高效液相色谱分析方法开发PPT幻灯片课件
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高效液相色谱法 PPT课件
①固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
《液相色谱方法开发》课件
化学分析
液相色谱法可用于分析有机化合物、金属离子、手性化合物等，具有 高分离度和高灵敏度的优点。
生物医药
液相色谱法在生物医药领域中应用广泛，如蛋白质、多肽、核酸等生 物大分子的分离和纯化，以及药物成分的分析和质量控制。
环境监测
液相色谱法可用于环境样品中有机污染物的检测和分析，如水体、土 壤、大气等中的有害物质。
便携式检测器
开发适用于现场快速检测的便携式检测器，满足实时监测需求。
THANKS
感谢观看
REPORTING
02
它是一种高效、高分辨率的分离 技术，广泛应用于化学、生物、 医药等领域。
液相色谱法的原理
液相色谱法的原理基于物质在固定相和流动相之间的分配平 衡，不同组分在固定相和流动相之间的分配系数不同，因此 会按照一定顺序流出色谱柱。
通过检测器检测各组分的浓度或质量，可以得到各组分的分 离效果和含量。
液相色谱法的应用领域
食品检测
液相色谱法可用于食品中添加剂、农药残留、重金属等有害物质的检 测和分析，保障食品安全。
PART 02
液相色谱方法开发流程
REPORTING
确定分析目标
明确分析目的
确定液相色谱分析的目标，例如分离 、纯化、检测或鉴定某物质。
了解样品特性
了解待分析样品的性质、组成和结构 ，以便选择合适的色谱条件和固定相 。
选择色谱柱和流动相
选择固定相
根据样品性质和分离需求选择合适的固定相，如硅胶、聚合物等。
确定流动相
选择合适的流动相，如有机溶剂、缓冲液等，以实现有效的样品分离。
优化色谱条件
调整流动相比例
通过调整流动相中各组分的比例，优化样品在固定相上的保留行为。
液相色谱法可用于分析有机化合物、金属离子、手性化合物等，具有 高分离度和高灵敏度的优点。
生物医药
液相色谱法在生物医药领域中应用广泛，如蛋白质、多肽、核酸等生 物大分子的分离和纯化，以及药物成分的分析和质量控制。
环境监测
液相色谱法可用于环境样品中有机污染物的检测和分析，如水体、土 壤、大气等中的有害物质。
便携式检测器
开发适用于现场快速检测的便携式检测器，满足实时监测需求。
THANKS
感谢观看
REPORTING
02
它是一种高效、高分辨率的分离 技术，广泛应用于化学、生物、 医药等领域。
液相色谱法的原理
液相色谱法的原理基于物质在固定相和流动相之间的分配平 衡，不同组分在固定相和流动相之间的分配系数不同，因此 会按照一定顺序流出色谱柱。
通过检测器检测各组分的浓度或质量，可以得到各组分的分 离效果和含量。
液相色谱法的应用领域
食品检测
液相色谱法可用于食品中添加剂、农药残留、重金属等有害物质的检 测和分析，保障食品安全。
PART 02
液相色谱方法开发流程
REPORTING
确定分析目标
明确分析目的
确定液相色谱分析的目标，例如分离 、纯化、检测或鉴定某物质。
了解样品特性
了解待分析样品的性质、组成和结构 ，以便选择合适的色谱条件和固定相 。
选择色谱柱和流动相
选择固定相
根据样品性质和分离需求选择合适的固定相，如硅胶、聚合物等。
确定流动相
选择合适的流动相，如有机溶剂、缓冲液等，以实现有效的样品分离。
优化色谱条件
调整流动相比例
通过调整流动相中各组分的比例，优化样品在固定相上的保留行为。
高效液相色谱分析ppt课件
liquid-solid adsorption chromatograph
三、离子交换色谱
ion-exchange chromatograph
五、离子对色谱
ion-pair chromatograph
四、离子色谱
ion chromatograph
六、排阻色谱
size- exclusion chromatograph
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，
表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，柱容量底；
2019/9/23
（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题： (1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长； (2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。
2019/9/23
1、离子色谱法原理
离子交换原理，与传统离子交 换的不同点： 采用交换容量非常低的特制离子 交换树脂为固定相； 细颗粒柱填料，高柱效；采用高 压输液泵； 低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱 来消除淋洗液的高本底电导）； 可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物； 各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。
B2 Dm DmT
柱温T 低，流动相大B相忽略
2019/9/23
速率理论(与GC对比)
• 讨论：
• 1）流动相流速对HPLC板高的影响(与GC对比)next
三、离子交换色谱
ion-exchange chromatograph
五、离子对色谱
ion-pair chromatograph
四、离子色谱
ion chromatograph
六、排阻色谱
size- exclusion chromatograph
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，
表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，柱容量底；
2019/9/23
（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题： (1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长； (2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。
2019/9/23
1、离子色谱法原理
离子交换原理，与传统离子交 换的不同点： 采用交换容量非常低的特制离子 交换树脂为固定相； 细颗粒柱填料，高柱效；采用高 压输液泵； 低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱 来消除淋洗液的高本底电导）； 可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物； 各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。
B2 Dm DmT
柱温T 低，流动相大B相忽略
2019/9/23
速率理论(与GC对比)
• 讨论：
• 1）流动相流速对HPLC板高的影响(与GC对比)next
《高效液相色谱仪》课件
《高效液相色谱仪》ppt课件
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
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流动相的调整“秘诀”
秘诀2 三倍规则
每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量， 保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是 一个聪明而又省力的办法。调整的过程中， 注意观察各个峰的分离情况。
2002-9
探索色谱新领域，默克与您共同努力！
流动相的调整“秘诀”
秘诀3 粗调转微调
当分离达到一定程度，应将有机溶剂 10%的改变量调整为5%，并据此规则 逐渐降低调整率，直至各组分的分离 情况不再改变。
HPLC 分析方法开发
分析方法开发三步骤
选择合适的色谱柱(固定相)和流动 相，得到合理的保留时间
调整选择性以及各个色谱峰的分离度
调整流速、填料粒径、色谱柱规格(长度及内径) 以获得最佳的分离
2002-9
探索色谱新领域，默克与您共同努力！
开发分析方法的规则
•合适的保留因子k (k值1-20)是获得满意分离的基础
2002-9
探索色谱新领域，默克与您共同努力！
流动相的调整“秘诀”
秘诀4 பைடு நூலகம்换流动相的组成
在第三步，我们已经基本上得到了一个合适的 保留因子，如果还有一些组分的分离情况不好， 则应考虑更换流动相的组成(如有机溶剂类型的 改变、pH值的改变或是加入离子对试剂，等等)， 或者，索性改变固定相的类型。
2002-9
甲醇/水或乙腈/水(依据个人习惯而定)
2002-9
探索色谱新领域，默克与您共同努力！
流动相的调整“秘诀”
秘诀1
试验， 调
由强到弱
一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行 这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况 整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。
2002-9
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保留因子 k=(tR-tM)/tM
•用以下“秘诀”可以使您的开发过程更加简便、快 速
2002-9
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揭秘--------选择合适的起始条件
选用通用的色谱柱
一般直接选用C18(或C8) 5um 12.5, 15, 25cm 长的色谱柱
不同的样品不同的思路
选择流动相
中性化合物无需调整流动相的pH值；而对于含有带电基团的 化合物，则需要用缓冲溶液调整流动相的pH值；有时需要 采用离子对反相色谱
探索色谱新领域，默克与您共同努力！
色谱柱的调整
最后
根据操作压力、出峰时间、分离度 来调节色谱柱的长度、粒径以及 流动相流速，
从而
获得最佳的分离
2002-9
探索色谱新领域，默克与您共同努力！