高效液相色谱和气相色谱的异同点

不同点：

一、流动相不同：HPLC为液体流动相，GC为永久性气体作流动相（通常叫做载

气）

二、进样器不同：高效液相为平头进样针，气相色谱为尖头进样针

三、色谱柱长不同：

（1）气相色谱柱通常几米到几十米

（气相色谱由于载气的相对分析量较低，分子间隙大，故粘度低，流动性好，组分在气相中流动速度快，因此可以增加柱长，以提高柱效）。

（2）液相色谱柱通常为几十到几百毫米

四、分析种类有差异：

气相色谱分析的对象多为（不适绝对）：分子质量小于1000，低沸点，易挥发，热稳定性好的化合物。

液相色谱：更适用于分析高沸点，难挥发，热稳定性差，分子质量较大（1000 - -2000）的液体化合物。

五：样品柱前变化不同：气相色谱的样品在柱前必须变为气体（气化室汽化），

而液相色谱的样品在柱前则无变化。

六、所用检测器有差异：

液相主要为：紫外检测器，荧光检测器、示差折光检测器.....

气相色谱主要为：氢火焰离子化检测器（FID）,热导检测器（TCD）,电子捕获检测器（ECD）,火焰光度检测器（FPD）,氮磷检测器（NPD）.....

相同点：基本原理相同。都是利用物质在流动相和固定相中的分配系数的差别，从而在两相间反复多次次，甚至更多）的分配，使原来分配系数差别很小的各组

分分（1000-1000000 离开来。，明确自身识别问题，发现异卵双生牛的天然

免疫耐受现象(1945)?Owen实验1953)提出免疫耐受理论，梅德华

(Medawar，，伯耐特(Burnet1949)提出天然抗体选择学说，完成1955)证实

胚胎期耐受理论。耶那(Jerne，完善克隆选择Talmage, 1957)& 免疫网络

学说(1974)，伯耐特等(Burnet

学说等

抗感染免疫防御(immunologic

defense)

消除炎症或衰老细胞免疫稳定(immunologic homeostasis)

控制癌变细胞免疫监视 (immunologic

surveilance)

1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称

为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较.

大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液KPa。150～3.5万施加高压。一般可达

流动相在柱的流速较经典色2. 高速：

。高效10ml/min谱快得多，一般可达1～液相色谱法所需的分析时间较之经典液相。色谱法少得多，一般少于 1h

高效：近来研究出许多新型固定3.

相，使分离效率大大提高。高灵敏度：高效液相色谱已广泛采4.

用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析灵敏度可达的灵敏度。如荧光检测器。另外，用样量小，一般几个微升。10-11g 适应围宽：气相色谱法与高效液相5.

色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应

用而高效液相色谱法，气相色谱法进行分析。只要求试样能制成溶液，而不需要气化，对于高沸点、因此不受试样挥发性的限制。以 400 相对分子量大热稳定性差、（大于上）的有机物（这些物质几乎占有机物总.

）原则上都可应用高效～ 80% 数的 75% 据统计，液相色谱法来进行分离、分析。在已知化合物中，能用气相色谱分析的

约～70占20%，而能用液相色谱分析的约占。80%高效液相色谱按其固定相的性

质可分

为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、

反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相

色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱

分离或分析各种化合物的原理基本上与相

的原理相似。其不同对应的普通液相层析之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。主要类型及其分离原理编辑本段根据分离机

制的不同，高效液相色谱

法可分为下述几种主要类型：液分配色

谱法— 1 ．液(Liquid-liquid Partition

及化学键合相色谱Chromatography).

(Chemically Bonded Phase Chromatography)

流动相和固定相都是液体。流动相与

固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当溶质在两相间进行分配。试样进入色谱柱，达到平衡时，服从于下式：cm--—溶质在固定相中浓度；式中，cs

—固定相的体溶质在流动相中的浓度；

Vs有相与GPC积；Vm—流动相的体积。LLPC大的组，K似之处，即分离的顺序取决于K中，GPC分保留值大；但也有不同之处，影K影响不大，LLPC流动相对流动相对K响较大。(Normal 液分配色谱法正相液a. —

流动相Phase liquid Chromatography):

的极性小于固定液的极性。液分配色谱法—b. 反相液(Reverse Phase liquid Chromatography):

流动相的极性大于固定液的极性。尽管液分配色谱法的缺点：—液 c.

流动相与固定相的极性要求完全不同，但. .

固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定年代末发展的化学键合70液流失。上世纪固定相（见后），可克服上述缺点。现在70~80%）。应用很广泛（固色谱法2 ．液—

流动相为液体，固定相为吸附剂（如

硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：和溶 (X) 当试样进入色谱柱时，溶质分子对吸附剂表面活性中心发生竞(S)剂分子争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中），可表示如下：心吸附的是SXm + nSa ====== Xa + nSm

Sa--Xm--流动相中的溶质分子；式中：固定相中的溶固定相中的溶剂分子；Xa--流动相中的溶剂分子。质分子；Sm--当吸附竞争反应达平衡时：

K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]

K讨论：[K 式中：为吸附平衡常数。] 越大，保留值越大。.

(Ion-exchange ．离子交换色谱法3 Chromatography)

IECIEC是以离子交换剂作为固定相。

是基于离子交换树脂上可电离的离子与

流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。以阴离子交换剂为例，其交换过程可

表示如下：-R4N+Cl-)=== 树脂

X-(溶剂中) + (

) 溶剂中树脂-R4N+ X-) + Cl- ((当交换达平衡时：

KX=[-R4N+

X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-] 分配系数为：

DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX

[-R4N+Cl-]/[Cl-]

]

DX与保留值的关系讨论： [凡是在溶剂中能够电离的物质通常都

可以用离子交换色谱法来进行分离。(Ion Pair ．离子对色谱法 4 Chromatography)

) 或多种离子对色谱法是将一种 (

称为对离 ( 与溶质分子电荷相反的离子

使加到流动相或固定相中，子或反离子 ) 其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。其原理可用下式表示：有机相水相 ===

X+Y- X+水相 + Y-

流动相中待分离的有水相--式中：X+

流动水相--机离子（也可是阳离子）；Y-

相中带相反电荷的离子对（如氢氧化四丁

X+Y---氢氧化十六烷基三甲铵等）；基铵、形成的离子对化合物。当达平衡时：

[Y-]水相有机相/[ X+] KXY = [X+Y-] 水相根据定义，分配系数为：

= KXY 水相有机相 DX= [X+Y-]/[ X+]

水相[Y-]]

DX与保留值的关系 [讨论：发解决了)

特别是反相离子对色谱法 (以往难以分

离的混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一.

些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药

物等分离。(Ion 离子色谱法

5 ．Chromatography)

用离子交换树脂为固定相，电解质溶

以电导检测器为通用检测器，液为流动相。

为消除流动相中强电解质背景离子对电导

检测器的干扰，设置了抑制柱。试样组分

在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交

换色谱法相同。）作固定相，R-OH以阴离

子交换树脂（

）为例。当待测阴离Br-分离阴离子（如）

进入色谱柱时，随流动相（NaOH子Br-

发生如下交换反应（洗脱反应为交换反应

的逆过程）：抑制柱上发生的反应：

R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O

R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br- 可见，通过抑制柱将洗脱液转变成了

消除了本底电导的影响；电导值很小的水，则被转化成了相应的酸试样阴离子Br-

H+Br-，可用电导法灵敏的检测。.

离子色谱法是溶液中阴离子分析的最

佳方法。也可用于阳离子分析。

(Steric 6 ．空间排阻色谱法

Exclusion Chromatography)

为固空间排阻色谱法以凝胶 (gel)

定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的

孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到

数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互

作用力的不同来进行分离，而是按分子大

小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和

溶质的流动力学体积或分子大小有关。试

样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间

隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。主要有进样系统、输高效液相色谱仪液系统、．分离系统、检测系统和数据处理系统，下面将分别叙述其各自的组成与特点。.

1．进样系统

一般采用隔膜注射进样器或高压进样

间完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。．输液系统 2该系统包括高压泵、流动相贮存器和

梯度仪三部分。高压泵的一般压强为，流速可调且稳定，当．44X107Pal．47～高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持

样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存错和梯度仪，可使流动相随固定相和样包括改变洗脱液的极性、品的性质而改变，值，或改用竞争性抑制剂或PH离子强度、变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。 3.分离系统

该系统包括色谱柱、连接管和恒温器

（需要两50cm10等。色谱柱一般长度为～根连用时，可在二者之间加一连接管），.

优质不锈钢或厚壁玻璃～5mm，由径为

2～5管或钛合金等材料制成，住装有直径为粒度的固定相（由基质和固定液构10

μm成）．固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性（如硅胶（孔、多孔性表面的硅酸基因基本已除去））和比表面积大的特点，加径可达1000?之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样），或者用化学法偶

联各种基因（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如，在后，PSA）多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。另外，固定相基质粒小，柱床极易达

到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析，基质粒. .

就越大。这也进一步度小，塔板理论数N 证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。再者，高效液相色谱的恒温器可使温

，通过改善传质速度，度从室温调到60C 缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。．检测系统 4紫外检高效液相色谱常用的检测器有

示差折光检测器和荧光检测器三种。测

器、 1（）紫外检测器

（或可见光）该检测器适用于对紫外光

有吸收性能样品的检测。其特点：使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；灵敏度高（检）；线性围宽；对温10-10g/ml测下限为度

和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗

脱的样品。2）示差折光检测器（凡

具有与流动相折光率不同的样品组

分，均可使用示差折光检测器检测。目前，糖类化合物的检测大多使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度），流动相的变低（检测下限为10-7g/ml.

化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。 3）荧光检测器（凡具有荧

光的物质，在一定条件下，

其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺

类、维生素和某些蛋白质等）的测定，其～10-12灵敏度很高（检测下限为痕量分析和梯度洗脱作品的），10-14g/ml检测均可采用。5）数据处理系统（贮存、该系统可对测试数据进行采集、

使样品的分离、显示、打印和处理等操作，制备或鉴定工作能正确开展。操作注意要点编辑本段根据需首先对流动相进行过滤，1)．一般为有机系和水系，要选择不同的滤膜，0.45um0.20um常用的孔径为和。.

对抽滤后的流动相进行超声脱气2)．

分钟。10-20仪器首先用甲醇冲正常情况下，．3)分钟，然后再进入测试用流动相10-20洗则要二次重蒸水冲(如流动相为缓冲试剂，分钟，直至色谱柱中有机相冲净洗10-20 ) 。为止20-30一般

情况下，流动相冲洗4)．

分钟后，仪器方可稳定，最重要的是仪器基线走后，方可进样测试。将其结果相比

同时进两针标样，．5)

之间后，0.98-1.02较，其结果的比值

在就可以正式进行样品的测试了。就要进行色谱样品测试结束后，6)．仪及

色谱柱的清洗和维护。如流动相为缓分

10-20冲试剂，同样也要用重蒸水清洗钟，方可用有机相进行保护，否则，有损色谱柱。关机时，先关计算机，再关液相．7) 色谱。8)．填写登记本，由负责人签字。.

注意事项编辑本段20M流动相均需色谱

纯度，水用1)．

的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。第一次做的柱子是非常脆弱的， 2)．方法，先不要让液体过柱子。所有过柱子的液体均需严格的过3)．

滤。压力不能太大，最好不要超

过． 4)150kgf/cm2 .

因为缓冲试剂遇有机溶剂，会结 5).

晶，有损色谱柱，所以，每次由有机相变流动相或流动相变有机相均需用蒸馏水清洗。.