BD FACSCalibur流式细胞术标准操作规程

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BDFACSCalibur流式细胞仪简明操作规程

BDFACSCalibur流式细胞仪简明操作规程

BD FACSCalibur流式细胞仪简明操作规程一.开机程序1.把稳压器电源开关设到ON。

2.打开储液箱,把黑色开关开到TANK CHANGE位置,鞘液桶加满鞘液,倒空废液桶,把黑色开关开到Pressurize位置。

3.将FACSCalibur右侧下面的绿色按钮按开。

4.打开电脑。

二.仪器条件设定1.点击“苹果”菜单项下的CELLQuest,建立一个新视窗。

2.点击“Acquire”菜单下的“Parameter description”建立自己的文件夹,保留在屏幕上。

3.点击“Acquire”菜单下的“Connect to Cytometer”联机,这时出现“Acquisiton Control”对话框,保留在屏幕上。

4.点击“Cytometer”菜单下的“Detectors/Amps”、“Threshold”、“Compensation”三个对话框,保留在屏幕上。

5.点击“Cytometer”菜单下的“Instrument settings”,出现对话框,点击对话框中“open”,选择自己的实验条件后,点击“set”,然后点击“Done”6.加上对照样本,样品支撑架置于中位,用LO 流速RUN,点击AcqusiotionControl 对话框的Acquire,观察样品的散射光和荧光参数是否合适,调节“Detectors/Amps”对话框的相关参数,直到各个参数都合适为止。

7.点击”Acqusiotion Control”对话框的“Setup”,开始测试样品。

当所有样品分析完毕,即换上双蒸水,并将流式细胞仪置于“STANDBY”状态,以保护激光管。

三.关机程序1.测试完毕样品后,从File中选择Quit, 退出软件,点击“Special”菜单项下的“Shutdown”关机。

2.试管中加入3 ml Clean液,将样品支撑架置于旁位清洗外管,以外管吸入1ml Clean液,将样品支撑架置于中位,用HI流速RUN5分钟清洗内管,。

流式 BD 605 Calibur SOP

流式 BD 605 Calibur SOP

BD FACSCalibur流式细胞仪操作规程一、开机程序1、清空废液桶,并在废液桶中加入少量漂白粉。

打开压力阀(Vent),拧开鞘液桶盖,经漏斗加鞘液(超纯水)2L,拧紧鞘液桶盖,合上压力阀(Pressure)。

2、打开110V变压器开关,打开仪器开关,此时仪器功能控制钮的显示应是Standby,预热5-10min。

3、打开电脑,登陆Admin用户名,输入系统密码BDIS#1,执行Prime功能2次,排除流动室中的气泡。

4、用超纯水高速冲洗上样管2min。

二、CellQuest软件应用(调用个人模版)1、双击打开即将使用的个人模版文件,选择Command+B连接仪器,选择Command+1/2/3/4调用仪器参数面板,选择实验数据保存路径。

2、调入仪器质控条件:Cytometer 菜单中选择Instrument Settings,点击Open,选择目录及质控文件,点击Open,点击Set,点击Done。

3、上样,将仪器设定于Run,点击Acquire,开始获取细胞。

4、获取细胞数达到预设值后,收集自动停止,数据自动保存。

5、继续下一个样品上样。

三、CellQuest软件应用(新建方案,以FITC/PE双染实验为例)1.打开CellQuest软件,“Command+B”连接仪器,“Command+1/2/3/4”分别调出电压、阈值、补偿、仪器状态面板;2.设置仪器条件:Cytometer 菜单中选择Instrument Settings,点击Open,选择目录及质控文件(如:BD Files\ Instrument Setteings\Calib File),点击Open,点击Set,点击Done;3.画图:点击工具板中点图图标在实验文件的空白区点击,然后拖动对角线至所需大小;4.出现点图对话框,点击Plot Type(点图类型),选择Acq –> Analysis;5.画两张图,一张FSC/SSC,一张FL1(FITC)/FL2(PE),注意每画一张图都要在Plot Type中选择Acq –> Analysis;6.仪器上按RUN,插上阴性对照管,点击Acqusition Control 窗口中的Acquire(注意Setup 前需打勾,即不储存数据);7.选择FSC/SSC 为LIN(线形放大),将FSC 电压置于E-1,调节FSC 放大器增益;调节SSC电压,调节FSC 阈值,观察图的改变,直到目的细胞群可以明显和其它events 区分开并处于图中合适的位置,用Region门(R1)将其圈中;8.选中第二张FITC/PE的图,在点图对话框中点击Gate,选择G1=R1,即将此图中的信号设为只来自于R1门内的events;9.选择FITC/PE为LOG(对数放大),调节FL1(FITC)和FL2(PE)的电压,使阴性细胞群位于图的左下角(不可压线),画十字门确定好阴阳界限;10.Acquisition Browser中,Directory后更改数据保存路径,File更改样本名,P1/P2/…更改对应通道的名字,例如P3为FL1通道,可改为FITC,P4为FL2通道,可改为PE;11.在Acquire 菜单中选择 Global Acquisition & Storage,更改细胞收集数量,设置R1中收集10000个细胞12.点击Acqusition Control 窗口中的Acquire(注意Setup 前不能打勾,即储存数据);13.收集好阴性样本后,跑一管水洗30s,防止交叉污染,然后放上FITC单阳管,更改样本名为FITC,点击Acqusition Control 窗口中的Acquire(Setup 前打勾),在compensation窗口中调节PE的补偿(FL2 - X%FL1),补偿的标准为阳性群的中心点与阴性群的中心点在图上横平竖直;14.点击Acqusition Control 窗口中的Acquire(Setup 前不打勾,即储存数据),收集FITC的数据;15.跑一管水洗30s,防止交叉污染,然后放上PE单阳管,更改样本名为PE,点击Acqusition Control 窗口中的Acquire(Setup 前打勾),在compensation窗口中调节FITC的补偿(FL1 - X%FL2),补偿的标准为阳性群的中心点与阴性群的中心点在图上横平竖直,再收集PE的数据;16.补偿调节好后,开始上实验样本;17.Stats菜单中选择Quadrant Stats(象限统计),可看到统计结果。

流式细胞仪操作指南手册BD_FACSCalibur中文培训手册

流式细胞仪操作指南手册BD_FACSCalibur中文培训手册

目 录第一章流式细胞仪简介 (1)1.1 流式细胞术发展史 (1)1.2 流式细胞仪构造和工作原理 (2)1.2.1 概述 (2)1.2.2 流式细胞仪构造 (2)1.3 流式细胞仪的主要技术指标 (10)第二章 FACSCalibur 的日常操作 (12)2.1 FACSCalibur系统 (12)2.2 FACSCalibur开机程序 (15)2.3 FACSCalibur关机程序 (16)2.4 FACSCalibur的维护与保养 (17)2.4.1 FACSCalibur的每月维护 (17)2.4.2 FACSCalibur的定期维护 (18)2.5 常见故障排除 (20)第三章 FACSComp软件 (22)3.1 FACSComp简介 (22)3.1.1 FACSComp运行条件 (22)3.1.2 FACSComp的文件类型 (23)3.2 FACSComp的功能 (24)3.2.1 光电倍增管(PMT)电压的调节 (24)3.2.2 荧光补偿的调节 (24)3.2.3 灵敏度的测试 (24)3.2.4 时间延迟的校准(对于双激光,配有FL4 PMT) (25)3.2.5 HLA-B27的校准 (25)3.2.6 LeucoCOUNT (25)3.2.7 优化 (25)3.3 FACSComp的运行 (25)3.3.1 CaliBRITE Beads的准备 (25)3.3.2 软件环境的设置 (26)3.3.3 Beads的检测 (26)3.3.4 Optimization (28)第四章 FACStation 数据管理系统 (30)4.1 FACStation 数据管理系统组成 (30)4.2 FACStation文件组成 (31)4.2.1 如何建立文件夹 (31)4.2.2 FACStation文件的类型 (31)4.2.3 如何管理文件 (32)4.3 实用的Macintosh OS X功能 (34)4.3.1 菜单栏 (35)4.3.2 Dock (37)4.3.3 查找窗口 (37)4.3.4 键盘快捷键 (38)4.4 如何设置模版 (39)4.5 实验练习:如何将ModFit LT的别名添加到Dock菜单下 (40)4.6 可选性存储装置 (40)4.6.1 可选性存储装置的基本工作原则 (40)4.6.2 光驱的维护 (41)4.6.3 光盘的维护 (41)第五章 CellQuest Pro软件 (42)5.1 概述 (42)5.1.1 获取(Acquisition) (42)5.1.2 分析(Analysis) (42)5.1.3 从获取到分析(Acquisition Analysis) (42)5.2 工具栏 (42)5.3 CellQuest Pro 的文件 (43)5.3.1 FCS数据文件 (43)5.3.2 实验文件 (44)5.3.3 仪器条件文件 (44)5.3.4 统计文件 (44)5.4 CellQuest Pro 的仪器控制 (44)5.4.1 探测器 (45)5.4.2 放大器 (45)5.4.3 阈值 (46)5.4.4 补偿 (46)5.6.1 质控-运行FACSComp (48)5.6.2 优化 (50)5.6.3 调出储存的由FACSComp 生成的仪器条件 (52)5.6.4 调节FSC/SSC探测器(电压)及FSC阈值 (53)5.6.5 设置淋巴细胞Region (53)5.6.6 调节FL1、FL2、FL3的探测器(电压) (53)5.6.7 调节荧光补偿 (55)5.7 实验练习:3色/4色预获取 (55)5.7.1 设置Acquisition & Storage 窗口 (56)5.7.2 设置Parameter Description (57)5.7.3 编辑Reagent Panel (58)5.8 实验练习:数据获取 (59)5.9 储存、恢复仪器设置 (60)5.9.1 储存仪器设置 (60)5.9.2 恢复仪器设置 (60)5.10 储存实验模板文件 (60)5.11 练习:数据分析 (60)5.11.1 画Region (61)5.11.2 限定象限marker (61)5.11.3 分析四色 (63)5.11.4 批分析其余数据 (63)5.11.5 分析数据 (64)5.11.6 将分析文件以模板形式保存 (64)5.11.7 创建文具簿(stationery pad) (64)5.11.8 将统计改为电子表格 (65)5.12 Regions 和Gating(画门) (65)5.12.1 设置Region (65)5.12.2 改变Region (65)5.12.3 用Region 统计来分析数据 (66)5.12.4 门 (66)5.12.5 多色门 (66)5.12.6 组合门 (67)5.12.7 在直方图上使用组合门分析 (68)收集系统6.1.2 分选模式 (70)6.2 分选窗口 (71)6.2.1 Sort Setup (71)6.2.2 Sort Counters (72)6.3 准备收集管 (72)6.4 分选 (73)6.4.1 清洗分选管线 (73)6.4.2 准备 (73)6.4.3 收集分选前数据 (74)6.4.4 分选条件设置 (74)6.4.5 分选目的细胞 (74)6.4.6 清洗分选管路 (75)6.4.7 浓缩样本 (76)6.5 检验分选纯度 (76)6.6 分选问题讨论 (77)6.7 FACSCalibur无菌分选 (79)6.8 分选细胞浓缩系统 (80)6.8.1 系统简介 (80)6.8.2 细胞培养基嵌入物和滤膜的制备 (81)6.8.3 确定气压参数 (82)6.8.4 如何用细胞浓缩系统进行分选 (82)6.8.5 分选浓缩细胞 (84)6.8.6 从分选管路中回收细胞 (84)6.8.7 回收细胞做进一步分析 (85)6.8.8 清洗分选管路 (85)6.8.9 清洗浓缩器 (85)第七章 DNA分析 (87)7.1 概述 (87)7.2 细胞周期 (87)7.3 DNA检测的常用术语 (87)7.3.1 Coefficient of Variation(CV):变异系数 (87)7.4.1 分辨率(CV) (88)7.4.2 线性度 (88)7.4.3 碎片 (88)7.4.4 细胞双粘体 (89)7.5 DNA质量控制(DNA QC Particles) (89)7.5.1 样本制备 (89)7.5.2 上机检测 (89)7.5.3 常见错误排除 (90)7.6 用CellQuest Pro软件获取DNA 数据 (91)7.6.1 样本制备 (91)7.6.2 用CellQuest Pro软件上机获取数据 (92)7.6.3 质量控制 (95)7.7 用ModFit 软件分析DNA数据 (95)7.7.1 运用ModFit 进行自动分析 (96)7.7.2 运用ModFit 进行手动分析 (96)7.7.3 运用ModFIT进行同步化分析 (98)7.7.4 运用ModFIT 进行增殖分析 (98)第八章 HLA-B27分析 (99)8.1 检测HLA-B27的意义 (99)8.2 HLA-B27的检测方法 (99)8.2.1 传统方法 (99)8.2.2 流式细胞术 (100)8.2.3 试剂盒介绍 (100)8.2.4 实验原理 (100)8.2.5 样本的收集和准备 (101)8.2.6 流式检测 (102)8.3 质量控制 (110)附录1:组织相容性抗原和疾病的关系 (111)附录2:强直性脊柱炎——一个常见但易被忽略的疾病 (112)第九章 MultiSET软件 (113)9.1 简介 (113)软件内容9.4.1 MultiSET界面功能分区 (116)9.4.2 MultiSET命令菜单 (116)9.4.3 MultiSET实验报告 (117)9.4.4 MultiSET运行程序 (117)9.5 利用Multiset软件的Tools和Preferences (126)9.6 Control Panels (绝对计数质控) (128)9.7 MultiSET画门及Attractor方案 (128)9.8 注意事项及常见问题处理 (129)第十章练习题 (135)10.1 补偿 (135)10.2 流式简介 (135)10.3 CellQuest 获取与分析 (136)10.4 分选 (139)第一章流式细胞仪简介1.1 流式细胞术发展史纵观历史,几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同科研领域的科学家的心血。

BD-FACSCalibur 流式细胞仪-细胞周期-操作步骤

BD-FACSCalibur 流式细胞仪-细胞周期-操作步骤

BD/FACSCalibur流式细胞仪检测细胞周期操作步骤1、先给鞘液桶接超纯水。

2、把鞘液桶装上,拧紧。

3、开左边开关,从右向左依次打开,即总电源插头-交流稳定电压-插板-稳定输出电源。

(关机时从左向右关)。

4、按流式细胞仪开关。

换上新的已装超纯水的流式管。

5、将减压阀调至“run”(水缸旁边的黑色按钮)。

6、排气:将白色的手动排气阀从小头向大头移动,排气,2-3次,至无气泡。

最后停至小头。

自动排气:开始时是“低速”“standby”,调至“低速”“prime”,待排气完成会自动跳到“standby”,如此循环,到流式管内无气泡为止。

7、插电脑白色插头,打开电脑。

8、到无气泡时候调到“hign”“run”。

9、输入开机密码,打开电脑桌面上的“CELLQuest”(第四个图标)启动软件。

File→open Document→date→先找到打开自己之前的文件(cell dw 2018LSD)→Acquire→Connect to Cytometer→Acquisition面板中点击“change”修改文件名和日期,count改成1,即从第一个开始。

10、Acquire→counters→点击下面Acquisition control面板中的Acquire,看是否正常。

11、上样。

使仪器处于low run状态,样品管支架左移,上样品管后支架回位。

确认Acquisition control 窗口中Setup前需打勾(即不收集数据,用于仪器设置),点击Acquire。

仪器设置完成后,取消Setup前的“√”,点击Acquire 正式开始收集数据。

调界面操作:Cytometer → Detectors/Amps出现 Detectors/Amps 界面后,调FSC和SSC和FL2和FL2-W。

FSC调节的是门内(R1)细胞位置的左右,FSC的“Voltage”调到“E-1”,“E-1”是指个体很大细胞;“Amo Gain”的值调节门内(R1)细胞位置的宽度。

流式细胞仪操作指南手册BD_FACSCalibur中文培训手册

流式细胞仪操作指南手册BD_FACSCalibur中文培训手册

目 录第一章流式细胞仪简介 (1)1.1 流式细胞术发展史 (1)1.2 流式细胞仪构造和工作原理 (2)1.2.1 概述 (2)1.2.2 流式细胞仪构造 (2)1.3 流式细胞仪的主要技术指标 (10)第二章 FACSCalibur 的日常操作 (12)2.1 FACSCalibur系统 (12)2.2 FACSCalibur开机程序 (15)2.3 FACSCalibur关机程序 (16)2.4 FACSCalibur的维护与保养 (17)2.4.1 FACSCalibur的每月维护 (17)2.4.2 FACSCalibur的定期维护 (18)2.5 常见故障排除 (20)第三章 FACSComp软件 (22)3.1 FACSComp简介 (22)3.1.1 FACSComp运行条件 (22)3.1.2 FACSComp的文件类型 (23)3.2 FACSComp的功能 (24)3.2.1 光电倍增管(PMT)电压的调节 (24)3.2.2 荧光补偿的调节 (24)3.2.3 灵敏度的测试 (24)3.2.4 时间延迟的校准(对于双激光,配有FL4 PMT) (25)3.2.5 HLA-B27的校准 (25)3.2.6 LeucoCOUNT (25)3.2.7 优化 (25)3.3 FACSComp的运行 (25)3.3.1 CaliBRITE Beads的准备 (25)3.3.2 软件环境的设置 (26)3.3.3 Beads的检测 (26)3.3.4 Optimization (28)第四章 FACStation 数据管理系统 (30)4.1 FACStation 数据管理系统组成 (30)4.2 FACStation文件组成 (31)4.2.1 如何建立文件夹 (31)4.2.2 FACStation文件的类型 (31)4.2.3 如何管理文件 (32)4.3 实用的Macintosh OS X功能 (34)4.3.1 菜单栏 (35)4.3.2 Dock (37)4.3.3 查找窗口 (37)4.3.4 键盘快捷键 (38)4.4 如何设置模版 (39)4.5 实验练习:如何将ModFit LT的别名添加到Dock菜单下 (40)4.6 可选性存储装置 (40)4.6.1 可选性存储装置的基本工作原则 (40)4.6.2 光驱的维护 (41)4.6.3 光盘的维护 (41)第五章 CellQuest Pro软件 (42)5.1 概述 (42)5.1.1 获取(Acquisition) (42)5.1.2 分析(Analysis) (42)5.1.3 从获取到分析(Acquisition Analysis) (42)5.2 工具栏 (42)5.3 CellQuest Pro 的文件 (43)5.3.1 FCS数据文件 (43)5.3.2 实验文件 (44)5.3.3 仪器条件文件 (44)5.3.4 统计文件 (44)5.4 CellQuest Pro 的仪器控制 (44)5.4.1 探测器 (45)5.4.2 放大器 (45)5.4.3 阈值 (46)5.4.4 补偿 (46)5.6.1 质控-运行FACSComp (48)5.6.2 优化 (50)5.6.3 调出储存的由FACSComp 生成的仪器条件 (52)5.6.4 调节FSC/SSC探测器(电压)及FSC阈值 (53)5.6.5 设置淋巴细胞Region (53)5.6.6 调节FL1、FL2、FL3的探测器(电压) (53)5.6.7 调节荧光补偿 (55)5.7 实验练习:3色/4色预获取 (55)5.7.1 设置Acquisition & Storage 窗口 (56)5.7.2 设置Parameter Description (57)5.7.3 编辑Reagent Panel (58)5.8 实验练习:数据获取 (59)5.9 储存、恢复仪器设置 (60)5.9.1 储存仪器设置 (60)5.9.2 恢复仪器设置 (60)5.10 储存实验模板文件 (60)5.11 练习:数据分析 (60)5.11.1 画Region (61)5.11.2 限定象限marker (61)5.11.3 分析四色 (63)5.11.4 批分析其余数据 (63)5.11.5 分析数据 (64)5.11.6 将分析文件以模板形式保存 (64)5.11.7 创建文具簿(stationery pad) (64)5.11.8 将统计改为电子表格 (65)5.12 Regions 和Gating(画门) (65)5.12.1 设置Region (65)5.12.2 改变Region (65)5.12.3 用Region 统计来分析数据 (66)5.12.4 门 (66)5.12.5 多色门 (66)5.12.6 组合门 (67)5.12.7 在直方图上使用组合门分析 (68)收集系统6.1.2 分选模式 (70)6.2 分选窗口 (71)6.2.1 Sort Setup (71)6.2.2 Sort Counters (72)6.3 准备收集管 (72)6.4 分选 (73)6.4.1 清洗分选管线 (73)6.4.2 准备 (73)6.4.3 收集分选前数据 (74)6.4.4 分选条件设置 (74)6.4.5 分选目的细胞 (74)6.4.6 清洗分选管路 (75)6.4.7 浓缩样本 (76)6.5 检验分选纯度 (76)6.6 分选问题讨论 (77)6.7 FACSCalibur无菌分选 (79)6.8 分选细胞浓缩系统 (80)6.8.1 系统简介 (80)6.8.2 细胞培养基嵌入物和滤膜的制备 (81)6.8.3 确定气压参数 (82)6.8.4 如何用细胞浓缩系统进行分选 (82)6.8.5 分选浓缩细胞 (84)6.8.6 从分选管路中回收细胞 (84)6.8.7 回收细胞做进一步分析 (85)6.8.8 清洗分选管路 (85)6.8.9 清洗浓缩器 (85)第七章 DNA分析 (87)7.1 概述 (87)7.2 细胞周期 (87)7.3 DNA检测的常用术语 (87)7.3.1 Coefficient of Variation(CV):变异系数 (87)7.4.1 分辨率(CV) (88)7.4.2 线性度 (88)7.4.3 碎片 (88)7.4.4 细胞双粘体 (89)7.5 DNA质量控制(DNA QC Particles) (89)7.5.1 样本制备 (89)7.5.2 上机检测 (89)7.5.3 常见错误排除 (90)7.6 用CellQuest Pro软件获取DNA 数据 (91)7.6.1 样本制备 (91)7.6.2 用CellQuest Pro软件上机获取数据 (92)7.6.3 质量控制 (95)7.7 用ModFit 软件分析DNA数据 (95)7.7.1 运用ModFit 进行自动分析 (96)7.7.2 运用ModFit 进行手动分析 (96)7.7.3 运用ModFIT进行同步化分析 (98)7.7.4 运用ModFIT 进行增殖分析 (98)第八章 HLA-B27分析 (99)8.1 检测HLA-B27的意义 (99)8.2 HLA-B27的检测方法 (99)8.2.1 传统方法 (99)8.2.2 流式细胞术 (100)8.2.3 试剂盒介绍 (100)8.2.4 实验原理 (100)8.2.5 样本的收集和准备 (101)8.2.6 流式检测 (102)8.3 质量控制 (110)附录1:组织相容性抗原和疾病的关系 (111)附录2:强直性脊柱炎——一个常见但易被忽略的疾病 (112)第九章 MultiSET软件 (113)9.1 简介 (113)软件内容9.4.1 MultiSET界面功能分区 (116)9.4.2 MultiSET命令菜单 (116)9.4.3 MultiSET实验报告 (117)9.4.4 MultiSET运行程序 (117)9.5 利用Multiset软件的Tools和Preferences (126)9.6 Control Panels (绝对计数质控) (128)9.7 MultiSET画门及Attractor方案 (128)9.8 注意事项及常见问题处理 (129)第十章练习题 (135)10.1 补偿 (135)10.2 流式简介 (135)10.3 CellQuest 获取与分析 (136)10.4 分选 (139)第一章流式细胞仪简介1.1 流式细胞术发展史纵观历史,几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同科研领域的科学家的心血。

BD FACSCalibur流式细胞仪操作规范

BD FACSCalibur流式细胞仪操作规范

BD FACSCalibur流式细胞仪操作规范
1、目的
规范操作,正确使用仪器,保证检验结果准确无误。

2、适用范围
CD4+T淋巴细胞计数
3、职责
3.1科室负责人:负责监督仪器的使用和维护。

3.2操作人员:按规范操作,搞好日常维护,做好使用记录。

3.3保管人员:负责仪器定期维护,保养。

4、操作程序
4.1 检查鞘液桶,确认鞘液充满状态,盖紧黑盖,管路畅通,无扭曲4.2检查废液桶,确认废液桶充满400ml漂白剂,管路畅通,无扭曲4.3打开流式细胞仪
4.4打开电脑
4.5气压阀置于加压位置,并排除管路中气泡
4.6做prime
4.7等待机器预热5-10分钟后可开始实验。

FACSCalibur流式细胞仪中文操作手册

FACSCalibur流式细胞仪中文操作手册

5. 上樣區: 上樣區是樣本管的上樣位置。它包括三個部 分,一個是進樣針 Sample Injection Tube,將 樣本輸入流動室,還有就是支撐架 Tube Support Arm、和液滴存留系統 Droplet Containment System。 進樣針:是一根不鏽鋼管,將細胞從樣本針中吸入流動室。進樣管外有一套管, 是液滴保留系統的一部分。 支撐架:用於支撐樣本管、並負責啟動液滴存留系統。支撐架有三個位置:位於 樣本管之下的中位,樣本管左側或右側。 液滴存留系統:系統由支撐架、真空幫浦和外套 管組成。當支撐架位於左側或右側位置時,真空 幫浦就會啟動,將液體從外管吸入廢液桶內。上 樣時,須注意將支撐架位於中位,以避免過多樣 品被抽吸到廢液筒內(當支撐架位於中位,真空 幫浦停止工作)。更換樣品時,讓儀器保持 RUN 的模式,使得進樣針可以反沖;切換到 STANDBY 模式前,確保液路已沖洗徹底以免碎片沈積到流 動室中。
FACS101 Handbook Pro
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4. 從 Acquire 功能表中選擇 Connect to Cytometer,建立儀器和電腦之間通訊。此時 會出現 Browser 方框。將之移至適當位置。
5. 從工具板中點擊散點圖圖示。在實驗文件的空白區點擊,拖曳對角線至適當大小, 然後放開滑鼠。此時應可以在右方看到 Inspector:Dot Plot 對話框。
FACS101 Handbook Pro
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6. 從螢幕上方 Edit 功能表中選擇 Duplicate 功能,可複製一個同樣大小的散點圖,完 成後可將重製圖移至原圖右方。
7. 從螢幕上方 Edit 功能表中選擇 Select All 功能,文件中所有圖譜的四角會出現黑色 方塊,表示被選取。可在出現之 Inspector:2 Objects 方框中將 Plot Type 改成 Acquisition。 8. 因應實驗需求來修改所有圖譜中顯示之參數。第一圖 X 和 Y 軸參數分別設為 FSC-H 1024、SSC-H 1024;第二圖 X 和 Y 軸參數分別設為 FL1-H 1024、FL2-H 1024。 修改動作為輕擊圖譜,並在出現之 Inspector 方框依需要選擇。 FSC:細胞大小 SSC:細胞顆粒性 FL1:FITC 綠色螢光 FL2:PE 橙色螢光 FL3:PerCP 紅色螢光 儀器設定 注意:實驗數據品質,取決於最適化儀器設定。儀器設定文件不能在數據收取後再更 改,研究人員必須在第一次就使用正確的儀器設定。 儀器設定(Instrument settings),含偵測器電壓(Detector/ Amps),閾值 (Threshold),螢光補償(Compensation)等儀器條件的組合。一般而言,儀器設 定的順序為 Detector/Amps -- Threshold -- Compensation。

流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)

流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)

流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)⼀、开机程序:1.检查鞘液桶和废液桶。

确认鞘液充满状态(鞘液为鞘液桶体积的3/4位置,可以连续⼯作3个⼩时左右)、盖紧⿊盖、管道畅通、废液桶有⾜够空间容纳本批标本排弃的废液。

如果要添加鞘液,要先释放鞘液桶中⽓压。

2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关,打印机。

3.⽓压阀置于加压位置,待流式细胞仪处于STANDBY状态,做Prime,以排除管路中⽓泡。

⼆、运⾏FACSComp软件、检查仪器状况1.制备三⾊标准微球样本。

⼀般情况向1ml鞘液(或过滤PBS)中加⼊1滴质控⼩微球,也可以根据实际情况调节浓度。

2.机器预热5 min,打开FACSComp软件,选择保持路径。

选择所需校正内容,如果使⽤的微球是新⼀批产品要输⼊微球的批号。

3.在软件界⾯左侧Assay Selection选项中选择质控类型,即实验过程中是否需要清洗样品。

4.上样品,微球溶液上样之前要充分混匀。

功能键设置在“RUN”。

5.仪器⾃动检查,并做电压、补偿等设置。

6.FACSComp软件运⾏完毕,显⽰结果通过测试。

7.做Set up。

8.打印校正结果,退出FACSComp程序。

备注:在质控过程中,如果提⽰收集细胞速度慢可以提⾼细胞收集速度,但是在调节灵敏度(Sens)时,⼀定要⽤“Low”的状态上样,保证仪器灵敏度的准确。

在使⽤仪器过程中要养成好的习惯,在上样品过程中,仪器保持在“Low”“Standby”状态。

三、样品分析软件:CellQuest Pro软件,选择“联机”。

1.(2)对实验样本进⾏命名;(3)对实验通道进⾏预设(FSC,SSC,FL1-FL4)。

备注:如果界⾯被关闭,重新调出步骤:2.调出质控模板。

3.画图选择画图⼯具(⼀般选择散点图),Inspect界⾯会⾃动弹出,对⼏个常⽤选项进⾏设定:将散点图选中(⽤⿏标点击散点图边框才能够选中图形),将更改横纵坐备注:第⼀个散点图横坐标为FSC,纵坐标为SSC。

BD-FACSCalibur 流式细胞仪-细胞凋亡-操作步骤

BD-FACSCalibur 流式细胞仪-细胞凋亡-操作步骤

BD/FACSCalibur流式细胞仪检测细胞凋亡操作步骤1、先给鞘液桶接超纯水。

2、把鞘液桶装上,拧紧。

3、开左边开关,从右向左依次打开,即总电源插头-交流稳定电压-插板-稳定输出电源。

(关机时从左向右关)。

4、按流式细胞仪开关。

换上新的已装超纯水的流式管。

5、将减压阀调至“run”(水缸旁边的黑色按钮)。

6、排气:将白色的手动排气阀从小头向大头移动,排气,2-3次,至无气泡。

最后停至小头。

自动排气:开始时是“低速”“standby”,调至“低速”“prime”,待排气完成会自动跳到“standby”,如此循环,到流式管内无气泡为止。

7、插电脑白色插头,打开电脑。

8、到无气泡时候调到“hign”“run”。

9、输入开机密码,打开电脑桌面上的“CELLQuest”(第四个图标)启动软件。

File→open Document→date→先找到打开自己之前的文件(cell dw 2018LSD)→Acquire→Connect to Cytometer→Acquisition面板中点击“change”修改文件名和日期,count改成1,即从第一个开始。

10、Acquire→counters→点击下面Acquisition control面板中的Acquire,看是否正常。

11、上样。

使仪器处于low run状态,样品管支架左移,上样品管后支架回位。

确认Acquisition control 窗口中Setup前需打勾(即不收集数据,用于仪器设置),点击Acquire。

仪器设置完成后,取消Setup前的“√”,点击Acquire 正式开始收集数据。

调界面操作:Cytometer →Detectors/Amps出现Detectors/Amps界面后,调FSC和SSC和FL1和FL3。

FSC调节的是门内细胞位置的左右,FSC调到E-1;SSC 调节的是门内细胞位置的上下,SSC调Voltage值,Amp Gain不动。

BD-FACSCalibur流式细胞仪操作手册

BD-FACSCalibur流式细胞仪操作手册

BD FACSCalibur流式细胞仪一、BD FACSCalibur基本结构1.1仪器本体:1. 电源开关:在BD FACSCalibur仪器右侧下方,先启动仪器本体,再打开计算机。

2. 光学系统:BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射以BD FACSCalibur 基本型为例➢FSC Diode 只收488 nm波长散射光➢SSC PMT 只收488 nm波长散射光➢FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围(波长515-545 nm)➢FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围(波长564-606 nm)➢FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围(波长 >650 nm)3. 仪器面板:仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。

流速控制:LO:样品流速:12 l /minMED:样品流速:35 l /minHI: 样品流速:60 l /min功能控制:•RUN:此时上样管加压,使细胞悬液从进样针进入流动室。

(正常显示绿色;黄色时表示仪器不正常,请检查是否失压。

)•STANDBY:无样品或暖机时之正常位置,此时鞘液停止流动,雷射功率自动降低。

•PRIME:去除流动室中的气泡,流动室施以反向压力,将液流从流动室冲入样品管,持续一定时间后,以鞘液回注满流动室。

PRIME 结束,仪器恢复STANDBY状态。

4. 储液箱抽屉:在主机左下方之储液箱抽屉。

可向前拉开,内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter,及空气滤网 Air filter。

请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。

•鞘液筒:位于抽屉左侧,容积4升。

装八分满鞘液筒,仪器可以运行大约 3小时。

筒上装有液面感应器,鞘液用完时,仪器软件上会有显示。

鞘液筒盖上有金属环扣,保证鞘液筒密闭。

•废液筒:位于抽屉右侧,容积4升。

筒上装有液面感应器,废液盛满时,仪器软件上会有显示。

流式细胞仪操作指南手册BD_FACSCalibur中文培训手册

流式细胞仪操作指南手册BD_FACSCalibur中文培训手册

目 录第一章流式细胞仪简介 (1)1.1 流式细胞术发展史 (1)1.2 流式细胞仪构造和工作原理 (2)1.2.1 概述 (2)1.2.2 流式细胞仪构造 (2)1.3 流式细胞仪的主要技术指标 (10)第二章 FACSCalibur 的日常操作 (12)2.1 FACSCalibur系统 (12)2.2 FACSCalibur开机程序 (15)2.3 FACSCalibur关机程序 (16)2.4 FACSCalibur的维护与保养 (17)2.4.1 FACSCalibur的每月维护 (17)2.4.2 FACSCalibur的定期维护 (18)2.5 常见故障排除 (20)第三章 FACSComp软件 (22)3.1 FACSComp简介 (22)3.1.1 FACSComp运行条件 (22)3.1.2 FACSComp的文件类型 (23)3.2 FACSComp的功能 (24)3.2.1 光电倍增管(PMT)电压的调节 (24)3.2.2 荧光补偿的调节 (24)3.2.3 灵敏度的测试 (24)3.2.4 时间延迟的校准(对于双激光,配有FL4 PMT) (25)3.2.5 HLA-B27的校准 (25)3.2.6 LeucoCOUNT (25)3.2.7 优化 (25)3.3 FACSComp的运行 (25)3.3.1 CaliBRITE Beads的准备 (25)3.3.2 软件环境的设置 (26)3.3.3 Beads的检测 (26)3.3.4 Optimization (28)第四章 FACStation 数据管理系统 (30)4.1 FACStation 数据管理系统组成 (30)4.2 FACStation文件组成 (31)4.2.1 如何建立文件夹 (31)4.2.2 FACStation文件的类型 (31)4.2.3 如何管理文件 (32)4.3 实用的Macintosh OS X功能 (34)4.3.1 菜单栏 (35)4.3.2 Dock (37)4.3.3 查找窗口 (37)4.3.4 键盘快捷键 (38)4.4 如何设置模版 (39)4.5 实验练习:如何将ModFit LT的别名添加到Dock菜单下 (40)4.6 可选性存储装置 (40)4.6.1 可选性存储装置的基本工作原则 (40)4.6.2 光驱的维护 (41)4.6.3 光盘的维护 (41)第五章 CellQuest Pro软件 (42)5.1 概述 (42)5.1.1 获取(Acquisition) (42)5.1.2 分析(Analysis) (42)5.1.3 从获取到分析(Acquisition Analysis) (42)5.2 工具栏 (42)5.3 CellQuest Pro 的文件 (43)5.3.1 FCS数据文件 (43)5.3.2 实验文件 (44)5.3.3 仪器条件文件 (44)5.3.4 统计文件 (44)5.4 CellQuest Pro 的仪器控制 (44)5.4.1 探测器 (45)5.4.2 放大器 (45)5.4.3 阈值 (46)5.4.4 补偿 (46)5.6.1 质控-运行FACSComp (48)5.6.2 优化 (50)5.6.3 调出储存的由FACSComp 生成的仪器条件 (52)5.6.4 调节FSC/SSC探测器(电压)及FSC阈值 (53)5.6.5 设置淋巴细胞Region (53)5.6.6 调节FL1、FL2、FL3的探测器(电压) (53)5.6.7 调节荧光补偿 (55)5.7 实验练习:3色/4色预获取 (55)5.7.1 设置Acquisition & Storage 窗口 (56)5.7.2 设置Parameter Description (57)5.7.3 编辑Reagent Panel (58)5.8 实验练习:数据获取 (59)5.9 储存、恢复仪器设置 (60)5.9.1 储存仪器设置 (60)5.9.2 恢复仪器设置 (60)5.10 储存实验模板文件 (60)5.11 练习:数据分析 (60)5.11.1 画Region (61)5.11.2 限定象限marker (61)5.11.3 分析四色 (63)5.11.4 批分析其余数据 (63)5.11.5 分析数据 (64)5.11.6 将分析文件以模板形式保存 (64)5.11.7 创建文具簿(stationery pad) (64)5.11.8 将统计改为电子表格 (65)5.12 Regions 和Gating(画门) (65)5.12.1 设置Region (65)5.12.2 改变Region (65)5.12.3 用Region 统计来分析数据 (66)5.12.4 门 (66)5.12.5 多色门 (66)5.12.6 组合门 (67)5.12.7 在直方图上使用组合门分析 (68)收集系统6.1.2 分选模式 (70)6.2 分选窗口 (71)6.2.1 Sort Setup (71)6.2.2 Sort Counters (72)6.3 准备收集管 (72)6.4 分选 (73)6.4.1 清洗分选管线 (73)6.4.2 准备 (73)6.4.3 收集分选前数据 (74)6.4.4 分选条件设置 (74)6.4.5 分选目的细胞 (74)6.4.6 清洗分选管路 (75)6.4.7 浓缩样本 (76)6.5 检验分选纯度 (76)6.6 分选问题讨论 (77)6.7 FACSCalibur无菌分选 (79)6.8 分选细胞浓缩系统 (80)6.8.1 系统简介 (80)6.8.2 细胞培养基嵌入物和滤膜的制备 (81)6.8.3 确定气压参数 (82)6.8.4 如何用细胞浓缩系统进行分选 (82)6.8.5 分选浓缩细胞 (84)6.8.6 从分选管路中回收细胞 (84)6.8.7 回收细胞做进一步分析 (85)6.8.8 清洗分选管路 (85)6.8.9 清洗浓缩器 (85)第七章 DNA分析 (87)7.1 概述 (87)7.2 细胞周期 (87)7.3 DNA检测的常用术语 (87)7.3.1 Coefficient of Variation(CV):变异系数 (87)7.4.1 分辨率(CV) (88)7.4.2 线性度 (88)7.4.3 碎片 (88)7.4.4 细胞双粘体 (89)7.5 DNA质量控制(DNA QC Particles) (89)7.5.1 样本制备 (89)7.5.2 上机检测 (89)7.5.3 常见错误排除 (90)7.6 用CellQuest Pro软件获取DNA 数据 (91)7.6.1 样本制备 (91)7.6.2 用CellQuest Pro软件上机获取数据 (92)7.6.3 质量控制 (95)7.7 用ModFit 软件分析DNA数据 (95)7.7.1 运用ModFit 进行自动分析 (96)7.7.2 运用ModFit 进行手动分析 (96)7.7.3 运用ModFIT进行同步化分析 (98)7.7.4 运用ModFIT 进行增殖分析 (98)第八章 HLA-B27分析 (99)8.1 检测HLA-B27的意义 (99)8.2 HLA-B27的检测方法 (99)8.2.1 传统方法 (99)8.2.2 流式细胞术 (100)8.2.3 试剂盒介绍 (100)8.2.4 实验原理 (100)8.2.5 样本的收集和准备 (101)8.2.6 流式检测 (102)8.3 质量控制 (110)附录1:组织相容性抗原和疾病的关系 (111)附录2:强直性脊柱炎——一个常见但易被忽略的疾病 (112)第九章 MultiSET软件 (113)9.1 简介 (113)软件内容9.4.1 MultiSET界面功能分区 (116)9.4.2 MultiSET命令菜单 (116)9.4.3 MultiSET实验报告 (117)9.4.4 MultiSET运行程序 (117)9.5 利用Multiset软件的Tools和Preferences (126)9.6 Control Panels (绝对计数质控) (128)9.7 MultiSET画门及Attractor方案 (128)9.8 注意事项及常见问题处理 (129)第十章练习题 (135)10.1 补偿 (135)10.2 流式简介 (135)10.3 CellQuest 获取与分析 (136)10.4 分选 (139)第一章流式细胞仪简介1.1 流式细胞术发展史纵观历史,几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同科研领域的科学家的心血。

BD FACSCalibur操作规程

BD FACSCalibur操作规程

BD FACSCalibur 操作规程(一)开机1、打开主机后侧接线板开关,然后依次打开交流稳压电源、110V输出电源、主机、电脑电源。

(分析数据时,不需打开流式细胞仪)2、执行Prime功能2次。

(二)流式检测1、点击打开CellQuest软件,在Acquire菜单中选择Connect to Cytometer进行电脑和仪器联机,在弹出的Acquisition Control对话框中选择文件保存路径、检测信号及样品的相关参数信息。

2、绘图工具栏中,依需要选择所需图形(Dot Plots:散点图;Histogram:直方图),调整X轴、Y轴参数,在对话框中选择Acquire→Acquisition作为图形资料来源。

3、点击Cytometer菜单下Detectors/Amps (调各检测通道的电压和模式)、Compensation(调不同荧光信号间的补偿)、Status (由Not Ready变为Standby即可上样检测,一般10~15min左右)。

4、上样。

流式细胞仪设定为RUN,点击Acquisition Control的Acquire(调条件时前面打√,收样本时√去掉),上阴性管,调电压;上单染管,调补偿;上样品管,收集数据。

5、设门。

从绘图工具栏中选择合适的图形设门,门之间的逻辑关系在Gates>Gate List设定,在Dot Plots / Histogram对话框中Gate进行赋值。

6、数据。

点中要分析的图片,选择Stats菜单下相应统计选项;若需要编辑统计内容,从Stats菜单中选择Edit…进行编辑。

7、样品分析间隙,换上ddH2O,并将流式细胞仪置于STANDBY状态,以保护激光管。

(三)HTS 96/384孔板上样1、移开HTS保护盖,将模式转到HTS模式,按右图接好管路,打开HTS右侧电源开关;2、点击打开HTS软件,进入Layout界面:Mode选择High Throughput(2-10ul)或Standard(2-200ul),Plate选择板类型;点中阴性孔、单染孔或样品孔,选择Setup Standard或Sample,对Acquisition Document、Analysis Document、Instrument Settings及其他一些参数进行定义(注:HTS软件会自动调用CellQuest,Acquisition Document需提前绘制);3、Set Up界面:进行阴性管、单染管检测,对预设的Instrument Settings进行微调;4、Acquire界面:点击Acquire获取数据;5、Analyze界面:数据的整理和分析。

BD FACSCalibur 流式细胞仪 操作规程

BD FACSCalibur 流式细胞仪 操作规程

FACSCalibur流式细胞仪简明操作规程1.开机程序开启稳压电源、变压器,打开流式细胞仪电源;开启计算机,桌面不显示跳动的提示,认为细胞仪和电脑连接成功;确认鞘液筒有2/3满,废液桶近似空的,桶盖是旋紧的(所有管线及管路装置连接通畅,无扭曲、折叠);将气压阀方向调在加压位置,用手感觉鞘液桶在慢慢鼓起;PRIME排除液流过滤器中的气泡;HIGH RUN 鞘液或超纯水两分钟;开始分析样品。

2.上机操作确保流式细胞仪处于“Run,Hi”状态;上样前,确认样本细胞是否已过滤,去除检品中的细胞团块,以防止管路堵塞;将样本的试剂管在旋涡器上正立混匀5秒;支持架置于旁位,上样,支持架置于正位;点击软件右下方“Acquire”;分析完成后,换样,重复操作。

3.关机程序清洁加样针的外管和内管,防止加样针堵塞或有染料残留;取3ml浓度为0.5%-1%的次氯酸钠(洗液)上样,将样品支持架置于旁位,以外管吸去约1ml,将样品支持架置于中位,再HIGH RUN 10分钟(内管吸去1-2ml);取 3ml ddH2O 于上样针,将样品支持架置于旁位,用外管吸取1-2ml液体将样品支持架置于正位,按RUN HI,时间需长于5分钟,如8-10分钟;最后留约 1ml ddH2O 在试管中,置于上样位;按Standby以冷却激光,五分钟后关闭细胞仪(务必等五分钟后再FACSCalibur 电源,以延长激光光源寿命。

);倒掉废液,将气压阀放在减压位置,将鞘流液筒充填至2/3满;确认退出计算机中所有BD应用软件,所有数据已储存备份,关程序,关闭苹果计算机;填写使用记录。

4.日常维护方法标本检测结束后都应清洗机器。

关闭仪器之前,必须清洁进样针,及进样针与套管间的区域。

做好月保养工作,进行系统管道清洗,每月至少一次。

每月至少一次质控,通过标准微球来监测仪器的工作状态定期对设备的各种功能进行检查。

将清洗以及检查、维护记录在案。

使用注意事项该仪器仅限仪器管理人员和通过仪器操作培训的人员操作;样品务必过滤后上机;使用完毕后及时清洗管路。

BDFACSCalibur流式细胞术标准操作规程

BDFACSCalibur流式细胞术标准操作规程

BD FACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序目的:规范BDFACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序,正确使用设备,保证实验顺利进行、操作人员人身安全和设备安全。

适用范围:本规程适用于BD FACSCalibur流式细胞仪的使用操作。

责任者:操作人员:负责按照本规程操作仪器设备,对仪器进行日常维护,并作使用记录。

保管人员:负责监管仪器操作是否符合规程,并对仪器进行定期维护、保养。

科室负责人:负责对仪器设备的综合管理。

内容:1.每日开机程序1.1在气压阀减压的状态下检查鞘液桶,确认:1.1.1鞘液充满状态,约3L1.1.2盖紧盖子1.1.3安上金属挡板1.1.4管路畅通,无扭曲1.2.检查废液桶,确认:1.2.1废液桶充满400ml漂白剂1.2.2管路畅通,无扭曲1.3打开流式细胞仪。

1.4打开电脑。

1.5气压阀置于加压位置,并排除管路中气泡。

1.6做Prime。

1.7等待机器预热5~10分钟后可开始试验。

2.每日关机程序2.1用3mlFACSCIean洗液加入样品管中上样,将样品支撑架置于旁位,以外套管吸入1ml。

2.2将样品支撑架置于中位,以HI RUN运行10分钟,使内管吸入约1ml。

2.3将样品管换成蒸馏水重复1-2步。

2.4放置盛有1ml蒸馏水的试管于样品支撑架上。

2.5选择Standby模式10分钟,将激光冷却后可关掉主机。

2.6退出所有应用软件,关闭电脑。

2.7将流式细胞仪的压力阀置于减压状态。

3.每月维护程序3.1将FACSClean洗液1~2L装入鞘液桶。

3.2旁路鞘液过滤器(过滤器上的快速接口从SANLINEFILTER端断开,将鞘液白色管路液路取下联到SANLINE FILTER 端口),以防伤害。

3.3将盛有3ml FACSClean 洗液的试管置于样品支架上,以HI RUN 30 分钟。

3.4将鞘液和样品换成蒸馏水重复步骤3,以HI RUN 60 分钟。

3.5将鞘液桶装满鞘液,恢复过滤器。

流式细胞仪操作规程

流式细胞仪操作规程

流式细胞仪操作规程一、开机程序1、检查稳压器电源,打开电源,稳定 5 分钟。

2、打开储液箱,倒掉废液, 并在废液桶中加入 400ml 漂白水原液。

打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至 4/5 满(一般可用超纯水,特殊情况需要用PBS),合上压力阀。

确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置。

3、将 FACSCalibur 开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是 STANDBY,预热 5-10 分钟。

排出过滤器内的气泡。

4、如果需要打印,打开打印机电源。

5、打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。

6、执行仪器 PRIME 功能一次,以排除 Flow cell 中的气泡。

7、分析样品时,先用 FACAFlow 或 PBS 进行 HIGH RUN 约 2 分钟,以去除可能的管路残片。

二.预设获取模式文件(Acquisition Template Files)1、从苹果标志中选择 CELLQuest,建一个新视窗,可利用此视窗编辑一个获取模式文件。

2、选取屏幕左列绘图工具中的 Dot plot,绘出一个或多个 Dot Plots(点图)。

从 Dot Plot 对话框中选取 Acquisition 作为图形资料来源,并确定适当的 x 轴和 y 轴参数。

3、选取屏幕左列绘图工具中的 Histogram,同上法可绘出 Histogram(直方图)。

4、将此视窗命名后储存于 FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder\EXP 文件夹中(也可以自己取名,但每个实验人员只能建立一个文件夹),下次进行相同实验时可直接调用。

三.用 CELLQuest 进行仪器的设定和调整1、从苹果画面中选取 CELLQuest,进入 CELLQuest 后在 File 指令栏中打开合适的获取模式文件。

2、从屏幕上方 Acquire 指令栏中,选取 Connect to Cytometer(快捷键:+B)进行电脑和仪器的连机。

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BD FACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序目的:规范BD FACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序,正确使用设备,保证实验顺利进行、操作人员人身安全和设备安全。

适用范围:本规程适用于BD FACSCalibur流式细胞仪的使用操作。

责任者:操作人员:负责按照本规程操作仪器设备,对仪器进行日常维护,并作使用记录。

保管人员:负责监管仪器操作是否符合规程,并对仪器进行定期维护、保养。

科室负责人:负责对仪器设备的综合管理。

内容:1. 每日开机程序1.1 在气压阀减压的状态下检查鞘液桶,确认:1.1.1鞘液充满状态,约3L1.1.2盖紧盖子1.1.3安上金属挡板1.1.4管路畅通,无扭曲1.2. 检查废液桶,确认:1.2.1废液桶充满400ml漂白剂1.2.2管路畅通,无扭曲1.3打开流式细胞仪。

1.4打开电脑。

1.5气压阀置于加压位置,并排除管路中气泡。

1.6做Prime。

1.7等待机器预热5~10分钟后可开始试验。

2. 每日关机程序2.1 用3mlFACSClean洗液加入样品管中上样,将样品支撑架置于旁位,以外套管吸入1ml。

2.2 将样品支撑架置于中位,以HI RUN运行10分钟,使内管吸入约1ml。

2.3 将样品管换成蒸馏水重复1-2步。

2.4 放置盛有1ml蒸馏水的试管于样品支撑架上。

2.5 选择Standby模式10分钟,将激光冷却后可关掉主机。

2.6 退出所有应用软件,关闭电脑。

2.7 将流式细胞仪的压力阀置于减压状态。

3. 每月维护程序3.1 将FACSClean洗液1~2L装入鞘液桶。

3.2 旁路鞘液过滤器(过滤器上的快速接口从SANLINE FILTER端断开,将鞘液白色管路液路取下联到SANLINE FILTER端口),以防伤害。

3.3 将盛有3ml FACSClean洗液的试管置于样品支架上,以HI RUN 30分钟。

3.4 将鞘液和样品换成蒸馏水重复步骤3,以 HI RUN 60分钟。

3.5 将鞘液桶装满鞘液,恢复过滤器。

3.6 以HI RUN 10-20分钟。

3.7 在测定正式样品之前实施每日开机程序。

4. FACScomp 自动质控操作4.1 试剂准备4.1.1三色试剂的校正(Cat No:340486)4.1.1.1取四色试剂盒中的Unlabeled试剂,充分混匀,加一滴到装有1ml鞘液的试管中,混匀,标记为unlabeled。

4.1.1.2取FITC、PE、PerCP、unlabeled试剂,充分混匀,各加一滴到第二支装有2ml的鞘液的试管中,混匀,标记为mixed。

4.1.1.3上机进行仪器的校准。

4.1.2或四色试剂的校正(Cat No:340486;Cat No:340487)4.1.2.1取试剂盒中的unlabeled试剂和APC试剂各一滴加入到第一支装有1ml鞘液的试管中,混匀。

4.1.2.2取5种试剂(FITC、PE、PerCP、APC、Unlabeled)各一滴加入第二支装有2ml鞘液的试管中,混匀。

4.1.2.3上级进行仪器的校准。

4.2 Calibrite beads FACScomp上机操作的具体步骤4.2.1执行FACSalibur开机程序;4.2.2执行FACScomp软件;4.2.3在运行“Sign in”窗口中输入操作者姓名、单位、领导姓名等相关信息,计算机将保存这些信息;单机“Acceppt”;4.2.4进入”Set Up窗口,先看最左侧的Assay selection选项,在里面选中Lyse/Wash或Lyse/No Wash;4.2.5在Calibrite Beads Lot IDS中,根据每种颜色的beads所对应的Lot ids,输入编号,次编号在Calibrite Beads试剂盒内,打开新买的试剂盒,里面有一张橙色胶纸,取出贴在试剂盒的背面,标题是Calibrite Beads TM3Batch NO,选择FACS Flow Sheath下的编号(右侧的编号);如做四色校正,同样方法输入Calibrite Beads TM APC的IDS。

4.2.6在右侧的保存选项中文件会自动保存,路径Facstation\BD file\FACSComp\DDMMYY,还可以单击“Location”改变保存路径;4.2.7其他的不要改动,直接单击“run”出现PMT视窗,然后准备好上样管;4.2.8上第一管后单击start,仪器开始自动调节PMT。

完成后仪器会在窗口底部出现一行提示:“PMTs set Successfully”,这时软件会暂停5秒,然后自动进入下一个调节窗口(Comp 窗口);如果是四色微球调试,仪器还会对激光的延迟进行测试,直到仪器电脑屏幕出现提示:“Time Delay Calibration was successful”,然后才会同样自动进入下一个调节窗口(Comp窗口);4.2.9上第二管,单击start,仪器开始自动调节补偿并进行灵敏度测试。

完成后仪器会给出提示,最后软件给出一个Summary Report。

检查报告中的“Result”是否都PASS,如果有没有PASS,坚持原因。

(1)是否试剂过期(2)两个试管中的液体和鞘液桶中的是否相同(3)鞘液是否合格(4)日常维护是否充分适当(5)联系BD人员4.2.10打印报告,退出FACScomp软件;4.2.11计算机会自动把FACScomp测试结果保存在Calib File或Calib File .LNW(免洗试验)中,运行其他程序,调用这些结果就可以进行样本的检测。

注意事项:1、第一管的速率不能低于400个/秒(run high),少于时可以补一滴Unlabeled。

2、两个试管中的鞘液必须和鞘液桶中的是同一种液体。

5.FACScomp校正HLA-B27的操作说明5.1试剂的准备:取HLA-B27试剂盒的HLA-B27 calibration beads (Cat No:340183)试剂,混匀,加两滴到装有1ml鞘液的试管中,混匀,待测。

5.2 FACScomp上机检测HLA-B27的具体步骤5.2.1执行FACSCalibur开机程序;5.2.2运行FACScomp软件;5.2.3在出现“Sign in”窗口中输入操作者姓名、单位、领导姓名等相关信息,计算机将保存这些信息;单机“Accept”;5.2.4进入“Set up”窗口,先看最左侧的Assay selection选项,选择HLA-B27 Assay,在进行HLA-B27 Assay之前,必须一次性的通过Lyse/Wash Assay校正;5.2.5在右侧框中输入正确的HLA-B27 Lot No值、Suffix值和Beads Lot No值。

这些参数分别决定了FL1 PMT的标准和decision maker的位置。

对于结果至关重要,不可弄错;5.2.6在右侧的保存选项中文件会自动保存,路径Facstation\BD file\FACSComp\日期,还可以单击“Location”改变文件保存路径;其他的不需要改动,直接单击“run”出现PMT视窗,然后准备好上样;“PMTs 5.2.7放上Beads管后单击start,仪器开始自动调节PMT。

完成后仪器会在底部出现一行提示:set successfully”这时软件会暂停5秒,调试后的结果会自动保存在Calib File.B27中,并生成summary Report;5.2.8退出FACScomp软件,然后进入HLA-B27软件进行检测。

6.MultiSET四色免洗淋巴细胞亚群的绝对计数6.1实验原理:用已知总数的荧光微球Beads做标准内参,加入血中,再加入荧光抗体,应用流式细胞仪中的获取和分析软件,就可以得出血中CD3、CD4、CD8、B、NK细胞的绝对数。

细胞(/ul)=(细胞获取数×Beads总量)/(Beads获取数样本量)6.2主要试剂:6.2.1抗体:CD3/CD8/CD45/CD4;CD3/CD16+56/CD45/CD19四色荧光抗体。

6.2.2Trucount管(内含数量已知的Beads)。

6.2.3FACS Lysing Solution(溶血素)(10×,使用前用蒸馏水稀释成1×)6.3实验步骤:6.3.1取2支TruCount管,顺序编号A和B;6.3.2用反向加样法在Tube中加入50ul充分混匀的抗凝全血;注意:血不要碰到试管底部的微球(Beads)。

6.3.3取20ulCD3/CD8/CD45/CD4抗体加入到A管中;取20ulCD3/CD16+56/CD45/CD19抗体加入到B 管中。

注意:不要碰到血。

涡旋混匀,室温避光放置15-20min;6.3.4加入450ul 1×FACS溶血素,充分混匀,室温避光放置15min;6.3.5 24小时内上机,用MultiSET软件获取15000个细胞进行检测,上机前应充分混匀。

6.4注意事项:6.4.1样本使用EDTA抗凝全血,室温放置,24小时内处理,处理前充分混匀。

6.4.2取血时要采用反向加样法,即加样枪吸取血样时,打到第二挡,放时打到第一档,保证血量的准确,减少误差。

6.4.3染色和溶血步骤应在室温避光进行,并充分混匀,过程中尽量防止血样的飞溅,以免血样留在管壁上。

6.4.4本实验为免洗试剂,操作简单,减少细胞的丢失提高工作效率和计数精确度。

6.4.5TruCOUNT管2-25℃保存,从冰箱取出后,应恢复室温再打开封条,保证TruCOUNT管包装袋密闭,袋内干燥剂变成粉红色时,TruCOUNT管应弃去不要7.MultiSET软件收获分析的具体操作7.1执行FACSCalibur开机程序,进入MuliTSET软件。

7.2在出现“sign in”窗口中输入操作者姓名、单位、负责人姓名等信息,计算机将保存这些信息;相关信息,单机“Accept”。

7.3进入“set up”窗口:7.3.1在“Data Source”对话框中选择“From Cytometer:Acquisition and Analysis”;7.3.2在“Automatic Saving Options”中选者“Data File”、“laboratory Report”、“Physician Report”,软甲会自动生成并保存报告文件,文件的默认路径Faacstation\BD file\Multiset\DDYYMM 文件夹;7.4在“View Report”中选择“Until ‘Next’Button Pressed”.7.5然后单击“Accept”,进入“FACSComp”窗口,单击“skip FACSComp”(四色仪器调整FACSComp 在检测前单独完成,见FACSComp操作部分)。

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