 境 条件 下微 生物 群落结构的改变及优势菌群形成的动态过程 ，更加深刻地 理 解 富集 培养技 术 在分 离特 定功 能微 生物 上 的应 用 。学生 通 过后 续 的序列 比对分 析 ，可 以学 习到相 关环 境 中常 见 的 微 生物 优势 菌 属 ，特 别 是一 些非 培养微 生 物序 列 的 出现 丰 富 了学 生对 微 生物 多样 性 的认 识 。通 常 面 向本 科 生开 设 的
、
生物 以未可培养的形式存在。Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 是一种不依赖微生物 培养 技术 的研 究方 法 ，能快 速 、准确 鉴定 环 境 中微 生物 种 群 ，在揭 示复 杂微 生物 群落 演替 规律 和 功能 基 因多 样性 方 面具 有独 特 的优越 性 ，已被 广泛 应用 于微 生 物分 子 生态 学 研 究 各领 域闭 。Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 技 术的基 本 原理 是在 聚丙 烯酰 胺凝 胶
力、 动 手能 力有 着积 极 的作用 ＿ ｌ ＿ １ 】 。 本校 非 常重 视实 验教学 改 革工 作 ，鼓励 学 生在 掌握 基 本实验技能后 ， 积极参加设计性 、 研究性实验 ， 包括院校两 级 的大学 生科 研 立项 或教 师 的研究 课题 ，并 给 予相 应 的创 新学分。 通过 该项 措施 进 一步激 发 了学 生 的学 习兴趣 ， 并 有 效提 高 了学 生 的实 验技 能 及分 析 问 题 和解 决 问题 的能 力 。 目前 微 生 物 实验 教 学 主要 包括 传 统 的微 生 物 实验 技 术 ， 随 着分 子生 物技 术 的发 展 ， 微 生 物研究 技 术 突破 了 以往 主要
变性梯度凝胶电泳DGGE实验报告
变性梯度凝胶电泳DGGE刘琳 1131428 环境科学一、 实验目的1． 学习掌握变性梯度凝胶电泳的原理和方法。
2． 练习变性梯度凝胶电泳的操作步骤。
3． 分析并掌握变性梯度凝胶电泳的思路，并了解其在微生物群落研究中的地位。
二、 实验原理双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。
不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的DNA 片段在凝胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。
DGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。
不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。
同样长度但序列不同的DNA 片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。
然而，一旦温度（或变性剂浓度）达到DNA 片段最高的解链区域温度时，DNA 片段会完全解链，成为单链DNA分子，此时它们又能在胶中继续迁移。
因此，如果不同DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。
DNA 片段在DGGE 胶中的迁移行为（如下图）：变性剂LowHigh在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（一般30-50个碱基对），使DNA 片段最高的解链区域在GC 夹子这一段序列处，它的解链温度很高，可以防止DNA 片段在DGGE/TGGE 胶中完全解链。
当加了GC 夹子后，DNA 片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开（Myers, 1985)。
DGGE 有两种电泳形式：垂直电泳和水平电泳。
垂直电泳是为了确定变性剂梯度；而水平电泳则是对比分析不同样品的微生物差异。
本次试验做的是水平电泳，主要对比分析不同样品的微生物差异。
三、 实验器材与药剂器材：DGGE system (D-Code, Bio-Rad)、移液管、移液枪、枪头、制胶设备、30ml 针筒、聚乙烯细管、电泳仪试剂：16s rDNA V3区PCR 扩增产物、胶浓度为8%变性剂浓度分别为0%和90%丙烯酰胺胶、50×TAE buffer、去离子甲酰胺、尿素、去离子水、10%过硫酸铵(Aps)、TEMED 、sDNA 染料 变性剂Low high四、实验步骤1．首先按照实验要求将50x TAE buffer稀释为1×TAE buffer，并利用90%和0%的变性胶分别配置15.5ml的35%和55%的变性胶溶液。
(新)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)
样品制备：
蛋白质样品需变性并结合SDS，形成所带负电荷相 对一致的非折叠衍生物。 四人一组，取一1.5离心管，加入30ul鼠IgG样品 和30ul样品缓冲液，混匀后沸水浴5分钟， 3000rpm离心数秒，每人取10ul加样。
电泳
连接电泳仪，选择电压为40伏，蓝色指示剂移动 至凝胶底部即停止电泳。 取出玻璃板，用保鲜膜包好，置冰箱待明日做蛋 白印渍（Western－Blotting）。
5. 上述溶液混匀后，用滴管迅速加入已制好分离 胶的玻璃板间，灌满后，小心插入梳子，静置 30分钟。 6. 待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子。小心取出玻 璃板，取掉垫条后，缺口朝内放入电泳槽主体， 插入斜楔板。 两组用一个电泳槽主体，两组玻璃板间即为上 槽。 7. 装好的电泳槽主体放入下槽，往上下槽加入 Tris－甘氨酸电极缓冲液。用滴管冲洗凝胶顶 部，并赶走底层的气泡。
制备顺序为先灌制分离胶，然后在分离胶上灌制 浓缩胶： （四人一组） 1. 在两块玻璃板间夹以垫条，用手夹住玻璃板放入 电泳槽主体内，缺口朝外，再插入斜楔板。 2. 拿一小烧杯，按下表加入各试剂： （12％分离胶） 单体溶液 4ml 分离胶缓冲液（pH8.8） 2.5ml 超纯水 3.3ml 10％SDS 100ul 10％TEMED 30ul 10%过硫酸铵 70ul
3. 上述溶液混匀后，用滴管迅速加入两玻璃板间， 灌注高度为红色背景下沿线。然后滴上少量水饱 和异丁醇，静置约15分钟。 4. 待凝胶与异丁醇出现分层时，倒去异丁醇，用洗 瓶冲洗凝胶顶部，然后拿一烧杯，按下表加入各 试剂： （4％浓缩胶） 单体溶液 0.4ml 浓缩胶缓冲液（pH6.8） 0.38ml 超纯水 2.15ml 10％SDS 30ul 10％TEMED 15ul 10%过硫酸铵 30ul
变性梯度凝胶电泳在瘤胃微生物多态性研究中的应用
的急剧下降， 从而使不同碱基序列的 Ｄ Ａ片段滞留在凝 Ｎ
胶 的不 同位 置。
２ ＤＧＧＥ技 术 的优缺 点
ＤＧ Ｇ Ｅ技术作为一种新的核酸分离 电泳技术 ， 对研 究瘤 胃微生物多态性有以下优势 ： 第一 ， 无需进行体外培 养， 直接利 用微生 物 样 品 中 的 Ｄ Ａ 或 Ｒ Ａ对 微 生 物群 Ｎ Ｎ 体加以区别， 这样不但避免了传统上耗时的厌氧分离 ， 更 可鉴定出传统方式难以培养的微生物种类 ； 第二 ， 检出率 很高 ， 即使微生物样品量极少 ， 经过 Ｐ Ｒ扩增后 ， Ｃ 也可以
的瓶颈 。随着 分子生 物 学技 术 突 飞猛进 的发 展 ， 多 国 很 内外 的研 究人员 在瘤 胃微生 态系统研 究方 面提 出了新 的 思 路和 方法 。 变性梯 度凝胶 电泳 （ ｅａ ｒ ｇＧａｉ ｔ ｅ Ｅｅｔ － Ｄ ｎｔ ｉ ｒ ｅ ｌ ｌ ｒ ｕｎ ｄ ｎ Ｇ ｃｏ ｐｏｅ ｓＤ Ｇ ） ｈｒ ｉ， Ｇ Ｅ 技术是 一种用 于检测 核酸 变异 的 电泳技 ｓ
（ 广西大学 动物科学技术学院， 广西 南宁 ５００ ） ３０ ４
摘
要 ： 绍了变性梯度凝胶电泳 （ Ｇ Ｅ 技 术的基本原理及优缺点， 介 ＤＧ ） 并综述 了国内外利用 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ技术在反 刍动物 瘤 胃
微 生物 群 落 多态性 和 动 态性 分析 方 面应 用及 其发 展 前 景 。 关键 词 ： 变性 梯 度凝 胶 电泳 ； 胃微 生 物 ； 瘤 多态性 中 图分 类 号 ：９ ８ 文 献 标识 码 ： 文章 编 号 ： ０ ８８ （０ ８ ０ — １８— ２ Ｑ３ Ａ １ １— ５ １２０ ） １ ００ ０ ０
其解链的速度和程度由其碱基序列解链温度较低的碱基
决定 ， 由于 Ｇ Ｃ碱基对比 Ａ Ｔ碱基对结合得牢 固， 因此 Ｇ Ｃ
PCRDGGE技术
PCR-DGGE技术一、实验原理变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最早是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。
Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究。
后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（TGGE）。
该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。
双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为取决于其分子大小和电荷。
不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。
DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。
一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。
一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基组成。
当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。
当变性剂那浓度再升高依次达到其他解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。
不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域和解链区域的解链浓度也是不一样的。
当进行DGGE电泳时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA 片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。
然而一旦DNA片段迁移到一特定位置，其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。
部分解链的DNA 片段在胶中的迁移速率会急剧下降。
因此同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓度，因此它们会在胶中不同的位置分开。
变性梯度凝胶电泳(DGGE)
DGGE在微生物生态学中的应用
1）广泛应用于各微生物生态系统，包括土壤 ， 活性污泥，人体和动物肠道，温泉，植物根系， 海洋，淡水湖，油藏等。绝大部分研究都是通 过扩增细菌或古细菌的 16S rRNA 基因来研究 各生态系统中的细菌或古细菌群落多样性。也 有用真菌的通用引物扩增 18S rRNA 基因 ， 从而研究真菌的群落多样性。
做DGGE注意事项
1、配置试剂时一定要用去离子水，制胶洗膜时用的 各个容器也要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污 染。 2、制胶是实验的关键，用连有聚乙烯管标有‘高浓 度’的注射器吸取所有高浓度的胶，对于低浓度的胶 操作同上，在往玻璃板中灌胶时，要匀速地转动滑轮， 将凝胶液匀速地灌入玻璃板。 3、分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统 的正确一侧固定好，注意这里一定要把位置放正确! 再将注射器的聚丙烯管同 Y 形管相连。
微生物生态学中应用的缺点
除了前面提到过的一些优缺点，分析微生物群落结构组 成是还存在以下缺点： 1、分析微生物群落结构组成时，有很多偏差。不同细菌 的基因组大小和核糖体 RNA 拷贝数不同；提取基因 组总 DNA 时细胞的裂解效率不同；DNA提取和纯化 时有偏差；PCR 扩增过程中有偏差。 2、DGGE一般只能分析 500 个碱基对以下的 DNA 片段， 因此得到的系统进化相关的信息就很少
2）能快速同时对比分析大量的样品。因此它既可以对比 分析不同的微生物群落之间的差异，也可以研究同一 个微生物群落随时间和外部环境压力的变化过程。 3）它可以跟踪监测细菌的富集和分离，从而评价不同培 养基及培养条件对分离菌种的影响 4）检测单个纯菌 rRNA 基因的微异质性；比较不同的 DNA 提取方法；另外，它还可以辅佐筛选克隆以 及检测 PCR 和克隆过程中的偏差
基因突变的检测方法
基因突变的检测方法基因突变的检测方法基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。
人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。
对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。
多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。
其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。
下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。
PCR-SSCP法PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。
其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。
由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。
用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。
应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。
Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。
变性梯度凝胶电泳在遗传性多发性外生性骨疣基因诊断中的应用
［ 摘要］ 目的 ： 采 用检 测 遗 传 性 多发 性 外 生 性 骨 疣 （ ｈ ｅ ｒ ｅ ｄ ｉ ｔ ａ ｒ ｙ ｍｕ ｌ ｔ ｉ ｐ ｌ ｅ ｅ ｘ ｏ ｓ ｔ ｏ ｓ ｅ ￥ ， ＨＭ Ｅ）患 者 Ｅ Ｘ Ｔ ２基
Ｈ Ｅ Ｈ ｏ ｎ ｇ － ｂ ｏ ，ＨＵ Ｚ ｈ ｅ ｎ ｇ － ｍａ ｏ ，Ｌ Ｉ Ｈ ｅ － ｉ ｎ ｎ ，Ｚ ＨＵ Ｙ ｏ ｎ ｇ ，
Ｓ ＨＩ Ｘｉ ａ ｏ － ｌ ｉ ｕ ，Ｌ ＥＩ Ｇｕ ａ ｎ ｇ － ｈ ｕ ａ ，Ｚ ＨＯＵ Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ — ｎ ａ ｎ ， Ｌ Ｉ Ｋ ａ ｎ ｇ — ｈ ｕ ａ
因的 突 变 ， 分析该方法的敏感性及 用于 Ｈ ＭＥ基 因 诊 断 的 可 行 性 。 方 法 ： 收 集 ５个 Ｈ ＭＥ 家 系 和 ３ 个 Ｈ ＭＥ
散发 患者 ， 利 用 变性 梯 度 凝 胶 电泳 方 法 对 Ｅ Ｘ Ｔ ２基 因 的 所 有 编 码 外 显 子 及 其 旁 侧 内含 子 序 列 进 行 检 泱 ｌ ， 并 对 出现 异 常 构 象 的 片段 进 行 Ｄ Ｎ Ａ测序 分析。结 果： 在 两 个 家 系 中 分 剐发 现 了一 种 Ａ ３ ｌ ３ Ｔ的 无 义 突
变和 一 种 ３ ｌ ９ ｉ ｎ ｓ Ｇ Ｔ的移 码 突 变 。 结论 ： 在 ＨＭ Ｅ 患 者 中发 现 了 ２ 个 Ｅ Ｘ Ｔ ２基 因 致 病 突 变 ， Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 可 作 为 基
因诊 断 理 想 的 候 选 方 法 。
［ 关键词 ］
外 生性 骨 疣 ； Ｅ Ｘ Ｔ ２基 因 ； 基 因诊 断 ； 变性 梯 度 凝 胶 电 泳 ［ 文献标识码 ］ Ａ ［ 文章编号 ］ ｌ ６ ７ ２ ． ７ ３ ４ ７（ ２ ０ ０ ７） ０ ２． ０ ３ ２ ３ ． ０ ５
分子生物学题库(附参考答案)
分子生物学题库（附参考答案）一、单选题（共100题，每题1分，共100分）1.关于切口平移法下述不正确的是A、可标记线性 DNAB、可标记松散螺旋 DNAC、可标记超螺旋 DNAD、可标记存在缺口的双链 DNAE、可标记随机引物正确答案：E2.在 pH 为下述何种范围时，Tm 值变化不明显A、pH 为 5~9B、pH 为 3~5C、pH 为 5~6D、pH 为 8~11E、pH 为 4~5正确答案：A3.关于SYBR Green Ⅰ 的描述，不正确的是A、荧光染料的成本低B、适用于任何反应体系C、操作亦比较简单D、特异性强E、不需要对引物或探针进行预先特殊的荧光标记正确答案：D4.PCR 反应过程中，退火温度通常比引物的Tm 值A、低5℃B、低15℃C、高5℃D、高15℃E、相等正确答案：A5.以下关于原癌基因说法不正确的是A、普遍存在于人类或其他动物细胞基因组中的一类基因B、在生物进化过程中不稳定C、在控制细胞生长和分化中起重要作用D、容易在多种因素作用下激活成活性形式的癌基因E、活性形式的癌基因才引起细胞癌变正确答案：B6.关于真菌，以下描述正确的是A、真菌种类繁多，其中大多数对人类有害B、浅部真菌感染对治疗有顽固性，对机体的影响相对较小C、近年真菌病的发病率有明显下降趋势D、病原性真菌根据其入侵组织部位深浅的不同分为浅部真菌和内部真菌E、真菌感染对人体的危害不大正确答案：B7.标记的参与杂交反应的核酸分子称为A、变性B、探针C、杂交D、复性E、复杂性正确答案：B8.不符合分子诊断特点的是A、灵敏度高B、特异性强C、样品获取便利D、检测对象为自体基因E、易于早期诊断正确答案：D9.在下列何种情况下可考虑进行基因连锁检测方法进行基因诊断A、基因结构变化未知B、点突变C、基因片段缺失D、表达异常E、基因片段插入正确答案：A10.关于抑癌基因的说法正确的是A、呈隐性作用方式B、抑癌基因又称为肿瘤分化抑制基因C、可以使细胞丧失生长控制和正性调控功能D、是一类可编码对肿瘤形成起促进作用的蛋白质的基因E、正常情况下促进细胞增殖、抑制细胞分化正确答案：A11.变性梯度凝胶电泳的描述中错误的是A、使 DNA 双链分子局部变性B、采用梯度变性凝胶C、变性难易由核苷酸组成决定D、突变检测率高E、可确定突变位置正确答案：E12.DNA 自动化测序技术中，不正确的荧光标记方法A、用荧光染料标记引物5’端B、用荧光染料标记引物3’-OHC、用荧光染料标记终止物D、使用一种或四种不同荧光染料标记E、使荧光染料标记的核苷酸渗入到新合成的 DNA 链中正确答案：B13.PCR 中的脱氧核苷三磷酸不包括A、dATPB、dTTPC、dCTPD、dGTPE、dUTP正确答案：E14.一种标记核酸与另一种核酸单链进行配对形成异源核酸分子的双链，这一过程称A、变性B、复杂性C、探针D、复性E、杂交正确答案：E15.珠蛋白生成障碍性贫血的主要原因是A、珠蛋白链合成速率降低B、珠蛋白基因突变导致氨基酸序列改变C、血红蛋白破坏加速D、出现异常血红蛋白 SE、铁代谢异常正确答案：A16.众多肿瘤中遗传因素最突出的一种肿瘤是A、肺癌B、肝癌C、乳腺癌D、结直肠癌E、前列腺癌正确答案：D17.为封闭非特异性杂交位点，可在预杂交液中加入A、ssDNAB、1 ×SSCC、10×SSCD、5×TBECE、50×TAE正确答案：A18.不属于脆性 X 综合征分子诊断人群的是A、有 FraX 体格或性格阳性征象者B、发育迟缓或自闭症的患者C、没有 FraX 家族史D、已明确母亲为携带者的婴儿E、未诊断的 MR 家族史正确答案：C19.病毒的遗传物质是A、DNAB、RNA 和蛋白质C、DNA 或 RNAD、RNA 和 DNAE、DNA 和蛋白质正确答案：C20.Alu家族属于A、可变数目串联重复序列B、短串联重复序列C、长散在核原件D、短散在核原件E、DNA 转座子正确答案：D21.检测融合基因、确定染色体易位的首选方法是A、FISHB、RT-PCRC、实时定量 PCRD、PCRE、DNA 芯片正确答案：D22.母亲血浆中的胎儿 DNAA、占母亲血浆总 DNA 的 50%以上B、可用于检测胎儿从母亲遗传而来的线粒体 DNA 突变C、确定RhD 阳性孕妇所怀胎儿的RhD 情况D、确定胎儿是否从母亲遗传了X 连锁的基因突变E、血友病 A 的产前诊断正确答案：C23.关于人工合成的寡核苷酸探针，下列描述不正确的是A、特异性高B、可依赖氨基酸序列推测其序列C、分子量小D、可用于相似基因顺序差异性分析E、可用末端转移酶进行5’端标记正确答案：E24.以下哪种方法是检测耐药基因突变的金标准 ( )A、PCR 技术B、荧光定量 PCR 技术C、PCR-RFLP 技术D、PCR-SSCPE、DNA 测序技术正确答案：E25.5’-末端的 DNA 探针标记主要依靠的酶是A、T4 多聚核苷酸激酶B、末端转移酶C、AKPD、DNA pol ⅠE、DNA pol正确答案：A26.第三代测序技术测定人全基因组的目标：A、30 分钟的测序时间及 5 万美元的测序价格B、3 小时的测序时间及 5 千美元的测序价格C、30 分钟的测序时间及 5 千美元的测序价格D、3 分钟的测序时间及 5 千美元的测序价格E、3 小时的测序时间及 5 万美元的测序价格正确答案：D27.GeneXpert 全自动结核杆菌检测技术现可进行哪种药物的耐药检测A、乙胺丁醇B、利福平C、链霉素D、异烟肼E、吡嗪酰胺正确答案：B28.不是自动 DNA 测序仪主要系统之一的是A、测序反应系统B、电泳系统C、荧光检测系统D、探针荧光标记系统E、电脑分析系统正确答案：D29.下列哪一种病毒的遗传物质为 RNA ( )A、乙肝病毒B、乳头瘤状病毒C、疱疹病毒D、人类免疫缺陷病毒E、腺病毒正确答案：D30.关于 TaqMan 探针技术的描述，不正确的是A、R 基团与Q 基团相距较远，淬灭不彻底，本底较高B、易受到Taq DNA 聚合酶5’→3’核酸外切酶活性的影响C、操作亦比较简单D、不需要进行寡核苷酸熔解曲线分析，减少了实验时间E、解决了荧光染料技术非特异性的缺点正确答案：C31.下列属于抑癌基因的是 ( )A、sisB、rasC、c-erb-2D、mycE、p53正确答案：E32.荧光定量 PCR 反应中，Mg2+的浓度对 Taq 酶的活性是至关重要，以 DNA 或 cDNA 为模板的 PCR 反应中最好的 Mg2+浓度是A、0.2~0.5mMB、1~2mMC、2~5mMD、6~8mME、0.5~2mM正确答案：C33.有关 HPV 描述错误的是A、核酸类型为 DNAB、结构蛋白 L1 和 L2 是包膜上的主要和次要蛋白C、HPV 对皮肤和黏膜上皮细胞具有高度亲嗜性D、病毒核酸合成主要发生在棘层和颗粒层E、大多数宫颈癌组织中病毒以整合状态存在正确答案：B34.K-ras 基因最常见的激活方式是A、插入突变B、点突变C、缺失突变D、基因扩增E、染色体重排正确答案：B35.下列 DNA 序列中的胞嘧啶易发生甲基化修饰的是A、5’-CCCCCT-3’B、5’-GGGGCC-3’C、5’-CGCGCG-3’D、5’-GCACAC-3’E、5’-CTCTCCC-3’正确答案：C36.下列哪种病毒在复制过程中可产生 RNA-DNA 杂交体A、HIVB、HPVC、HBVD、HCVE、流感病毒正确答案：A37.绝大多数β-地中海贫血系由位于第 11 号染色体上的β-珠蛋白基因中的基因突变所致，下列方法中不能用于分子生物学检验的技术是A、PCR-ASOB、PCR-RDBC、基因芯片D、多重 PCRE、MOEA-PCR正确答案：D38.多基因家族的特点描述错误的是 ( )A、由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因B、通常由于突变而失活C、假基因与有功能的基因是同源的D、所有成员均产生有功能的基因产物E、可以位于同一条染色体上正确答案：D39.关于 DNA 芯片原位合成法的描述错误的是：A、也称在片合成B、直接在芯片上用四种核苷酸合成所需探针C、包括光导原位合成法D、包括原位喷印合成法E、包括直接点样法正确答案：E40.下列方法中不能分辨野生型和突变型基因的是A、PCR-SSCPB、变性梯度凝胶电泳C、熔解曲线分析D、逆转录 PCR正确答案：D41.下列哪些技术不适用于鉴定菌种亲缘性：A、随机扩增DNA 多态性分析B、连接酶链反应C、PCR-RFLPD、多位点测序分型E、DNA 测序技术正确答案：B42.下列不是目前用于 O157：H7 型大肠埃希菌分子生物学检验方法的是A、常规 PCRB、多重 PCRC、荧光定量 PCRD、基因芯片技术E、DNA 测序正确答案：E43.未知突变的检测，下列最准确的方法是A、PCRB、RFLPC、核酸杂交D、序列测定E、ASO正确答案：D44.任意引物 PCR 的特点描述错误的是A、需预知靶基因的核苷酸序列B、通过随机引物与模板序列随机互补C、扩增后可直接得到靶基因的多态性指纹图谱D、可用于基因组 DNA 图谱构建E、可用于临床致病菌的流行病学检测、分型正确答案：A45.巢式 PCR 错误的是A、是对靶 DNA 进行二次扩增B、第二次扩增所用的模板为第一次扩增的产物C、巢式 PCR 可提高反应的灵敏度和特异性D、常用于靶基因的质和 (或) 量较低时E、第二对引物在靶序列上的位置应设计在第一对引物的外侧正确答案：E46.下列不是细菌感染性疾病分子生物学检验技术的是A、PCR-SSCPB、real-time PCRC、ELISAD、PFGEE、PAPD正确答案：C47.通过酶联级联反应检测每次核苷酸聚合所产生的ppi 的测序方法是A、化学降解法B、寡连测序C、焦磷酸测序D、边合成边测序E、双脱氧终止法正确答案：C48.以 SDA 技术检测结核杆菌时扩增靶点是A、SDAB、IS6110 和 18SrRNAC、IS6110 和 5SrRNAD、IS6110 和 16SrRNAE、IS6110 和 15SrRNA正确答案：D49.STR 法医鉴定的基础是A、基因多态性B、碱基配对原则C、蛋白质空间结构D、孟德尔遗传定律E、基因扩增技术正确答案：D50.关于 APC 基因说法不正确的是A、是一种抑癌基因B、定位于染色体 5q21 上C、通过编码 APC 蛋白发挥作用D、APC 蛋白在细胞周期进程、细胞生长调控及维持自身稳定中起着重要作用E、APC 蛋白在肿瘤发生发展的全过程中并不稳定正确答案：E51.Northern 印迹杂交可以用于A、快速确定是否存在目的基因B、不仅可以检测 DNA 样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息C、检测靶分子是 RNAD、用于基因定位分析E、用于阳性菌落的筛选正确答案：C52.描述 PCR-RFLP 技术在耐药突变检测方面错误的是：A、分型时间短B、技术简便C、突变要存在限制性内切酶酶切位点D、目前被广泛应用于耐药监测E、只能检测特定的突变位点正确答案：D53.单基因遗传病分子诊断的主要应用是A、产前诊断B、携带者筛查C、携带者诊断D、症状前诊断E、耐药基因检测正确答案：A54.结核分支杆菌的基因组特征是A、单链 DNAB、双链 DNAC、单正链 RNAD、单正链 RNA 双聚体E、单负链 RNA正确答案：B55.下列关于细菌感染性疾病的分子生物学检验说法错误的是A、可以检测不能或不易培养、生长缓慢的病原菌B、可以实现对感染细菌的广谱快速检测C、可以对细菌进行基因分型D、可以检测病原菌耐药基因E、其检验技术都是 PCR 及其衍生技术正确答案：E56.最早应用于 HLA 基因分型的方法是A、RFLP 分型技术B、PCR-SSCP 技术C、测序技术D、PCR-SSO 技术E、PCR-SSP 技术正确答案：A57.编码 HIV 衣壳蛋白的是A、gag 基因B、vif 基因C、pol 基因D、tat 基因E、env 基因正确答案：A58.关于核酸探针的种类下列不正确的是A、cDNA 探针B、寡核苷酸探针C、基因组 DNA 探针D、RNA 探针E、双链 DNA 探针正确答案：E59.下列关于引物设计的原则中，错误的是A、两条引物的Tm 值相差尽量大B、G+C 的含量应在 45%~55%之间C、尽量避免引物二聚体的出现D、反应体系中引物的浓度一般在0.1~0.2μmol/L 之间E、5’端可加修饰基团正确答案：A60.多重 PCR 的描述中正确的是：A、同一个模板，多种不同的引物B、相同的引物，多种不同的模板C、多个模板，多种引物D、引物的Tm 值、反应时间和温度、反应缓冲液等尽量不一致以区分不同产物E、同一反应内各扩增产物片段的大小应尽可能相同或接近正确答案：A61.PCR 反应体系的描述错误的是A、模板B、一条引物C、dNTPD、DNA 聚合酶E、缓冲液正确答案：B62.关于 FISH 在白血病的应用中说法正确的是A、主要用于白血病的初诊和复发的检测B、只适用于体液、组织切片标本C、FISH 只能检测处于分裂中期的细胞D、FISH 的灵敏度高于 PCRE、FISH 是检测融合基因、确定染色体易位的首选方法正确答案：A63.mtDNA 中基因数目为A、39 个B、27 个C、22 个D、37 个E、13 个正确答案：D64.硝酸纤维素膜最大的优点是( )A、本底低B、高结合力C、共价键结合D、非共价键结合E、脆性大正确答案：A65.要制订一个能够简洁准确的 DNA 测序方案，首先应考虑A、DNA 片段大小B、测序方法C、实验条件D、测序目的E、测序时间正确答案：E66.寡核苷酸探针的最大的优势是A、易分解B、易标记C、杂化分子稳定D、可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列E、易合成正确答案：D67.关于支原体的描述错误的是A、支原体是一类在无生命培养基中能独立生长繁殖的最小原核细胞微生物B、支原体有一个环状双链 DNAC、以二分裂方式进行繁殖D、其分裂与 DNA 复制同步E、解脲脲原体、人型支原体和生殖器支原体均可引起泌尿生殖道感染正确答案：D68.下列几种 DNA 分子的碱基组成比例，哪一种的Tm 值最高 ( )A、A+T=15%B、G+C=25%C、G+C=40%D、A+T=80%E、G+C=60%正确答案：A69.PCR 反应必需的成分是A、BSAB、DTTC、Tween20D、明胶E、Mg2+正确答案：E70.Southern 印迹杂交的描述正确的是A、不仅可以检测 DNA 样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息B、检测靶分子是 RNAC、用于基因定位分析D、用于阳性菌落的筛选E、用于蛋白水平的检测正确答案：A71.关于非放射性探针标记，下列描述不正确的是A、对人体危害小B、可长时间使用C、酶促显色检测最常使用的酶是碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶D、灵敏度不如放射性探针E、目前应用的非放射性标志物都是抗原正确答案：E72.作为芯片固相载体的材料描述正确的是A、主要有玻片、硅片等实性材料B、不使用硝酸纤维素膜、尼龙膜及聚丙烯膜等膜性材料C、这些载体材料不需要处理，其表面存在活性基团 (如羟基或者氨基)D、可以直接固定已经合成的寡核苷酸探针E、不需要对介质表面进行化学预处理--活化正确答案：A73.检测靶序列是 DNA 的技术是：A、Southern 杂交B、Western 杂交C、Northern 杂交D、Eastern 杂交E、杂交淋巴瘤正确答案：A74.目前的 DNA 自动化测序技术可以一次性读取的序列长度约A、50bpB、100bpC、500bpD、1000bpE、2000bp正确答案：D75.在人类基因组 DNA 序列中，DNA 甲基化主要发生在A、腺嘌呤的 N-6 位B、胞嘧啶的 N-4 位C、鸟嘌呤的 N-7 位D、胞嘧啶的 C-5 位E、鸟嘌呤的 C-5 位正确答案：D76.有关微卫星的描述正确的是A、散在重复序列的一种B、10~100bp 组成的重复单位C、主要存在于着丝粒区域，通常不被转录D、形式为 (CA) n/ (TG) n、 (AG) n、 (CAG) n 等E、又称为可变数目串联重复序列 (VNTR)正确答案：D77.关于逆转录 PCR 的描述，不正确的是A、首先应将 RNA 转化为 cDNA 才能进行 PCRB、除了使用DNA 聚合酶外，还应使用逆转录酶C、模板为 RNAD、oligo-d (T) 理论上可以将所有的 mRNA 进行逆转录反应E、逆转录酶不需要引物进行逆转录反应正确答案：E78.以下不是原癌基因的特点的是A、广泛存在于生物界，是细胞生长必不可少的B、在进化过程中，基因序列呈高度保守性C、通过表达产物 DNA 来实现功能D、在某些因素的作用下会形成能够致瘤的癌基因E、对正常细胞不仅无害，而且是细胞发育、组织再生、创伤愈合等所必需正确答案：C79.PCR-ASO 描述错误的是A、需要寡核苷酸探针B、检测点突变的技术C、PCR 产物必须电泳分离D、需正常和异常两种探针E、需严格控制杂交条件正确答案：C80.下列不是片段性突变引起原因的是A、基因重排B、碱基插入C、碱基缺失D、碱基扩增E、转录异常正确答案：E81.在核酸检测体系中加入内质控，其作用不是监控的是A、试剂失效或 Taq 酶活性降低所致的假阴性B、标本中抑制物或干扰物所致的假阴性C、样本吸取错误所致的假阴性D、仪器故障如扩增仪孔间温度差异所致的假阴性E、核酸提取效率太低所致的假阴性正确答案：C82.第一代 DNA 测序技术的核心技术是A、Sanger 的双脱氧链终止法B、Maxam 和 Gilbert 的化学降解法C、荧光标记技术D、PCR 技术E、DNA 自动分析技术正确答案：A83.目前测序读长最大的测序反应：A、边合成边测序B、化学裂解法C、双脱氧终止法D、连接测序E、焦磷酸测序正确答案：C84.以下对镰刀状红细胞贫血症叙述正确的是 ( )A、血红蛋白的β链第 6 位由谷氨酸残基变成缬氨酸残基B、血红蛋白的β链第 6 位由谷氨酸残基变成苯丙氨酸残基C、血红蛋白的β链第 6 位由谷氨酸残基变成丝氨酸残基D、血红蛋白的β链第 6 位由谷氨酸残基变成异亮氨酸残基E、血红蛋白的β链第 6 位由谷氨酸残基变成甘氨酸残基正确答案：A85.转录依赖扩增系统与其他 PCR 技术的区别是A、模板是 RNAB、模板是 DNAC、引物是 RNAD、模板和产物都是 RNAE、需要热循环正确答案：D86.HBV DNA 中最大的一个开放阅读框是A、P 基因区B、S 基因区C、X 基因区D、前 S1 基因区E、C 基因区正确答案：A87.HCV 的核酸是A、+ssRNAB、dsRNAC、dsDNAE、-ssRNA正确答案：A88.第二代测序技术一般不用到A、双脱氧链终止法B、文库接头C、高通量的并行 PCRD、高通量的并行测序反应E、高性能计算机对测序数据进行拼接和分析正确答案：A89.硝酸纤维素和PVDF 膜结合蛋白主要靠( )A、疏水作用B、氢键作用C、离子键作用D、盐键作用E、酯键作用正确答案：A90.关于梅毒螺旋体的实验室检测，下列描述正确的是A、分子生物学方法是耐药基因分析和流行学研究的首选方法B、镜检法简便，特异性高，但不能用于皮肤黏膜损害的早期诊断C、诊断梅毒的传统方法是体外培养D、血清学检查普遍用于梅毒的筛查、疗效观察和流行病学检查，对早期梅毒诊断敏感E、分子生物学方法不能早期诊断梅毒感染正确答案：A91.纯 DNA 的 A260/A280 比值为 1.8，可使比值降低的是 ( ) ：B、牛血清白蛋白C、RNAD、氯仿E、Mg2+正确答案：A92.能发出γ-射线的放射性核素是A、3HB、14CC、32PD、35SE、125I正确答案：E93.定点诱发突变可以通过以下哪个过程获得：A、PCRB、LCRC、RT-PCRD、SSCPE、ASO正确答案：A94.在人类基因组中，编码序列占的比例为A、3%B、21%C、5%D、23%E、1.5%正确答案：E95.当标本核酸量非常低难以扩增时，可采用的 PCR 技术是A、逆转录 PCRB、转录介导扩增C、原位 PCRD、巢式 PCRE、荧光 PCR正确答案：D96.聚合酶链式反应是一种A、体外特异转录 RNA 的过程B、体外翻译蛋白质的过程C、体外特异转录 DNA 的过程D、体外特异复制 DNA 的过程E、体内特异复制 DNA 的过程正确答案：C97.下列方法中能同时检测几种疟原虫混合感染的是A、竞争 PCRB、巢式 PCRC、多重 PCRD、普通 PCRE、PCR-RFLP正确答案：C98.唯一一个在结肠上皮增殖过程中起看门作用的基因是A、MCC 基因B、DCC 基因C、APC 基因D、p53 基因E、HNPCC 基因正确答案：C99.线粒体基因组与核基因组之间，下面描述不正确的是A、线粒体基因组与核基因组分别在不同的位置进行自主复制和转录，之间互不影响B、mtDNA 突变可引起编码蛋白功能障碍，影响细胞呼吸、氧化功能，进而影响核 DNA 的表达C、mtDNA 自主性复制，但复制所需的酶、调控因子等由核基因编码D、二者虽在地理位置上独立，但二者之间关系十分密切E、线粒体基因组与核基因组之间存在“交叉对话” ，相互影响，相互协调正确答案：A100.下列属于抑癌基因的是 ( )A、rasB、mycC、c-erb-2D、sisE、Rb正确答案：E。
变性梯度凝胶电泳 DGGE
变性梯度凝胶电泳Denaturing Gradient Gel Electrophoresis变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)的方法应用于探究微生物的多样性，使得DGGE技术迅速成为了一项简单、可行的微生物多样性检测手段。
DGGE技术是根据长度相同但序列不同的DNA片段特点，在含有变性剂梯度的凝胶上，因其解链的变性浓度的不同而导致迁移率不同的原理而将DNA片段分离开的一种方法。
理论上DGGE能将仅存在一个碱基差异的DNA片段分开，而实际上，其分辩率较低且操作重复性差使得该方法仍然存在一些问题。
更重要的是，随着科技的突飞猛进，DGGE技术已逐渐被高通量测序所取代。
一、试剂与仪器1. 材料1.1 实验试剂表1.1 实验试剂一览表Table 1.1 The list of reagents试剂来源或生产公司EDTA Genebase®，Genebase Gene-Tech公司去离子甲酰胺分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司十二烷基磺酸钠Genebase®，Genebase Gene-Tech公司Tris碱Genebase®，Genebase Gene-Tech公司APS Genebase®，Genebase Gene-Tech公司TEMED Genebase®，Genebase Gene-Tech公司N，N’甲叉双丙烯酰胺Genebase®，Genebase Gene-Tech公司Gel-red染色液Biouim，美国氯化钠，二氯甲烷，甲醇等江苏永华精细化学品有限公司1.2 主要仪器设备表3.2 实验仪器一览表Table 3.2 The list of instruments and equipments仪器名称来源或出厂公司DGGE电泳仪Bio-Rad公司，美国EL 104电子天平梅特勒-托利多仪器有限公司pH计梅特勒-托利多仪器有限公司-20℃低温冰箱海尔公司Milli-Q纯水系统Millipore公司，美国G-560E型旋涡混合器Eppendorf公司，德国5810D型低温冷冻离心机Eppendorf公司，德国全套微量移液器Eppendorf公司，德国1.3 相关溶剂及试剂配制(1) EDTA溶液(0.5 M，pH 8.0)：取1000 mL的烧杯加约800 mL超纯水，称取186.1 g EDTA逐量加入并用磁力搅拌器搅拌加速其溶解，随后用NaOH调节溶液的pH值至8.0，然后用1000 mL的容量瓶定容至1000 mL。
变性梯度凝胶电泳
变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳是一种比较新型的电泳技术，它可以有效地用于分离和分析复杂的蛋白质组。
变性梯度凝胶电泳的原理是建立一种特殊的梯度，使用不同的离子强度来分离和收集分子。
由于离子强度是一个逐步变化的量，可以提供不同的环境条件，从而形成分子的各种簇，并将其运转至电泳柱的不同部位。
变性梯度凝胶电泳技术主要用于蛋白质分离和分析。
它可以更好地分离具有相似分子量的蛋白质，因为它可以根据溶解度，分子大小和芳香性等其他因素来调节电泳条件来实现有效的分离。
因此，变性梯度凝胶电泳技术可以用于解决较难分离的蛋白质，因为它可以根据空间分布来分辨蛋白质，并且实验结果更精确。
另外，变性梯度凝胶电泳可以应对大量的样品，更有效地分离出病毒感染的蛋白质，便于研究蛋白质的分子结构、活性和功能等相关信息。
变性梯度凝胶电泳的实验操作非常简单，准备一个用于变性梯度凝胶电泳的实验室，需要一台变性梯度凝胶电泳仪，并准备一种特殊的凝胶，可以在改变离子强度的基础上建立梯度。
然后将样品和标准样品混合后，放入变性梯度凝胶电泳仪中，开始电泳，随着离子强度的不断改变，蛋白质分子会呈现出不同的分布状态，最后在合适的时间内收集电泳带，完成变性梯度凝胶电泳的实验。
由于变性梯度凝胶电泳技术是一种比较新型的分析技术，所以也可以用于核酸分离和定量鉴定。
这种技术可以检测DNA和RNA的结构和数目，并可以调整梯度条件以更好地分离反应物，以达到最佳测定结果。
此外，变性梯度凝胶电泳技术还可以用于生物分子组学研究，以充分发挥它的作用。
总的来说，变性梯度凝胶电泳是一种新型的分析技术，可用于蛋白质和核酸的分离、定量和分析，以及组学研究，具有习惯性，灵敏度和效率高等特点，已经成为了当今生物分析中常用的分析手段。
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4.平行变性梯度凝胶电泳
变性梯度递增的方向与电泳方向平行。根据垂直变性梯度凝胶电泳检测的解链区域的变性浓度,制备相应变性浓度的平行变性梯度凝胶,检测各标本是否存在突变。
PCR产物加上样缓冲液后,25μl~30μl/孔,电压150V,温度60℃,时间3~6小时。
实验材料
∙DNA样品
试剂、试剂盒
∙尿素
∙去离子甲酰胺
∙丙烯酰胺
∙甲叉双丙烯酰胺
∙琼脂糖
仪器、耗材
∙PCR扩增仪
∙变性梯度凝胶电泳仪
∙凝胶成像及分析系统
∙ห้องสมุดไป่ตู้外透射仪
∙高速离心机
∙电泳仪
∙电泳槽
∙微量加样器
∙Tip头
∙Tip头盒
∙Eppendorf管
∙Eppendorf管架
一、实验原理
变性梯度凝胶电泳(DGGE是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链,称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度(Tm。Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下:温度50~60 ℃,变性剂0~100%。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时,此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值,此区便开始熔解,而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变,达到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列,即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此,DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。
为了提高DGGE的突变检出率,可以人为地加入一个高熔点区——GC夹。GC夹(GC clamp就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构,这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区,使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。因此,DGGE的突变检出率可提高到接近于100%。
作为一种突变检测技术,DGGE具有如下的优点:(1突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上。(2检测片段长度可达1kb,尤其适用于100~500 bp的片段。(3非同位素性。DGGE不需同位素掺入,可避免同位素污染及对人体造成的伤害。(4操作简便、快速。DGGE一般在24小时内即可获得结果。(5重复性好。但是,该方法需要特殊的仪器,而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。
5.染色5分钟,凝胶成像仪分析结果。
四、注意事项
1、该实验中提取DNA,以及DGGE操作中接触到得很多药品都有毒,还有致癌、变性等毒害,一定要严格操作,做好防护保护自己。
2、严格按操作步骤。
二、实验用品
1.PCR扩增仪;变性梯度凝胶电泳仪;凝胶成像及分析系统;紫外透射仪;高速离心机;电泳仪;电泳槽。
2.尿素、去离子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、琼脂糖
3.微量加样器(200μl,20μl;Tip头(200μl,20μl。Tip头盒(200μl,2 0μl;Eppendorf管(0.5ml,0.2ml,Eppendorf管架。
4.PCR扩增相关试剂
三、实验步骤
1.PCR反应(同前
其中,上游引物加40bp [GC] Clamp。
2.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认。
3.垂直变性梯度凝胶电泳
变性梯度递增的方向与电泳方向垂直。所使用的胶为6%聚丙烯酰胺凝胶,变性浓度为0~100%。其中,含7 M尿素和40%去离子甲酰胺的胶为100%变性,不含尿素和去离子甲酰胺的胶为0%变性。垂直变性梯度凝胶电泳主要是检测引物的最适解链条件(即变性浓度。
变性梯度凝胶电泳(DGGE是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链,称之为变性。
核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度(Tm。Tm值主要取决于DNA
分子中GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下:温度
50~60 ℃,变性剂0~100%。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时,此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA
的低熔点区的Tm值,此区便开始熔解,而高熔点区仍为双链。这种局
部解链的DNA分子迁移率发生改变,达到分离的效果。Tm的改变依赖
于DNA序列,即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此, DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。
详细
实验方法
∙变性梯度凝胶电泳(DGGE